一株腐霉菌株及其應用
【專利摘要】本發明涉及一株腐霉菌株及其應用，屬生物農藥領域。腐霉(Pythium spp)菌株于2016年4月11日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號：CGMCC NO.12238。保藏單位地址：北京市朝陽區北晨西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。腐霉(Pythium spp)菌株在制備抑制根結線蟲卵粒的孵化生物藥物中的應用。腐霉(Pythium spp)菌株在制備毒殺根結線蟲二齡幼蟲的生物藥物中的應用。本發明的優點在于：腐霉真菌(Pythium spp)能夠明顯抑制根結線蟲卵粒的孵化；對農產品、人畜和環境均無污染；能夠用于制備寄生或毒殺根結線蟲二齡幼蟲的生物農藥。CGMCC No. 1223820160411
【專利說明】
-株腐霉菌株及其應用
技術領域
[0001 ]本發明設及一株腐霉菌株及其應用，屬于農業生物防治領域。
【背景技術】
[0002] 植物寄生線蟲是一種世界范圍內難W防治的±傳性病害，其寄主廣泛，適應環境 能力強。在常見的植物侵染性病害中，植物寄生線蟲引起的危害已超過細菌和病毒，成為了 僅次于真菌的第二大植物侵染性病害。據統計，每年植物寄生線蟲給農業造成的直接經濟 損失高達約1570億美元，其中根結線蟲引起的經濟損失最為嚴重。在常見的四種根結線蟲 屬（南方根結線蟲（M. incognita)、花生根結線蟲（M.arenaria)、爪哇根結線蟲 (M.javanica)和北方根結線蟲(M.hapla))內，W南方根結線蟲發生最為普遍，對農作物引 起的危害也最為嚴重。
[0003] 目前，根結線蟲的防治主要依靠化學殺蟲劑、輪作防病和抗線蟲品種培育。其中， 化學殺蟲劑能夠起到立竿見影的殺蟲效果，然而，其在毒殺線蟲的同時也會給人類健康和 環境帶來負面影響。在歐美等西方發達國家，已有不少化學殺蟲劑(如:漠甲燒及二漠甲燒） 被相繼禁止使用。作為傳統的線蟲防治，輪作防病對寄主范圍較窄的線蟲確實有一定的防 控效果，然而，對于具有廣泛寄主根結線蟲屬來說，其防效甚微。抗線蟲品種培育是一項高 效、經濟且無公害的線蟲防治措施，但其面臨著遠緣雜交、性不親和、雜交和分離世代長W 及抗源僵乏和抗源基因表達不穩定表達等問題，使該項工作開展比較困難且耗時較長。根 結線蟲的生物防治越來越受到人們的重視。
[0004] 在自然界±壤中，廣泛分布著線蟲的天敵，主要有食真菌、細菌、病毒、立克氏體、 放線菌和原生動物等。其中研究最多的是食真菌，根據其對線蟲的作用機制的不同，李天飛 等(2000)將食線蟲真菌分為捕食線蟲真菌、內寄生線蟲真菌、產毒真菌和機會真菌等4類。 捕食線蟲真菌是指W營養菌絲特化形成的捕食器官捕捉線蟲的一類菌物。內寄生線蟲真菌 是指通過特殊的抱子寄生游離活動線蟲的一類菌物。機會真菌是指專性或兼性定殖于植物 寄生固著性線蟲的卵、雌蟲、胞囊等或寄生游離線蟲卵的一類菌物，包括大量的±壤習居性 菌物。
[0005] 基于W上的殺線蟲真菌分類基礎，本研究從番茄±壤中純化分離到一株腐霉 (PytMum SPP)菌株，關于其對線蟲卵解化有高效抑制并有明顯毒殺幼蟲的毒殺效果和相 關機理尚未見報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于為開發高效生物農藥，而提供一株腐霉菌株及其應用。
[0007] 本發明分離純化到一株能夠高效抑制線蟲卵解化和并能明顯寄生幼蟲的腐霉 (P^Mum spp)。^基因組為模板，用真菌口S通用引物（ITS4-5)克隆出88化P的片段(見文 件"腐霉核酸序列ITS4-5,885bp)。該菌株已于2016年4月11日保藏在中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中屯、;保藏單位地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號中國科學院 微生物研究所;保藏號:CGMCC No.12238。
[000引本發明的真菌通過分離純化培養后，再經過常規的生測測定對線蟲的寄生效果， 具體步驟如下下為重量百分比）：
[0009] 1、腐霉真菌巧thi皿SPP的分離、純化和培養
[0010] CMA平板培養基配方為：玉米粉40.0 g，瓊脂20g，1L蒸饋水，抑自然。將帶有腐霉菌 的根結線蟲卵塊接種到CMA平板中，25°C下培養一周。之后，用無菌接種針挑取單抱子接種 于CMAS角瓶(400mlS角瓶，100ml CMA)，并繼續培養一周。
[00川 2、獲取大量抱子
[0012]向CMAS角瓶中加入20ml無菌蒸饋水和100粒無菌玻璃珠(直徑：2mm)，搖晃立角瓶 5min。將=角瓶中的蒸饋水和玻璃珠倒入鋪有6層擦鏡紙的漏斗中，離屯、收集透擦鏡紙上的 抱子。
[0013] 3、測定對線蟲卵的寄生效果
[0014] 將分離純化的寄生真菌接種到含有100ml CMA培養基的400mlS角瓶中，CMA培養 基配方為:玉米粉40.0 g，瓊脂20g，1L蒸饋水，抑自然。28 °C培養8天，獲得大量抱子。
[001引向CMAS角瓶中加入20ml無菌蒸饋水和100粒無菌玻璃珠(直徑：2mm)，劇烈搖晃立 角瓶5min。將S角瓶中的蒸饋水和玻璃珠倒入鋪有6層擦鏡紙的漏斗中，離屯、收集透擦鏡紙 上的抱子。將收集到的抱子用無菌水調成一序列濃度，其濃度分別為:2.0 X 102個/ml，2.0 X 103個/ml，2.0 X 104個/ml，2.0 X 105個/ml，2.0 X 106個/ml，2.0 X 107個/ml，將上述濃度的 抱子均一地涂布到CMA平板上。然后，在CMA平板上隨機打取4-5個圓孔(直徑=1cm)，將涂布 有抱子CM的平板放置于25°C培養一周。
[0016]拔起萎黨、下部葉片發黃的植株，剪掉地上部分，將根部沖洗干凈。選取根部卵塊 呈米黃色而量多的番茄，用滅菌的解剖針挑取成熟卵塊并將其加入到涂有不同抱子濃度 CMA平板的圓孔中，每個圓孔中加入2個成熟卵塊，W成熟卵塊未加入沒有涂布有抱子的CMA 平板圓孔為對照。隨后加入80化1無菌水并置于25°C培養，察并統計解化出來的二齡幼蟲數 目。
[0017]卵粒抑制率（％ ) = l〇〇(A-B-C)/A
[0018]其中:A是初始加入的卵粒數目、B完整卵粒的數目、C解化出的J2數目。
[0019]卵塊解化抑制效果= b-a
[0020] 其中a為對照組的卵粒抑制率
[0021 ] b為各抱子濃度實驗組的卵粒抑制率
[0022] 4、測定對線蟲幼蟲的毒殺效果
[0023] 拔起萎黨、下部葉片發黃的植株，剪掉地上部分，將根部沖洗干凈。選取根部卵塊 呈米黃色而量多的番茄，用滅菌的解剖針挑取成熟卵塊并將其置于40WI1細胞篩網。挑取后 將篩網和卵塊置于2% (質量/體積)次氯酸鋼中Imin，期間緩慢振動篩網。無菌水沖洗卵塊7 次后將篩網放置于裝有15ml無菌水的6cm培養板中28 °C恒溫培養箱中解化，每24h收集一 次，并將其制備成線蟲懸浮液。
[0024] 將50化1根結線蟲二齡幼蟲懸浮液加入涂有不同抱子濃度的CMA平板圓孔中，繼續 放置于25°C培養8天，W沒有涂布抱子的CMA平板為對照，顯微鏡下觀察并統計仍然存活的 J2〇
[0025] 線蟲毒殺率（％) = 100(A-B)/A
[0026] 其中:A是初始加入的幼蟲數目、B是觀察時仍然存活的幼蟲數目。
[0027] 線蟲的毒殺效果= b-a
[00%] 其中a為對照組的線蟲毒殺率。
[0029] b為各抱子濃度實驗組的線蟲毒殺率。
[0030] 本發明的優點在于：用線蟲寄生性真菌(P^Mum SPP)寄生線蟲毒殺線蟲時效快、 防效高;對農產品、人畜和環境均無污染;特別是對于世界性±傳病害的根結線蟲的防控具 有良好的應用開發前景。
【附圖說明】
[0031] 圖1顯示抱子形態(標尺= 9.5皿）。
[0032] 圖2顯示菌絲形態(標尺= 4wii)。
[0033] 圖3顯示抱子囊形態(標尺=5皿）。
[0034] 圖4顯示菌絲侵染根結線蟲卵粒(標尺= 20wii)。
[0035] 圖5顯示菌絲侵染根結線蟲二齡幼蟲(標尺= 20wii)。
【具體實施方式】
[0036] 本發明實施例中的腐霉真菌的純化、培養方法及對線蟲的生測測定同
【發明內容】
部 分所述。
[0037] 實施例一：
[0038] 拔起萎黨、下部葉片發黃的植株，剪掉地上部分，將根部沖洗干凈。選取根部卵塊 呈米黃色而量多的番茄，用滅菌的解剖針挑取成熟卵塊并將其加入到5% (質量/體積)次氯 酸鋼溶液中，激烈震蕩2min后，離屯、收集管底的卵粒，并用蒸饋水洗涂，直到沒有次氯酸鋼 味道，并制成卵粒懸浮液(400個/ml)。
[0039] 將50化1線蟲卵粒懸浮液分別加入涂有抱子濃度為2.0 X 102個/ml，2.0 X 103個/ ml，2.0 X 1〇4個/ml，2.0 X 1〇5個/ml，2.0 X 1〇6個/ml，2.0 X 1〇7個/ml的不同CMA平板圓孔中， 繼續放置于25°C培養4天，W沒有涂布抱子的CMA平板為對照。顯微鏡下觀察統計仍然完整 的卵粒或解化出的J2。結果見表1。
[0040] 實施例二：
[0041] 拔起萎黨、下部葉片發黃的植株，剪掉地上部分，將根部沖洗干凈。選取根部卵塊 呈米黃色而量多的番茄，用滅菌的解剖針挑取成熟卵塊并將其置于40WI1細胞篩網。挑取后 將篩網和卵塊置于2% (質量/體積)次氯酸鋼中Imin，期間緩慢振動篩網。無菌水沖洗卵塊7 次后將篩網放置于裝有15ml無菌水的6cm培養板中28 °C恒溫培養箱中解化，每24h收集一 次，并將其制備成600條/ml的線蟲懸浮液。
[0042] 將50化1根結線蟲二齡幼蟲懸浮液分別加入涂有抱子濃度為2.0 X 102個/ml，2.0 X 1〇3個/ml，2.0 X 1〇4個/ml，2.0 X 1〇5個/ml，2.0 X 1〇6個/ml，2.0 X 1〇7個/ml的不同CMA平板 圓孔中，繼續放置于25°C培養8天，W沒有涂布抱子的CMA平板為對照，顯微鏡下觀察并統計 仍然存活的J2。結果見表2。
[0043] 表1寄生真菌對根結線蟲卵粒解化的抑制效果
[0044]
[0045] 結果表明，腐霉真菌(Pythium spp)能夠明顯抑制根結線蟲卵粒的解化。
[0046] 表2寄生真菌對根結線蟲二齡幼蟲的毒殺效果
[0047]
[004引結果表明，腐霉真菌(Pythi皿spp)能夠較好地寄生或毒殺根結線蟲二齡幼蟲。
【主權項】
1. 一株腐霉(Pythium spp)菌株，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物 中心，保藏號:CGMCC N0.12238。2. 權利要求1所述的腐霉(Pythium spp)菌株在制備抑制根結線蟲孵化生物藥物中的 應用。3. 權利要求1所述的腐霉(Pythium spp)菌株在制備毒殺根結線蟲二齡幼蟲生物藥物 中的應用。
【文檔編號】C12R1/645GK106047729SQ201610693038
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年8月19日
【發明人】鄒成鋼, 陸朝軍, 桂小薇, 卞靜, 王紀愛, 張克勤
【申請人】云南大學