一種苯胺綠人工抗原的制備方法
【專利摘要】本發明提供了一種苯胺綠人工抗原的制備方法，第一步為半抗原的制備及檢測：以N,N?二甲基苯胺、苯甲醛衍生物為原料，Amberlyst 15 樹脂為催化劑，在一定條件下合成苯胺綠半抗原；第二步為人工抗原的制備與檢測：采用活潑酯和重氮化法分別將獲得的半抗原與牛γ球蛋白(BGG)偶聯，制備苯胺綠的人工抗原即苯胺綠?牛γ球蛋白形成相應全抗原。所制備的苯胺綠人工抗原可進行動物免疫，取得相應的苯胺綠抗體，可用于各種苯胺綠免疫分析法的研究，為苯胺綠的檢測提供更加方便快速準確的途徑。
【專利說明】
一種苯胺綠人工抗原的制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物化工技術領域，具體涉及一種苯胺綠人工抗原的制備方法。
【背景技術】
[0002] 苯胺綠在中文中又稱孔雀石綠；中國綠;堿性孔雀石綠；品綠;鹽基塊綠；英文名 稱:MalachiteGreen oxalate,苯胺綠是綠色有金屬光澤的晶體，易溶于水，溶于乙醇、甲醇 和戊醇，水溶液呈藍綠色，pHO.O以下呈黃色；最大吸收波長616.9nm.是有毒的三苯甲烷類 化學物，既是染料，也是殺菌劑，可致癌。其結構式為：
[0004] 苯胺綠中的化學功能團三苯甲烷可致癌，很多國家已經禁用，但仍有漁民在防治 魚類感染真菌時使用。也有運輸商用作消毒，以延長魚類在長途販運中的存活時間。
[0005] 目前，對苯胺綠的檢測主要依靠高效液相色譜法(HPLC)，氣相色譜(GC)，薄層色譜 (TLC)，質樸(MS)等，但是存在儀器昂貴，檢測費時，并且需要專業技術人員進行操作，不能 達到現代檢測對快速，準確的要求。而免疫分析法可以彌補以上所有缺點，免疫分析法是一 種利用抗原抗體特異性結合反應檢測各種物質（藥物、激素、蛋白質、微生物等）的分析方 法，該方法的前提就是需要提供特異性的抗原和抗體。因此有必要提供一種有效的苯胺綠 人工抗原的制備方法，制備的苯胺綠人工抗原可用于免疫制備具有特異性的苯胺綠抗體， 進一步用于檢測。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的在于克服現有技術中存在的缺陷與不足，提供一種苯胺綠人工抗原 的制備方法，所制備的苯胺綠人工抗原可進行動物免疫，取得相應的苯胺綠抗體，可用于各 種苯胺綠類免疫分析法的研究，為苯胺綠的檢測提供更加方便快速準確的途徑。
[0007] -種苯胺綠人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
[0008] (1)制備人工半抗原：
[0009] (a)將N，N_二甲基苯胺和4-羧基苯甲醛以摩爾比為2:1的比例加入圓底燒瓶中， 100°C下攪拌反應6小時;反應結束后反應液用乙醚提取，轉干，經重結晶得到白色固體產物 I;
[00?0] (b)稱取2g產物I，加入苯30ml以及5gAmberlyst 15樹脂催化劑，放入圓底燒瓶中， 在氮氣保護、130°C下回流攪拌過夜;反應結束后，將溶劑減壓轉干，用乙醚提取得產物Π ;
[0011] (c)將產物Π 經硅膠柱層析純化，提取得到苯胺綠半抗原4-(雙(4-二甲胺基）苯 基）甲基苯甲酸(4-MGC)白色固體；
[0012] (2)制備苯胺綠人工抗原：
[0013] (d)稱取0 · 425g半抗原和N-羥基琥拍酰亞胺0 · 225g，溶于10 · OmlN，N-二甲基甲酰 胺中，再慢慢滴加溶解有〇. 255g N，N-二環己基碳二亞胺的10.0 mlN，N-二甲基甲酰胺，邊滴 加邊磁力攪拌，結束后20 °C磁力攪拌過夜，得到A液；
[0014] (e)將牛γ球蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液；
[0015] ⑴在常溫磁力攪拌條件下，將A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合液 4°C冰箱內磁力攪拌過夜；
[0016] (g)制備鈉離子濃度為0. lmol/L的PBS緩沖液，pH為7.2~7.4;
[0017] (h)將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，4 °C攪拌透析，每4小時換一次緩沖液， 透析2天，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時，將產物離心取上清，在無菌條件下通0.2μπι的 濾膜，即得到苯胺綠人工抗原:苯胺綠-牛γ球蛋白。
[0018] 由于苯胺綠的分子量較小，單獨作用時不具有免疫原性或免疫原性較弱，因此必 須將其與大分子載體比如牛γ球蛋白連接形成苯胺綠抗原后，才能刺激機體產生相應的苯 胺綠抗體。本發明在制備苯胺綠人工抗原過程中，所選的位點和交聯方法都沒有明顯改變 其結構，保留了抗原決定簇。在苯胺綠半抗原和牛γ球蛋白之間引入橋結構，暴露抗原決定 簇，所獲得的苯胺綠人工抗原保持了苯胺綠的結構特異性，有利于相應苯胺綠抗體的產生。
[0019] 本發明的技術方案分為兩步，第一步為半抗原的制備及檢測：以Ν，Ν-二甲基苯胺、 苯甲醛衍生物為原料，Amberlyst 15樹脂為催化劑，在一定條件下合成苯胺綠半抗原;第二 步為人工抗原的制備與檢測：采用活潑酯和重氮化法分別將獲得的半抗原與牛γ球蛋白 (BGG)偶聯，制備苯胺綠的人工抗原即苯胺綠-牛γ球蛋白形成相應全抗原。
[0020] 本發明制備得到的苯胺綠人工抗原可通過以下方法進行鑒定：
[0021] 偶聯比測定：估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率）的方法雖然很 多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量)的原理建立起來的。分 光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例關系的原理分別測定被偶聯的兩種分子 濃度。在大分子與小分子偶聯物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現出光譜 圖迭加的性質。
[0022] 摩爾吸收系數ε :配制苯胺綠半抗原濃度為0，5，10，20，30，40ug/ml的roS溶液，通 過紫外掃面圖可知苯胺綠半抗原的最大吸收波長為288nm，在288nm處測吸光值，每個濃度 做平行樣。摩爾吸光系數計算為ε =吸光值/摩爾濃度。本發明計算得e = 5014.35L/mol
[0023] 偶聯物蛋白濃度的測定:配制濃度為0，10，20，30，40,60，80，100，120ug/ml的牛γ 球蛋白PBS溶液lml，加入3ml考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C水浴溫熱5分鐘，每個濃度 做平行樣，在655nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關系曲線。將抗原溶液按一定比 例吸收，在655處測得抗原的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應蛋白濃度值。本發明計 算得苯胺綠抗原的蛋白濃度為3.183mg/ml。
[0024] 偶聯比測定:配制100ug/ml的牛γ球蛋白ros溶液，將偶聯物用ros稀釋到100ug/ ml，在276處測得吸光值，以PBS為空白，測得吸光值A1，A2，則偶聯比率γ為：γ = [ (Ai-A2)/ ε]/(100Χ 10-3/65000)，本發明計算得 γ ~17。
[0025] 其中ε為摩爾吸光系數(L/mol)，65000為牛γ球蛋白的分子量，100Χ 10-3為牛γ球 蛋白濃度(ug/ml)。
[0026] 本發明的有益效果:本發明合成了苯胺綠的人工抗原，合成工藝先進，特異性強， 得到的苯胺綠人工抗原用于免疫新西蘭白兔，檢測結果表明，苯胺綠人工抗原的免疫血清 的效價為1:72000,完全可用于免疫分析中，為苯胺綠的檢測提供更加方便快速準確的途 徑。
【附圖說明】
[0027] 圖1是苯胺綠人工半抗原的液相色譜圖。
[0028]圖2是苯胺綠人工半抗原的質譜圖。
[0029]圖3是苯胺綠人工抗原制備前后的紫外掃描圖。
【具體實施方式】
[0030] 苯胺綠人工抗原制備分為兩步，第一步為半抗原的制備及檢測：以N，N_二甲基苯 胺、苯甲醛衍生物為原料，Amberlyst 15樹脂為催化劑，在一定條件下合成苯胺綠半抗原； 第二步為人工抗原的制備與檢測:采用活潑酯和重氮化法分別將獲得的半抗原與牛γ球蛋 白（BGG)偶聯，制備苯胺綠的人工抗原即苯胺綠-牛γ球蛋白形成相應全抗原。
[0031] 實施例1
[0032] (1)制備人工半抗原半抗原4-MGC的合成：
[0033] (a)將Ν，Ν_二甲基苯胺（3g)和4-羧基苯甲醛以摩爾比為2:1加入圓底燒瓶中，100 °C下攪拌反應6小時;反應結束后反應液用乙醚提取，轉干，經重結晶得到白色固體產物I; [0034] (b)稱取2g產物I，加入苯30ml以及5gAmberlySt 15樹脂催化劑一起放入圓底燒瓶 中，氮氣保護，130°C下回流攪拌過夜;反應結束后，將溶劑減壓轉干，用乙醚提取得產物Π ; [0035] (c)將產物Π 經硅膠柱層析純化，提取得到目標半抗原4_(雙(4-二甲胺基)苯基） 甲基苯甲酸(4-MGC)白色固體；
[0036] (2)制備苯胺綠人工抗原苯胺綠-BGG的合成：
[0037] (d)稱取0.425g半抗原4-MGC和N-羥基琥珀酰亞胺0.225g溶于10.0mlN，N-二甲基 甲酰胺中，存放于燒杯中，再將溶解有〇.255g N，N-二環己基碳二亞胺的10.0mlN，N-二甲基 甲酰胺的溶液慢慢滴加，邊滴加邊磁力攪拌，結束后20°C磁力攪拌過夜，得到A液；
[0038] (e)將牛γ球蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液；
[0039] (f)在常溫磁力攪拌條件下，將A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合 液，4 °C冰箱內磁力攪拌過夜；
[0040] (g)制備鈉離子濃度為0. lmol/L的PBS緩沖液，pH為7.2~7.4;
[0041 ] (h)將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，4 °C攪拌透析，每4小時換一次緩沖液， 透析2天，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時，將產物離心取上清，在無菌條件下通0.2μπι的 濾膜，即得到苯胺綠人工抗原:苯胺綠-牛γ球蛋白。
[0042] (3)苯胺綠人工抗原的鑒定：
[0043]偶聯比測定：估算偶聯物中被偶聯的兩種分子的比率(偶聯比率）的方法雖然很 多，但都是依據檢測偶聯物中被偶聯的兩種分子含量(或相對含量）的原理建立起來的。分 光光度法是利用物質對光的吸收與其濃度呈比例關系的原理分別測定被偶聯的兩種分子 濃度。在大分子與小分子偶聯物中，兩種分子均有各自不同的紫外掃描光譜，并表現出光譜 圖迭加的性質。
[0044] 摩爾吸收系數ε :配制苯胺綠半抗原濃度為0，5，10，20，30，40ug/ml的roS溶液，通 過紫外掃面圖可知苯胺綠半抗原的最大吸收波長為288nm，在288nm處測吸光值，每個濃度 做平行樣。摩爾吸光系數計算為ε =吸光值/摩爾濃度。計算得e = 5014.35L/mol
[0045] 偶聯物蛋白濃度的測定:配制濃度為0，10，20，30，40，60，80，100，120ug/ml的牛γ 球蛋白PBS溶液lml，加入3ml考馬斯亮藍染色液，立即混勻，30°C水浴溫熱5分鐘，每個濃度 做平行樣，在655nm處測吸光值，繪制蛋白濃度與吸光值的關系曲線。將抗原溶液按一定比 例吸收，在655處測得抗原的吸光值，從曲線上得到抗原溶液的相應蛋白濃度值。計算得苯 胺綠抗原的蛋白濃度為3.183mg/ml。
[0046] 偶聯比測定:配制100ug/ml的牛γ球蛋白ros溶液，將偶聯物用ros稀釋到100ug/ ml，在276處測得吸光值，以PBS為空白，測得吸光值A1，A2，則偶聯比率γ為：γ = [ (Ai-A2)/ ε]/(100 X10-3/65000)，計算得 γ ~17。
[0047] 其中ε為摩爾吸光系數(L/mol) ,65000為牛γ球蛋白的分子量，100Χ 10_3為牛γ球 蛋白濃度(ug/ml)。
[0048] 苯胺綠人工半抗原的液相色譜圖如圖1所示，苯胺綠人工半抗原的質譜圖如圖2所 示，苯胺綠人工抗原制備前后的紫外掃描圖如圖3所示。
【主權項】
1. 一種苯胺綠人工抗原的制備方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 制備人工半抗原： (a) 將N，N-二甲基苯胺和4-羧基苯甲醛以摩爾比為2:1的比例加入圓底燒瓶中，100 °C下攪拌反應6小時;反應結束后反應液用乙醚提取，轉干，經重結晶得到白色固體產物I; (b) 稱取2g產物I，加入苯30ml以及5gAmberlyst 15樹脂催化劑的，放入圓底燒瓶中， 在氮氣保護、130°C下回流攪拌過夜;反應結束后，將溶劑減壓轉干，用乙醚提取得產物Π ; (c) 將產物Π 經硅膠柱層析純化，提取得到苯胺綠半抗原4-(雙(4-二甲胺基)苯基） 甲基苯甲酸(4-MGC)白色固體； (2) 制備苯胺綠人工抗原： (d) 稱取0.425g半抗原和N-羥基琥珀酰亞胺0.225g，溶于10.0mlN，N-二甲基甲酰 胺中，再慢慢滴加溶解有〇.2558~小-二環己基碳二亞胺的10.〇1111~少-二甲基甲酰胺， 邊滴加邊磁力攪拌，結束后20°C磁力攪拌過夜，得到A液； (e) 將牛γ球蛋白溶于PBS緩沖液中，得到濃度為5mg/ml的B液； (f) 在常溫磁力攪拌條件下，將A液逐滴加入到10ml的B液中，得到人工抗原混合液，4 °(：冰箱內磁力攪拌過夜； (g) 制備鈉離子濃度為〇. lmol/L的PBS緩沖液，pH為7.2~7.4; (h) 將人工抗原混合液于PBS緩沖液中透析，4°C攪拌透析，每4小時換一次緩沖液，透 析2天，紫外掃描透析液無小分子吸收峰時，將產物離心取上清，在無菌條件下通0.2μπι的 濾膜，即得到苯胺綠人工抗原:苯胺綠-牛γ球蛋白。
【文檔編號】C07K14/47GK106046143SQ201610594859
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年7月25日 公開號201610594859.9, CN 106046143 A, CN 106046143A, CN 201610594859, CN-A-106046143, CN106046143 A, CN106046143A, CN201610594859, CN201610594859.9
【發明人】葉肖俊
【申請人】杭州萊和生物技術有限公司