鴨mef2b基因的編碼序列及其克隆方法
【專利摘要】本發明公開了一種鴨MEF2B基因的編碼序列及其克隆方法。本發明對鴨的組織提取總RNA，并將總RNA逆轉錄為cDNA第一條鏈后，設計特異性引物，利用該特異性引物，并運用RT?PCR方法結合A/T克隆技術對鴨MEF2B基因進行克隆，經過實驗證明，本發明的方法準確性高，結果可靠，能為構建鴨MEF2B基因的原核、真核表達載體及相關動物模型等研究提供基礎材料。
【專利說明】
鴨MEF2B基因的編碼序列及其克隆方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及生物技術領域，尤其是一種鴨MEF2B基因的編碼序列及其克隆方法。
【背景技術】
[0002] 肌細胞增強因子2B(MEF2B)基因屬于肌細胞增強因子2家族(Myocyte-specific enhancer binding factor 2，MEF2)中的一員，研究表明，多種生理過程與MEF2基因家族相 關，如骨骼發育、肌肉形成、肝臟纖維化和神經系統發育，MEF2于肌肉細胞中廣泛存在，在與 大多數肌肉特異基因的啟動子或增強子直接結合后，能夠啟動或增強基因的相關表達，該 基因可作為肌源性基因表達的主要調節物。MEF2B基因位于脊椎動物中MEF2家族進化樹的 基部，距離其它成員最遠，因此其缺少HJURP_C區域，僅含有MADS-box結構域。
[0003] Hidaka等（1995)在研究MEF2B基因與其同源的基因在小鼠胚胎性癌細胞P19(簡稱 EC細胞)差異性表達的時候發現，在P19細胞分化的過程中，MEF2A和MEF2D基因的轉錄出現 上調，而MEF2B基因的轉錄卻大量存在于未分化的P19中，在畸胎瘤細胞(F9細胞)和胚胎干 細胞(ES細胞）以及成年小鼠心臟、骨骼肌或腦組織中出現下調，由此說明小鼠的MEF2B基因 可能在胚胎發育的過程中與MEF2基因家族的其他成員有著不同的功能。MEF2B基因很有可 能替代MEF2C基因的作用，如果在胚胎時期敲出MEF2C基因，MEF2B基因的表達量會顯著上升 (Lin等，1997) ding等（2013)認為MEF2B基因的突變，可導致彌漫性大B細胞淋巴瘤原癌基 因 BCL6的表達束縛受到抑制。
[0004] 研究指出，MEF2B在多種肌肉及神經組織中高表達，何波（2006)對豬的MEF2B和 MEF2C基因的組織表達譜分析發現，兩個基因在心、肝、脾、肺、腎、肌肉、脂肪和睪丸等8個組 織中均能檢測到表達，且表達量都較高，通過對骨骼肌體外培養發現，隨著分化程度的深 入，它們的表達量也越來越高。祁艷霞等(2013)利用熒光實時定量PCR技術分析了南陽黃牛 3月齡到24月齡間背最長肌組織中MyoD和MEF2基因家族的表達變化情況，結果表明MEF2B基 因的表達呈持續上升趨勢。程波(2012)報道，MEF2B基因在山羊個體的不同組織間均能檢測 至 1J，但表達量有著不同的規律。
[0005] 上述研究結果提示，鴨MEF2B基因可能與其生產水平、肉質性狀等有關聯。國內鴨 MEF2B基因的相關研究報道，NCBI數據庫中暫無鴨MEF2B基因序列及相關的文獻報道。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是:提供一種鴨MEF2B基因的編碼序列及其克隆方法，它準確性高， 結果可靠，為構建鴨MEF2B基因的原核、真核表達載體及相關動物模型等研究提供基礎材 料。
[0007] 本發明是這樣實現的：鴨MEF2B基因的編碼序列，它具有如序列表中SEQ ID N0 :1 所示的核苷酸序列。
[0008] 克隆鴨MEF2B基因 CDS區序列的方法，對鴨的組織提取總RNA，并將總RNA逆轉錄為 cDNA第一條鏈后，根據同源物種設計特異性引物，F:ATGGGCCGGAAAAAAATCCA，R: CTATCTCTGCCAAACGTCCACGG;運用RT-PCR方法結合A/T克隆技術對鴨MEF2B基因進行克隆，將 RT-PCR擴增產物與pGEM-T載體連接，構建pGEM-T-MEF2B重組質粒，即完成了對鴨MEF2B基因 ⑶S區序列的克隆。
[0009]由于采用了上述技術方案，與現有技術相比，本發明對鴨的組織提取總RNA，并將 總RNA逆轉錄為cDNA第一條鏈后，設計特異性引物，利用該特異性引物，并運用RT-PCR方法 結合A/T克隆技術對鴨MEF2B基因進行克隆，經過實驗證明，本發明的方法準確性高，結果可 靠，能為構建鴨MEF2B基因的原核、真核表達載體及相關動物模型等研究提供基礎材料。
【附圖說明】
[0010] 圖1為鴨MEF2B基因 RT-PCR凝膠電泳檢測圖； 圖2為鴨MEF2B基因構建pGEM-T-MEF2B重組質粒PCR凝膠電泳檢測圖。
【具體實施方式】
[0011 ]本發明的實施例:用于克隆鴨MEF2B基因編碼區序列的引物及方法 1、 鴨總RNA提取及cDNA的合成 采取鴨胸肌組織液氮速凍，-80°C超低溫冰箱保存，用于總RNA抽提，參照TRizol Reagent試劑（life/Invitrogen, USA)說明書進行，將所得總RNA逆轉錄為cDNA的第一條 鏈，cDNA 合成根據 Thermo Scientific RevertAid First Strand cDNA Synthesis (K1622)逆轉錄試劑盒合成， 2、 鴨MEF2B基因⑶S區序列引物設計 欲擴增鴨MEF2B基因 CDS區序列由于該基因在鴨物種上NCBI尚未給出，故采用物種同源 性的方法采用雞的MEF2B基因（GenBank:XM_004948890.2)和紫翅椋鳥MEF2B基因（GenBank: XM_014887170.1)mRNA序列運用NCBI中Primer-BLAST在線設計引物進行設計，引物由上海 英濰捷基生物有限公司合成，引物具體信息見表1。
[0012] 3、鴨MEF2B基因 CDS區RT-PCR擴增反應： 反應條件:95°C預變性5 min，94°C變性40 s，退火35 s(退火溫度詳見表2-3)，72 °C延 伸45 s，72 °C終延伸10 min，4 °C保存，32循環。
[0013] 反應體系：采用30 yL反應體系，其中：2X PCR Master Mix (北京天根）13 μ L，上、下游引物各2 yL(濃度均為 10 ymol/L)，cDNA模板2yL(1550 ng/yL)，加 RNase-free water補足至30 yL〇
[0014] 4、重組質粒的構建及測序 鴨MEF2B基因⑶S區PCR產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳后（圖1)，采用AXYGEN柱式DNA膠回 收試劑盒進行RT-PCR產物切膠回收純化，純化產物按照 pGEM-T載體試劑盒說明書進行操作，采用藍白斑法篩選克隆產物，最終提取重組質粒 (圖2)送往上海英濰捷基生物有限公司測序。
[0015] 5、測序結果驗證 擴增目的片段(鴨MEF2B基因的編碼序列）長度為1221 bp，其具體序列如序列表中SEQ ID N0 :1所示。其中包含起始密碼子ATG和終止密碼子TAG，所得片段長度與其他物種 MEF2B基因⑶S區片段長度相近，經NCBI在線保守結構域預測發現，該序列含有含有MADS-box保守區域，不含HJURP_C區域，符合脊椎動物MEF2B基因結構，說明鴨的MEF2B基因⑶S區 序列克隆成功。
【主權項】
1. 一種鴨MEF2B基因的編碼序列，其特征在于：它具有如序列表中SEQ ID NO :1所示 的核苷酸序列。2. -種克隆鴨MEF2B基因⑶S區序列的方法，其特征在于:對鴨的組織提取總RNA，并將 總RNA逆轉錄為cDNA第一條鏈后，設計特異性引物，F:ATGGGCCGGAAAAAAATCCA，R: CTATCTCTGCCAAACGTCCACGG;運用RT-PCR方法結合A/T克隆技術對鴨MEF2B基因進行克隆，將 RT-PCR擴增產物與pGEM-T載體連接，構建pGEM-T-MEF2B重組質粒，即完成了對鴨MEF2B基因 ⑶S區序列的克隆。
【文檔編號】C12N15/12GK106046138SQ201610434425
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月19日
【發明人】李輝, 趙忠海, 卜小雁, 易恒潔, 彭邦星, 師新彩, 張蓉
【申請人】貴州大學