一種雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋?2突變體EtMIC2?1130的制作方法
【專利摘要】本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，提供了一種雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋?2突變體EtMIC2?1130，該突變體是以野生型柔嫩艾美耳球蟲SD?01的EtMIC2(GenBank:KC333870.1)為基礎蛋白質進行體外定向進化，并建立基因突變庫，使用酵母表面展示蛋白突變庫，應用流式細胞儀分選以及動物免疫保護效果評價等手段，篩選免疫原性以及免疫保護力顯著提高的變異蛋白質最終獲得的，該突變體變異蛋白質有6個氨基酸突變位點。變異后的EtMIC2較天然EtMIC2免疫保護效果ACI提高約為21.94％，可作為疫苗在抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲感染等領域中應用。
【專利說明】
一種雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋-2突變體EtM IC2-1130
技術領域
[0001] 本發明涉及基因工程和遺傳工程領域，提供了一種雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋-2突 變體 EtMIC2-1130。
【背景技術】
[0002] 雞球蟲病是一類由專性細胞內寄生的艾美耳球蟲引起的腸道原蟲疾病。據估計每 年全世界用于預防和治療球蟲病成本會超過30億美元，中國每年約有30多億人民幣。目前 球蟲病的防控主要依靠藥物與疫苗，隨著耐藥蟲株的出現和針對抗球蟲藥物的立法限制， 人們更加重視免疫預防。市場上的疫苗主要為多種雞艾美耳球蟲活卵囊的混合，具有很好 的免疫保護效果，但是由于活疫苗存在安全問題以及較高的生產成本，研究者們將更多的 精力用于以亞單位為基礎的新型分子疫苗的研制。
[0003] 新型分子疫苗研制依靠具有較好抗原性以及免疫原性的抗原，由于球蟲復雜的抗 原結構以及生活史，抗原鑒定的難度以及抗原免疫原性篩選的限制阻礙了亞單位疫苗研制 的進展。研究者們也開展了大量的研究來改善抗原的免疫保護效果，包括新佐劑的研制，益 生菌誘導的非特異性免疫等，但是這些都不能從根本上改善抗原的免疫原性。因此，如何獲 得一種高效的新疫苗成為亟待解決的問題之一。
【發明內容】
[0004] 針對現有技術中存在的問題，本發明提供了一種雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋-2突變 體EtMIC2-1130及其編碼基因，該突變體是以野生型柔嫩艾美耳球蟲SD-01的EtMIC2 (GenBank: KC333870.1)為基礎蛋白質進行體外定向進化，并建立基因突變庫，使用酵母表 面展示蛋白突變庫，應用流式細胞儀分選以及動物免疫保護效果評價等手段，篩選免疫原 性以及免疫保護力顯著提高的變異蛋白質最終獲得的，該突變體變異蛋白質有6個氨基酸 突變位點。變異后的EtMIC2較天然EtMIC2免疫保護效果ACI提高約為21.94%，可作為疫苗 在抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲感染等領域中應用。
[0005] 發明人在本發明中應用的主要機理如下：
[0006] 定向進化被廣泛用于蛋白質工程領域，其中重要的應用之一就是改善抗原的免疫 原性。關鍵氨基酸的改變對于抗原的免疫反應和免疫識別有很大影響，比如可逆抑制宿主 的免疫反應、影響T細胞的激活、改善蛋白質免疫原性等，使用隨機突變構建基因突變庫是 定向進化常用的方法之一。
[0007] 而EtMIC家族蛋白質在球蟲移行、入侵宿主細胞以及胞內生存方面有重要的作用， EtMIC2蛋白質能夠在柔嫩艾美耳球蟲的整個生活周期內都表達，研究表明EtMIC2基因或者 蛋白質能夠誘導部分免疫保護反應，是很好的疫苗候選抗原。
[0008] 因此本發明的發明人使用隨機突變技術針對EtMIC2進行定向進化，建立基因突變 庫，使用酵母表面展示技術結合FACS以及動物免疫保護試驗篩選目的變異蛋白質，從而改 善EtMIC2蛋白質的免疫原性，為抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲感染提供技術支持。
[0009] 本發明的具體技術方案如下：
[0010] 本發明首先根據GenBank公布的EtMIC2核苷酸序列（GenBank: KC333870 · 1)人工合 成天然EtMIC2序列，其核苷酸序列如Seq ID N0:3所示，將該EtMIC2核苷酸序列與pEASY-Tl 載體連接建模EtMIC2-Tl。
[0011] 之后發明人利用易錯PCR擴增上述EtMIC2-Tl并獲得突變體，之后建立基因突變 庫，使用酵母表面展示蛋白突變庫，而后應用流式細胞儀分選以及動物免疫保護效果評價 等手段，篩選免疫原性以及免疫保護力顯著提高的變異蛋白質，最終獲得了本發明所述的 突變體，命名為EtMIC2_l 130,該突變體核苷酸序列如Seq ID No: 1所示，其編碼的氨基酸序 列如Seq ID N〇:2所示，通過與未突變EtMIC2比較，該突變體蛋白質有6個氨基酸突變位點， 具體突變位置如下：
[0012] EtMIC2-1130與EtMIC2氨基酸序列不同位點
[0014] 發明人在獲得上述突變體之后，對其進行了免疫保護效果驗證，結果發現相比于 未突變的EtMIC2蛋白質，突變體EtMIC2-l 130蛋白質免疫組體重增長顯著；突變體EtMIC2-1130蛋白質免疫組的盲腸平均病變計分要顯著低于未突變EtMIC2免疫組；突變體EtMIC2-1130蛋白質免疫組在克糞便卵囊數方面與天然蛋白EtMIC2相比，卵囊排出量明顯降低，具 有較好的改善效果；突變體EtMIC2-l 130蛋白質免疫組的ACI為168.17，比未突變EtMIC2蛋 白免疫組高約21.94%，具有良好的抗球蟲效果，可見本發明所提供的突變體EtMIC2-l 130 可作為疫苗在抵抗雞柔嫩艾美爾球蟲感染等領域中應用。
[0015] 綜上所述，本發明獲得了一種全新的雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋-2突變體EtMIC2-1130,該突變體較之為突變體免疫保護效果ACI提高約為21.94%，可作為疫苗在抵抗雞柔 嫩艾美爾球蟲感染等領域中應用。
【附圖說明】
[0016] 圖1為酵母表面展示蛋白質EtMIC2以及突變EtMIC2蛋白質SDS-PAGE檢測結果灰度 圖；
[0017] 圖中Μ為Marker; 1為EtMIC2蛋白質；2為EBY100陰性對照；3為EtMIC2-l 130變異蛋 白質；
[0018] 圖2為酵母表面展示蛋白質EtMIC2以及突變EtMIC2蛋白質Western blot檢測結果 灰度圖，
[0019] 圖中Μ為Marker; 1為EtMIC2蛋白質；2為EtMIC2-l 130變異蛋白質；
[0020]圖3為流式細胞儀分選展示有EtMIC2蛋白的酵母細胞示意圖。
【具體實施方式】
[0021]試驗材料和試劑
[0022] 1、菌株、載體:本發明所涉及的各種菌株均為常規菌株，可從市場上直接夠得;所 采用的克隆載體pEASY-ΤΙ購自全式金公司；表達載體pET-30a( + )，采用本領域常規技術獲 得或購買。
[0023] 2、主要試劑與藥品：rTaq酶、dNTPs、DNA Marker、Protein Marker、PCR產物純化試 劑盒、DNA膠回收試劑盒和質粒提取試劑盒購于北京全式金生物技術有限公司；限制性內切 酶BamH I、Nhe I、Hindm和Sal I購自大連寶生物工程有限公司；T4DNA連接酶購自 Fermentas ;FITC標記羊抗鼠 IgG、HRP標記羊抗鼠 IgG和IgA購自北京博奧森生物科技有限公 司；Quick Start? Bradford lx Dye Reagent購自Bio-Rad公司；His · Bind?. Purification Kit購自Merck公司；完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑等購自Sigma公司；二 硫蘇糖醇(DTT)購自Sigma公司;酵母質粒快速提取試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公 司，其它常規試劑均為國產分析純。
[0024] 3、培養基的配制：
[0025] (1)LB液體培養基:使用電子天平稱取酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，氯化鈉10g，溶 解于1L去離子水中，121°C高壓滅菌20min。
[0026] (2)固體LB培養基：按以上方法配制LB液體培養基100mL，加入1.5g瓊脂粉，121°C 高壓滅菌20min，冷卻后倒入培養皿中。
[0027] (3)固體LB/AMP (Kan)培養基:按以上方法配制LB液體培養基100mL，待溫度降至不 燙手時，加入l〇〇yL Amp(Kan)貯存液，混勻后，倒入培養皿中，冷卻后4°C保存。
[0028] (4)YPD液體培養基:使用電子天平稱取酵母提取物10g，胰蛋白胨20g，葡萄糖20g 溶解于1L去離子水中，121°C滅菌15min。
[0029] (5)固體YPD培養基:按以上方法配制Yro液體培養基100mL，加入1.5g瓊脂粉，121 °(：高壓滅菌20min，冷卻后倒入培養皿中。
[0030] (6)SD-CAA液體培養基:使用電子天平稱取酵母氮源6.7g，酸水解酪素5g，葡萄糖 2〇g溶解于1L去離子水中，使用磁力攪拌器充分溶解，121°C高壓滅菌15min。
[0031] (7)固體SD-CAA培養基:將100ml SD-CAA液體培養基中加入1.5-2g瓊脂粉，高壓滅 菌后，傾入培養皿。
[0032] (8)SG-CAA液體培養基:使用電子天平稱取無氨基酸無硫酸銨酵母氮源6.7g，酸水 解酪素5g溶解于1L去離子水中，使用磁力攪拌器充分溶解，121°C高壓滅菌15min，之后加入 20g的過濾除菌的半乳糖4°C保存。
[0033] 4、本實施例中未做詳細具體說明的分子生物學實驗方法，均參照《分子克隆實驗 指南》(第三版)J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進行，或者按照試劑盒和產品說明書 進行
[0034] 實施例1突變體EtMIC2-1130的獲得
[0035] 首先根據GenBank公布的EtMIC2核苷酸序列（GenBank: KC333870 · 1)人工合成天然 EtMIC2序列，所獲得的EtMIC2核苷酸序列，其核苷酸序列如SeqIDN0:3所示，之后將其與 pEASY-Tl載體連接建模EtMIC2-Tl;
[0036] 之后以 EtMIC2-Tl 為模板，使用 EtMIC2-951-F 和 EtMIC2-951-R 為引物，利用 Divers ify PCR Random Mutagenes is Kit(Clontech，USA)進行易錯PCR擴增EtMIC2突變體獲得 易錯PCR產物;其中所用引物如表1所示：
[0037] 表1.所述突變體EtMIC2_l 130特異性引物
[0039]實施例2所述突變體的制備
[0040]將實施例1中獲得的易錯PCR產物在未純化的情況下，與pEASY-T 1載體連接后，轉 入Top 10感受態細胞，涂布氨芐LB瓊脂平板，于37°C溫箱中培養直至單克隆菌落增至107為 止，構建EtMIC2基因突變庫；
[0041 ]上述包含有基因突變文庫的重組質粒以及PCTC0N2質粒，使用Nhe I和Sal I進行 雙酶切，將雙酶切的基因突變庫與PCTC0N2載體連接后轉染釀酒酵母EBY100 (購自 Invitrogen)，得到重組菌株EBY100/EtMIC2，PCR鑒定陽性菌落(設計所用引物如表2所示）； 取含有重組質粒的菌株EBY100,涂布SD-CAA固體培養基上30°C溫箱中，培養48h，直至酵母 菌菌落為1〇 8個為止，構建EtMIC2突變蛋白質庫重組菌株EBY100/EtMIC2;
[0042]表 2
[0044] 取含有重組質粒的EBY100菌株按體積比1:100的比例接種于100mL的SD-CAA中，30 °C，220rpm培養約8h，至0D600約1.0左右停止培養，將菌體在無菌的條件下4°C，3000r/min， 離心5min，棄掉上清，使用無菌蒸餾水洗滌三次以徹底除去葡萄糖，3000r/min，離心5min， 使用新鮮配制的SG-CAA培養基100mL重懸菌體，并轉移至滅菌的三角瓶中，30°C，220rpm誘 導培養約12h;
[0045] 將誘導表達的酵母菌濃度調整為5xl07個/10yL，加入終濃度為100mM的DTT溶液，4 °(：作用過夜，期間不斷震蕩。將獲得的蛋白質溶液加入到透析袋中，在4°C條件下使用PBS溶 液透析多次（每次2h)除去DTT，10,000rpm，離心lmin，吸取上清，使用SDS-PAGE及Western blot分析表達情況，結果顯示在50kDa左右出現陽性條帶(如圖1和2所示）；
[0046] 取上述誘導表達的酵母菌細胞，使用pH為7.2的PBS-BSA(lmg/mL)洗2遍，10，000r/ min，離心lmin，將菌體重懸于40yLl:200稀釋的兔源抗EtMIC2多抗(利用現有技術制備）中， 混勾，冰浴30min，使用pH為7.2的PBS_BSA( lmg/mL)洗2遍，10，000r/min，離心lmin，將菌體 重懸于50yLl: 75稀釋的FITC標記鼠抗兔IgG單抗，混勻，冰浴30min，使用pH為7.2的PBS-BSA (lmg/mL)洗2遍，10,000r/min，離心lmin，BD FACSAria Cel l-Sort ing System進行無菌 篩選含有突變體菌株，以展示未突變EtMIC2蛋白質與兔源抗EtMIC2多抗血清親和力的不同 為對照，圈定熒光信號較強的門P1 (占總細胞數的0.1 %，其熒光強度為：28299.53，代表與 EtMIC2多抗親和力較強）（如圖3所示），經過三次連續篩選后，涂布SD-CAA固體瓊脂平板，30 °C培養48h，收集酵母單菌落8株。
[0047] 常規技術提取含有突變體基因的上述8株酵母菌pCTC0N2重組質粒，以該質粒為模 板，以表2所示的His-EtMIC2-F和His-EtMIC2-R為引物，使用PrimeSTAR DNA Polymerase (Takara)進行PCR擴增EtMIC2突變體基因，將上述PCR產物以及pET30a，使用BamH I和Hind ΙΠ 進行雙酶切，連接后轉化BL21菌株獲得重組菌株BL21/EtMIC2-1130。陽性克隆按1:100的 比例接種于含有卡那霉素抗性的LB培養基中，在37°C，220rpm的恒溫搖床中培養3h，至 0D600~0.6時，向各管中加入終濃度為ImM的IPTG溶液誘導表達4h，8，OOOrpm離心5min，收 集菌體，1 X結合緩沖液洗滌菌體2次，使用以每100mL培養基所得菌體加入4mL 1 X結合緩 沖液比例重懸菌體。經超聲波破碎(功率300W，開3sec，停6sec)后，16，000g離心20min收集 上清及沉淀，沉淀按每100mL培養物加5mL緩沖液比例，加入終濃度為8M尿素的1 X結合緩沖 液，徹底溶解包涵體，16，000g離心30分鐘再次收集上清，兩次收集上清混合，調pH為8.0，使 用0.45um濾膜過濾，用于His · Bind蛋白質純化(根據His · Bind?Purificat ion Kit說明 書進行），獲得突變體蛋白，命名為EtMIC2_1130,其核苷酸序列如Seq ID N〇:l所示，其編碼 的氨基酸序列如Seq ID N〇:2所示，通過與未突變EtMIC2比較，該突變體蛋白質有6個氨基 酸突變位點。
[0048] 根據Quick Start? Bradford lx Dye Reagent說明書，使用0 · 125、0· 25、0 · 5、 0.75、1.0、1.5和2. Omg/mL的BSA標準品各5yL加入到含有250yL染料試劑的EP管中，充分混 勻，室溫作用5min，每個梯度做三個重復;取待測蛋白質樣品各5yL加入到含有250yL染料試 劑的EP管中，充分混勻，室溫作用5min，每個梯度做三個重復，將混合液加入到酶標板的孔 中，使用酶標儀測定0D595;繪制標準曲線，根據得出的公式計算突變體蛋白濃度為1.36mg/ mL〇
[0049] 實施例3突變體EtMIC2-1130免疫保護效果判定
[0050] 1日齡雛雞稱重，剔除體重差別較大的雞只。共將100只雛雞分為4組，分別為PBS-I (不免疫不感染組），PBS-II(不免疫感染組），天然蛋白EtMIC2,突變體EtMIC2免疫組，每組 25只，在隔離罩中飼養。在7日齡時，各組雞只分別進行皮下多點免疫弗氏完全佐劑乳化的 終濃度為〇. 5mg/mL的蛋白質或roS 100yL，在14日齡時進行加強免疫弗氏不完全佐劑乳化 的對應終濃度為0.5mg/mL的蛋白質或PBS lOOyLdI日齡雛雞除roS-I組外均口服接種30， 000個孢子化卵囊。依據免疫雞只體重增長情況、盲腸病變計分、克糞便卵囊數(0PG)、抗球 蟲指數(ACI)等指標判定突變體蛋白免疫保護效果：
[0051 ] -、體重增長情況測定:具體方法如下：
[0052] 21日齡(攻蟲前）以及31日齡(攻蟲后）時進行逐羽稱重，記錄稱重結果，并計算平 均增重(平均增重(g) =31日齡平均體重(g)_21日齡平均體重(g))與相對增重量(相對增重 率（％ )=(感染組的增重/不感染不免疫組的增重）X 100% )。結果表明：與PBS-II組相比， 免疫天然蛋白EtMIC2組與突變體EtMIC2-1130組體重增長顯著，但相比于未突變的EtMIC2 蛋白質組，突變體EtMIC2-l 130組體重增長不顯著。
[0053]二、盲腸病變計分測定:具體方法如下：
[0054] 根據Johnson和Reid(1970)5分制原則，在感染球蟲后5d，每組剖殺6只雞，取盲腸 首先觀察外觀出血點，腫脹情況，然后縱向剖開盲腸，觀察內容物狀態，使用自來水清除掉 內容物觀察盲腸內壁的出血情況，綜合這些病變進行評定記分。結果表明：與PBS-II組相比 EtMIC2，EtMIC2-1130免疫組盲腸平均病變計分顯著降低，且突變體EtMIC2-1130組的盲腸 平均病變計分要顯著低于未突變EtMIC2免疫組。
[0055]三、克糞便卵囊數(0PG):具體方法如下：
[0056] 攻蟲后第5d至第10d開始每天分別收集各組糞便，混勻后4°C保存。每組各取lg，加 入10mL自來水進行10倍稀釋，經充分攪拌均勻后，使用400目濾網研磨并過濾除去大的糞便 顆粒。取充分混勻的濾液l〇yL滴與載玻片上，在低倍鏡下記數10yL稀釋液中球蟲卵囊總數， 根據公式(〇PG =球蟲卵囊總數X104)計算0PG和保護率。結果表明：與PBS-II組相比，蛋白 質EtMIC2，EtMIC2-1130免疫組卵囊排出量均顯著降低，變異蛋白質EtMIC2-1130組在克糞 便卵囊數方面與天然蛋白EtMIC2組相比，卵囊數降低差異顯著。
[0057] 四、計算抗球蟲指數(ACI):具體方法如下：
[0058] 按美國Merck公司公式:ACI = (存活率+相對增重率）X100 -（病變值+卵囊值）。根 據ACI來判定抗球蟲的療效;ACI蘭120為無效，120〈ACI蘭160為中等有效，160〈ACI蘭180為 良好，ACI>I80為優秀。結果顯示：未突變EtMIC2蛋白質免疫組的ACI為137.92，具有中等的 抗球蟲保護效果，突變體EtMIC2-l 130蛋白質免疫組的ACI為168.17，比未突變EtMIC2蛋白 免疫組高約21.94%，具有良好的抗球蟲效果。
【主權項】
1. 一種雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋-2突變體，其特征在于，該突變體命名為EtMIC2-1130,其核苷酸序列如Seq ID No:l所示，其編碼的氨基酸序列如Seq ID No:2所示。2. 權利要求1所述雞柔嫩艾美爾球蟲微線蛋-2突變體作為疫苗在抵抗雞柔嫩艾美爾球 蟲感染上的應用。
【文檔編號】C07K14/455GK106046137SQ201610393266
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月3日
【發明人】趙孝民, 陳正濤, 韓林臻, 李宏梅, 王方昆
【申請人】山東農業大學