一種絲素蛋白的溶解方法
【專利摘要】本發明涉及一種絲素蛋白的溶解方法，將絲素與溶劑在冷凍溫度混合，并保持冷凍一定時間，再在室溫下解凍；循環冷凍?解凍2?6次即得到絲素蛋白溶液；所述溶劑為氫氧化鈉/尿素、氫氧化鈉/硫脲、氫氧化鋰/尿素或者氫氧化鋰/硫脲的水溶液。本發明通過冷凍?解凍法低溫溶解絲素蛋白，制備的絲素蛋白溶液濃度為8wt％～20wt％。本發明可用于制備纖維、凝膠、膜、纖維支架、組織工程支架等材料。
【專利說明】
一種絲素蛋白的溶解方法
技術領域
[0001]本發明屬絲素蛋白溶液制備技術領域，涉及一種絲素蛋白的溶解方法，特別是涉及一種低溫溶解得到絲素蛋白溶液的方法，具體是一種循環冷凍-解凍法溶解得到絲素蛋白溶液的方法。
【背景技術】
[0002]蠶絲是人類最早開始利用的動物纖維之一，憑借其亮麗色澤、透氣、吸濕、手感佳等優點，受到人類的青睞。隨著不斷深入地研究，人們對其開發利用的方面也不斷拓寬，逐漸延伸到食品發酵、生物制藥、環境保護、能源利用等領域。
[0003]Camille等(Camille D,George ff M.Method of making silk products[P].USPatent: 1936753，1933-11-28.)采用無機強酸溶解絲素，雖然可以完全降解絲素，但是反應條件激烈，對氨基酸破壞嚴重，水解程度難以控制，對人體有危害，不可用于生物醫用方面。董鳳春等(董鳳春，潘志娟，賈永堂.栗蠶絲素的溶解性研究[J].絲綢，2007,5(1):21-3.)和陶俊逸等(陶俊逸，邵駿驊，張海萍，鄧連霞，朱良均.蠶絲蛋白制備方法的研究.[J].蠶桑通報，2012,43(3):18-21.)使用氫氧化鈉溶解蠶絲，反應溫度較高，而且得到的絲素蛋白的分子量較小。還有一些科研人員使用酶溶解絲素，雖然水解條件溫和，但是酶具有專一性，而且會使絲素發生水解(陳杰.天然絲素蛋白的酶水解研究[D].蘇州;蘇州大學，2001.)。目前常用的為鹽及鹽醇溶解體系，主要有40%的氯化鈣(CaCl2)溶液(田三德，解尚云，潘婕.絲素蛋白的制備與脫鹽研究[J].食品科技，2006，I，117-20.); 60°C時濃度為9.3mol/L的溴化裡(LiBr)溶液(Lock,R L.Process for making silk fibroin fibers[P].US Patent:5252285,1993-10-20.);摩爾比為1:2:8的氯化鈣-乙醇-水三元溶解體系(Li M Z,Zhang C
S,Lu S Z,et al.Study on porous silk fibroin materials:3.1nfluence of repeatedfreeze-thawing on the structure and properties of porous silk fibroinmaterials[J].Polymers for Advanced Technologies，2002，13(8): 605-10.)。使用氯化鈣溶液溶解絲素時，絲素的肽鍵會受到一定程度的破壞，隨著煮沸時間的延長，絲素的分子量明顯降低。Wang等(Wang Q1Chen Q1Yang Y,et al.Effect of Var1us Dissolut1nSystems on the Molecular Weight of Regenerated Silk Fibroin[J].B1macromolecules,2013,14(1):285-89.)對比了溴化鋰和氯化I丐/乙醇/水三元體系的溶解效果，結果顯示溴化鋰對絲素蛋白的降解力度更小。Cho等(Cho H J，Ki C S，0h H,etal.Molecular weight distribut1n and solut1n properties of silk fibroinswith different dissolut1n condit1ns[J].1nternat1nal Journal of B1logicalMacromolecules ,2012,51(3): 336-41.)采用凝膠色譜法測絲素蛋白溶液的分子量分布，結果顯示絲素蛋白溶液的分子量比較高。但是，溴化鋰的價格較貴、有毒性。此外，這些體系溶解得到的絲素蛋白分子量降解較大，主要分布在10萬以下，不利于后續制品，如絲、膜、凝膠、纖維支架、組織工程支架的性能。
【發明內容】
[0004]本發明的目的是提供一種絲素蛋白的溶解方法，特別是提供一種低溫溶解得到絲素蛋白溶液的方法，具體是提供一種循環冷凍-解凍法溶解得到絲素蛋白溶液的方法。本發明低溫溶解絲素蛋白后的溶液可用于制備絲、凝膠、膜、纖維支架、組織工程支架等材料。
[0005]本發明的一種絲素蛋白的溶解方法，將絲素與溶劑在冷凍溫度混合，并保持冷凍一定時間，再在室溫下解凍;循環冷凍-解凍2-6次即得到絲素蛋白溶液；
[0006]所述溶劑為氫氧化鈉/尿素、氫氧化鈉/硫脲、氫氧化鋰/尿素或者氫氧化鋰/硫脲的水溶液；
[0007]所述冷凍溫度為-20?_10°C。
[0008]作為優選的技術方案:
[0009]如上所述的一種絲素蛋白的溶解方法，所述保持冷凍一定時間是指在-20?-10°C保持3?5小時。
[0010]如上所述的一種絲素蛋白的溶解方法，所述混合時，伴以攪拌。
[0011 ]如上所述的一種絲素蛋白的溶解方法，所述解凍時，伴以攪拌。
[0012]如上所述的一種絲素蛋白的溶解方法，所述絲素與溶劑的質量比為3?10:100。
[0013]如上所述的一種絲素蛋白的溶解方法，所述溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為6wt%?25wt%，尿素的濃度為15wt%?30wt% ;所述溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為9wt%?25wt%，硫脲的濃度為2wt%?13wt% ;所述溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt %?15wt %，尿素的濃度為15wt %?30wt % ；所述溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt %?15wt %，硫脲的濃度為3wt%?15wt%。
[0014]本發明又提供了一種溶解絲素蛋白的溶劑，所述溶劑為氫氧化鈉/尿素、氫氧化鈉/硫脲、氫氧化鋰/尿素或者氫氧化鋰/硫脲的水溶液。
[0015]如上所述的一種溶解絲素蛋白的溶劑，所述溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為6wt%?25wt%，尿素的濃度為15wt%?30wt% ;所述溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為9wt%?25wt%，硫脲的濃度為2wt%?13wt% ;所述溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt %?15wt %，尿素的濃度為15wt %?30wt % ；所述溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt %?15wt %，硫脲的濃度為3wt%?15wt%。
[0016]本發明還提供了一種采用上述溶解方法制得的溶液經靜電紡絲得到的再生絲素蛋白纖維支架，所述再生絲素蛋白纖維支架的拉伸強度為3?12MPa，斷裂伸長率為2?6 %，孔徑分布均勻，孔隙率為58?85%，通過在纖維支架上面培養細胞發現細胞在上面粘附比較牢固，說明其生物相容性較好。
[0017]如上所述的再生絲素蛋白纖維支架，所述靜電紡絲用的絲素蛋白溶液經過離心、抽濾、透析和濃縮后使用。本發明將溶解得到的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到25wt%?35的％時，再使用靜電紡絲設備進行紡絲，紡絲電壓為15?25kV，紡絲速率為0.5?1.2mL/h，噴絲頭至接收板的距離為8?15cm，紡出絲素蛋白纖維支架后，將其放置在體積分數為80?90%的乙醇水溶液中后處理25?35min，室溫下放置至干燥，最終得到絲素蛋白纖維支架。
[0018]本發明還提供了一種采用上述溶解方法制得的溶液經過濕法紡絲得到再生絲素蛋白纖維的方法，所述再生絲素蛋白纖維經過后處理后的拉伸強度為150?250MPa，斷裂伸長率為30?55%。
[0019]如上所述的再生絲素蛋白纖維，所述的濕法紡絲是以乙醇水溶液為凝固浴，將離心、抽濾、透析和濃縮后的絲素蛋白溶液，采用濕法紡絲得到纖維單絲。本發明將溶解得到的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，透析后將其濃縮到絲素蛋白濃度為12?30wt%，以乙醇水溶液為凝固浴，使用濕法紡絲裝置得到再生絲素蛋白纖維。
[0020]本發明還提供了一種采用上述溶解方法制得的溶液經過澆注法得到的再生絲素蛋白膜，所述再生絲素蛋白膜的拉伸強度為5?7MPa，斷裂伸長率為15?23%，親水性較好。
[0021]如上所述的再生絲素蛋白膜，所述的澆注法使用的絲素蛋白溶液經過離心、抽濾和濃縮后使用。本發明將溶解得到的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將其倒入特定模具中，室溫條件下放置18?30h干燥成膜，將絲素蛋白膜從模具中剝離，在干燥器中繼續干燥40?50h后剪裁成為所需形狀，再在體積分數為80?90%的乙醇中浸泡處理25?35min，室溫下放置至干燥，即可得到再生絲素蛋白膜。
[0022]本發明還提供了一種采用上述溶解方法制得的溶液制備成為凝膠，所述凝膠的壓縮強度達到2.5?3.5KPa，且藥物在其中的釋放效果較好。
[0023]如上所述的再生絲素蛋白凝膠，所述的絲素蛋白溶液經過離心、抽濾、透析和濃縮后使用。本發明將溶解得到的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到8?七％?14的％時，放入保鮮膜封口的燒杯中，在16?24°C下放置6?Sd即可得到凝膠。
[0024]本發明還提供了一種采用上述溶解方法制得的溶液經冷凍干燥得到的再生絲素蛋白組織工程支架材料，所述的再生絲素蛋白組織工程支架材料的壓縮率為6%?30%，平均孔徑為30?20(^111，孔隙率為35%?45%。
[0025]本發明將溶解得到的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到絲素蛋白濃度為25wt%?35界丨％時，放置在-20?-30°C條件下冷凍3?6h，再將冷凍干燥樣品放入臺式冷凍干燥機在-45?-55°C下，干燥24?36h后取出，再進行乙醇水溶液后處理，晾干后即可得到組織工程支架。
[0026]由于單次溶解，溶液溶解的絲素蛋白的量有限，為了后續制品制備過程中更快地濃縮到要求濃度，所以采用循環溶解方法，以溶解更多的絲素蛋白。
[0027]氫氧化鈉/尿素、氫氧化鈉/硫脲、氫氧化鋰/尿素或者氫氧化鋰/硫脲作為無衍生物生成的溶解體系可以打破絲素的分子內和分子間氫鍵，且阻止絲素大分子的相互靠近，從而使得絲素大分子良好分散形成溶液。
[0028]含有Li+或Na+的溶劑分子具有相對較小的離子半徑和較強的電荷密度，Li+或Na+與水緊密結合可以形成穩定的、體積較大的水合離子。通常，0H—以[OH(H2O)n]—的水合離子形式存在于NaOH/L1H溶液中，Na+以[Na(H2O)m] +的水合離子形式存在于NaOH溶液中。室溫下，自由水和結晶水之間的快速轉化使[OH(H2O)n]—和[Na(H2O)m]+很難維持在穩定結構。然而，低溫下自由水和結晶水之間較低的轉化速度使絡合離子能夠維持穩定的結構。因此，絲素-NaOH-尿素體系在-20?-10°C (非常接近于溶解體系的恪點)下，[0Η(Η20)η]—和[Na(H2O)m]+水合離子更易與絲素分子鏈的羥基相連，形成氫鍵配體絡合物，并穩定在羥基周圍，從而導致絲素分子內和分子間氫鍵的斷裂。其中，分子間氫鍵的解離會使不溶于水的β-折疊片層結構轉變為水溶性的α_螺旋結構或無規線團結構;分子間氫鍵的解離會使水溶性的α-螺旋結構轉變為同樣為水溶性的無規線團結構。因此，氫鍵的解離使絲素分子得以溶解。
[0029]雖然，在絲素的溶解過程中，NaOH/L1H破壞了絲素分子間和分子內的氫鍵，使絲素分子鏈彼此分開，同時也導致絲素分子疏水部分暴露在溶劑中。絲素分子這些疏水部分的聚集容易使絲素分子間的氫鍵再次重構，再次轉變為非水溶性的折疊片層結構。此時，尿素或者硫脲分子在絲素疏水部分組裝，減少了絲素分子疏水部分直接與溶劑接觸，使得絲素疏水端自聚集的傾向減小。尿素/硫脲再和NaOH/L1H結合，形成以尿素/硫脲為殼，包含絲素-NaOH/L1H的蠕蟲狀包合物，此包合物在阻止絲素分子自聚和維持溶液的穩定性方面起了重要作用，使絲素溶解能力更強，得到的溶液更穩定，更不易于凝膠。
[0030]上述溶解過程中，單次溶解絲素的量較少，為了溶解較多的絲素，需采用循環冷凍-解凍溶解方法。
[0031 ]本發明的再生絲素蛋白組織工程支架材料的制備過程用到了冷凍干燥，該冷凍干燥的冷凍是不同于本發明的循環冷凍-解凍過程進行溶解中的冷凍的:冷凍干燥是在水溶液的冰點以下進行的，在該溫度下液態水轉化成固態冰，然后在真空下固態冰直接升華而除去。絲素與NaOH/L1H、尿素/硫脲水溶液的混合物在冷凍干燥溫度下為固態，溶液中的水變為固態冰，無法和Na+/Li+形成水合離子，從而無法和絲素的羥基作用，絲素的鏈段無法運動，其分子內和分子間的氫鍵不會發生解離和重構。因此，在冷凍干燥過程中，該溶液不會溶解絲素蛋白。有益效果:
[0032]本發明采用多組分溶劑低溫溶解絲素蛋白，后續制品的性能較好。此外，溶解過程是物理過程，廢液容易回收循環使用。對設備的要求比較低，可行性高。本發明以氫氧化鈉、尿素、硫脲和水為原料，價格十分便宜，操作簡單方便，對環境無污染。因此具有明顯的創新和廣闊的用途。
【具體實施方式】
[0033]下面結合【具體實施方式】，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
[0034]本發明的一種溶解絲素蛋白的溶劑，為氫氧化鈉/尿素、氫氧化鈉/硫脲、氫氧化鋰/尿素或者氫氧化鋰/硫脲的水溶液。
[0035]所述溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為6wt%?25wt%，尿素的濃度為15wt%?30wt% ；
[0036]所述溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為9wt %?25wt %，硫脲的濃度為2wt%?13wt% ；
[0037]所述溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt%?15wt%，尿素的濃度為15wt%?30wt% ；
[0038]所述溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt %?15wt %，硫脲的濃度為3wt%?15wt%。
[0039]實施例1
[0040]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為3:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-200C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液，氫氧化鈉的濃度為6wt%，尿素的濃度為15wt%;并在-20°C下保持冷凍3小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍2次得到濃度為8wt%的絲素蛋白溶液。
[0041 ]再生絲素蛋白纖維支架的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的
2.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到25wt%時，再使用靜電紡絲設備進行紡絲，紡絲電壓為15kV，紡絲速率為0.5mL/h，噴絲頭至接收板的距離為8cm，紡出絲素蛋白纖維支架后，將其放置在體積分數為80 %的乙醇水溶液中后處理30min，室溫下晾干，最終得到絲素蛋白纖維支架。
[0042]再生絲素蛋白纖維支架的拉伸強度為12MPa，斷裂伸長率為2%，孔徑分布均勻，孔隙率為58%，通過在纖維支架上面培養細胞發現細胞在上面粘附比較牢固，生物相容性較好。
[0043]實施例2
[0044]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為10:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為_1 0C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液，氫氧化鈉的濃度為9wt %，硫脲的濃度為并在-10°C下保持冷凍5小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍6次得到濃度為20被％絲素蛋白溶液。
[0045]再生絲素蛋白纖維支架的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到35wt %時，再使用靜電紡絲設備進行紡絲，紡絲電壓為25kV，紡絲速率為1.2mL/h，噴絲頭至接收板的距離為15cm，紡出絲素蛋白纖維支架后，將其放置在體積分數為90 %的乙醇水溶液中后處理25min，室溫下晾干，最終得到絲素蛋白纖維支架。
[0046]再生絲素蛋白纖維支架的拉伸強度為lOMPa，斷裂伸長率為6%，孔徑分布均勻，孔隙率為85%，通過在纖維支架上面培養細胞發現細胞在上面粘附比較牢固，生物相容性較好。
[0047]實施例3
[0048]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為5:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-150C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt%，硫脲的濃度為并在_15°C下保持冷凍4小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍6次得到濃度為12wt %絲素蛋白溶液。
[0049]再生絲素蛋白纖維支架的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到30wt %時，再使用靜電紡絲設備進行紡絲，紡絲電壓為21kV，紡絲速率為0.8mL/h，噴絲頭至接收板的距離為10cm，紡出絲素蛋白纖維支架后，將其放置在體積分數為90 %的乙醇水溶液中后處理35min，室溫下晾干，最終得到絲素蛋白纖維支架。
[0050]再生絲素蛋白纖維支架的拉伸強度為3MPa，斷裂伸長率為4%，孔徑分布均勻，孔隙率為78%，通過在纖維支架上面培養細胞發現細胞在上面粘附比較牢固，生物相容性較好。
[0051 ] 實施例4
[0052]一種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為8:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-150C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt%，尿素的濃度為15wt%;并在-20°C下保持冷凍3小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍3次得到濃度為18wt %絲素蛋白溶液。
[0053]再生絲素蛋白纖維的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到12wt%時；以體積分數為90 %的乙醇為凝固浴，采用濕法紡絲得到再生絲素蛋白纖維。
[0054]再生絲素蛋白纖維的拉伸強度為150MPa，斷裂伸長率為30%。
[0055]實施例5
[0056]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為7:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-150C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為25wt %，尿素的濃度為30wt%;并在-20°C下保持冷凍4小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍3次得到濃度為15wt %絲素蛋白溶液。
[0057]再生絲素蛋白纖維的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的2.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到30wt %時；以體積分數為80 %的乙醇為凝固浴，采用濕法紡絲得到再生絲素蛋白纖維。
[0058]再生絲素蛋白纖維的拉伸強度為250MPa，斷裂伸長率為55%。
[0059]實施例6
[0060]一種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為6:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-150C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為25wt %，硫脲的濃度為13wt%;并在-20°C下保持冷凍4小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍2次得到濃度為12wt %絲素蛋白溶液。
[0061 ]再生絲素蛋白纖維的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I.2倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到20wt%時；以體積分數為85 %的乙醇為凝固浴，采用濕法紡絲得到再生絲素蛋白纖維。
[0062]再生絲素蛋白纖維的拉伸強度為200MPa，斷裂伸長率為45%。
[0063]實施例7
[0064]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為8:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-150C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為25wt %，尿素的濃度為30wt%;并在-20°C下保持冷凍4小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍3次得到濃度為15wt %絲素蛋白溶液。
[0065]再生絲素蛋白膜的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的1.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;利用澆注法將其倒入特定模具中，室溫條件下放置27h干燥成膜，將絲素蛋白膜從模具中剝離，在干燥器中繼續干燥43h后剪裁成為所需形狀，再在體積分數為80%的乙醇中浸泡處理30min，室溫下放置至干燥，即可得到再生絲素蛋白膜。
[0066]再生絲素蛋白膜的拉伸強度為6.3MPa，斷裂伸長率為17.2%，親水性較好。
[0067]實施例8
[0068]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為6:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-
150C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為15wt %，尿素的濃度為30wt%;并在_15°C下保持冷凍5小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍4次得到濃度為15wt %絲素蛋白溶液。
[0069]再生絲素蛋白膜的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的2.3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;利用澆注法將其倒入特定模具中，室溫條件下放置24h干燥成膜，將絲素蛋白膜從模具中剝離，在干燥器中繼續干燥50h后剪裁成為所需形狀，再在體積分數為85%的乙醇中浸泡處理32min，室溫下放置至干燥，即可得到再生絲素蛋白膜。
[0070]再生絲素蛋白膜的拉伸強度為5MPa，斷裂伸長率為15%，親水性較好。
[0071 ] 實施例9
[0072]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為9:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-
160C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為15wt %，硫脲的濃度為15wt%;并在_15°C下保持冷凍5小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍4次得到濃度為I Owt %絲素蛋白溶液。
[0073]再生絲素蛋白膜的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;利用澆注法將其倒入特定模具中，室溫條件下放置18h干燥成膜，將絲素蛋白膜從模具中剝離，在干燥器中繼續干燥45h后剪裁成為所需形狀，再在體積分數為90%的乙醇中浸泡處理25min，室溫下放置至干燥，即可得到再生絲素蛋白膜。
[0074]再生絲素蛋白膜的拉伸強度為7MPa，斷裂伸長率為23%，親水性較好。
[0075]實施例10
[0076]一種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為4:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-120C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為9wt%，尿素的濃度為25wt%;并在-18°C下保持冷凍3小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍5次得到濃度為13wt %絲素蛋白溶液。
[0077]再生絲素蛋白膜的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的1.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;利用澆注法將其倒入特定模具中，室溫條件下放置28h干燥成膜，將絲素蛋白膜從模具中剝離，在干燥器中繼續干燥48h后剪裁成為所需形狀，再在體積分數為90%的乙醇中浸泡處理35min，室溫下放置至干燥，即可得到再生絲素蛋白膜。
[0078]再生絲素蛋白膜的拉伸強度為6MPa，斷裂伸長率為20%，親水性較好。
[0079]實施例11
[0080]一種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為9:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-16°C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為16wt%，硫脲的濃度為并在-18°C下保持冷凍4小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍6次得到濃度為12wt %絲素蛋白溶液。
[0081]再生絲素蛋白凝膠的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到8wt %時，放入保鮮膜封口的燒杯中，在20°C下放置7d即可得到凝膠。
[0082]凝膠的壓縮強度為2.5KPa，且藥物在其中的釋放效果較好。
[0083]實施例12
[0084]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為7:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-150C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為25wt %，尿素的濃度為30wt%;并在-20°C下保持冷凍4小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍3次得到濃度為15wt %絲素蛋白溶液。
[0085]再生絲素蛋白凝膠的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的2.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到13wt %時，放入保鮮膜封口的燒杯中，在16°C下放置6d即可得到凝膠。
[0086]凝膠的壓縮強度為3.lKPa，且藥物在其中的釋放效果較好。
[0087]實施例13
[0088]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為5:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-180C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為16wt%，硫脲的濃度為并在-18°C下保持冷凍3.5小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍5次得到濃度為16被％絲素蛋白溶液。
[0089]再生絲素蛋白凝膠的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的2倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到14wt %時，放入保鮮膜封口的燒杯中，在24°C下放置Sd即可得到凝膠。
[0090]凝膠的壓縮強度為3.5KPa，且藥物在其中的釋放效果較好。
[0091]實施例14
[0092]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為5:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-18°C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為9wt%，硫脲的濃度為并在-18°C下保持冷凍3.5小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍5次得到濃度為17wt %絲素蛋白溶液。
[0093]再生絲素蛋白凝膠的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到12wt %時，放入保鮮膜封口的燒杯中，在20°C下放置6d即可得到凝膠。
[0094]凝膠的壓縮強度為3KPa，且藥物在其中的釋放效果較好。
[0095]實施例15
[0096]一種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為4:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-13°C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液，氫氧化鈉的濃度為7wt%，尿素的濃度為17wt%;并在-13°C下保持冷凍3小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍2次得到濃度為8wt%的絲素蛋白溶液。
[0097]再生絲素蛋白組織工程支架材料的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的2.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到25wt %時，放置在-25 °C條件下冷凍3h，再將冷凍干燥樣品放入臺式冷凍干燥機-55 °C干燥27h后取出，再進行乙醇水溶液后處理，晾干后即可得到組織工程支架。
[0098]再生絲素蛋白組織工程支架材料的壓縮率為15%，平均孔徑為80μπι，孔隙率為38%。
[0099]實施例16
[0100]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為6:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-180C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為19wt%，硫脲的濃度為18wt%;并在-18°C下保持冷凍3小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍4次得到濃度為I Iwt %絲素蛋白溶液。
[0101 ]再生絲素蛋白組織工程支架材料的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I.2倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到25wt %時，放置在-25 °C條件下冷凍3h，再將冷凍干燥樣品放入臺式冷凍干燥機-50 °C干燥24h后取出，再進行乙醇水溶液后處理，晾干后即可得到組織工程支架。
[0102]再生絲素蛋白組織工程支架材料的壓縮率為6%，平均孔徑為30μπι，孔隙率為35%。
[0103]實施例17
[0104]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為7:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-18 0C時攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為13wt %，尿素的濃度為18wt%;并在-18°C下保持冷凍4.5小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍3次得到濃度為18wt %絲素蛋白溶液。
[0105]再生絲素蛋白組織工程支架材料的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的2.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到35wt %時，放置在-20 0C條件下冷凍3h，再將冷凍干燥樣品放入臺式冷凍干燥機-45 °C干燥36h后取出，再進行乙醇水溶液后處理，晾干后即可得到組織工程支架。
[0106]再生絲素蛋白組織工程支架材料的壓縮率為30%，平均孔徑為200μπι，孔隙率為45%。
[0107]實施例18
[0108]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為5:100的絲素與溶劑，在冷凍溫度為-18 0C時攪拌混合，其中溶劑所述溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為13wt%，硫脲的濃度為并在-14°C下保持冷凍4小時，再在室溫下解凍，解凍時伴以攪拌;循環冷凍-解凍2次得到濃度為16被％絲素蛋白溶液。
[0109]再生絲素蛋白組織工程支架材料的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的I.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;將此溶液透析后濃縮到30wt %時，放置在-30 0C條件下冷凍6h，再將冷凍干燥樣品放入臺式冷凍干燥機-55 °C干燥30h后取出，再進行乙醇水溶液后處理，晾干后即可得到組織工程支架。
[0110]再生絲素蛋白組織工程支架材料的壓縮率為20%，平均孔徑為ΙΟΟμπι，孔隙率為40% ο
[0111]對比實施例1
[0112]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為3:100的絲素與溶劑，在室溫下攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液，氫氧化鈉的濃度為6wt%，尿素的濃度為15wt% ；攪拌溶解后，得到濃度為8wt %的絲素蛋白溶液。
[0113]再生絲素蛋白纖維支架的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的
2.5倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到25wt%時，再使用靜電紡絲設備進行紡絲，紡絲電壓為15kV，紡絲速率為0.5mL/h，噴絲頭至接收板的距離為8cm，紡出絲素蛋白纖維支架后，將其放置在體積分數為80 %的乙醇水溶液中后處理30min，室溫下晾干，最終得到絲素蛋白纖維支架。
[0114]再生絲素蛋白纖維支架的拉伸強度為6MPa，斷裂伸長率為I%，孔徑分布不太均勻，孔隙率為47 %。
[0115]再生絲素蛋白纖維支架的拉伸強度為12MPa，斷裂伸長率為2%，孔徑分布均勻，孔隙率為58%，通過在纖維支架上面培養細胞發現細胞在上面粘附比較牢固，生物相容性較好。
[0116]對比實施例2
[0117]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為8:100的絲素與溶劑，在室溫下攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt%，尿素的濃度為15wt%；攪拌溶解后，得到濃度為18wt %絲素蛋白溶液。
[0118]再生絲素蛋白纖維的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到12wt%時；以體積分數為90 %的乙醇為凝固浴，采用濕法紡絲得到再生絲素蛋白纖維。
[0119]再生絲素蛋白纖維的拉伸強度為120MPa，斷裂伸長率為18%。
[0120]對比實施例3
[0121]—種絲素蛋白溶液的制備方法，將質量比為6:100的絲素與溶劑，在室溫下攪拌混合，其中溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為15wt %，尿素的濃度為30wt % ;攪拌溶解后，得到濃度為15wt %絲素蛋白溶液。
[0122]再生絲素蛋白膜的制備方法，將制得的絲素蛋白溶液體積稀釋到原溶液的2.3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液;利用澆注法將其倒入特定模具中，室溫條件下放置24h干燥成膜，將絲素蛋白膜從模具中剝離，在干燥器中繼續干燥50h后剪裁成為所需形狀，再在體積分數為85%的乙醇中浸泡處理32min，室溫下放置至干燥，即可得到再生絲素蛋白膜。
[0123]再生絲素蛋白膜的拉伸強度為2MPa，斷裂伸長率為6%。
【主權項】
1.一種絲素蛋白的溶解方法，其特征是:將絲素與溶劑在冷凍溫度混合，并保持冷凍一定時間，再在室溫下解凍;循環冷凍-解凍2-6次即得到絲素蛋白溶液； 所述溶劑為氫氧化鈉/尿素、氫氧化鈉/硫脲、氫氧化鋰/尿素或者氫氧化鋰/硫脲的水溶液； 所述冷凍溫度為-20?-10 °C。2.根據權利要求1所述的一種絲素蛋白的溶解方法，其特征在于，所述保持冷凍一定時間是指在-20?-10°C保持3?5小時。3.根據權利要求1所述的一種絲素蛋白的溶解方法，其特征在于，所述混合時，伴以攪拌;所述解凍時，伴以攪拌。4.根據權利要求1所述的一種絲素蛋白的溶解方法，其特征在于，所述絲素與溶劑的質量比為3?10:100。5.根據權利要求1所述的一種絲素蛋白的溶解方法，其特征在于，所述溶劑為氫氧化鈉和尿素的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為6wt %?25wt %，尿素的濃度為15wt %?30wt % ;所述溶劑為氫氧化鈉和硫脲的水溶液時，氫氧化鈉的濃度為9wt%?25wt%，硫脲的濃度為2wt%?13wt% ;所述溶劑為氫氧化鋰和尿素的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt%?15wt% ,尿素的濃度為15wt%?30wt% ；所述溶劑為氫氧化鋰和硫脲的水溶液時，氫氧化鋰的濃度為6wt%?15wt%，硫脲的濃度為3wt%?15wt%。6.—種采用權利要求1?5中任一溶解方法制得的溶液經靜電紡絲得到的再生絲素蛋白纖維支架，其特征是:所述再生絲素蛋白纖維支架的拉伸強度為3?12MPa，斷裂伸長率為2?6%，孔徑分布均勻，孔隙率為58?85%，生物相容性較好;所述靜電紡絲用的絲素蛋白溶液經過離心、抽濾、透析和濃縮后再進行使用； 所述靜電紡絲過程為將透明的絲素蛋白溶液透析后濃縮到25的％?35的％時，再使用靜電紡絲設備進行紡絲，紡絲電壓為15?25kV，紡絲速率為0.5?1.2mL/h，噴絲頭至接收板的距離為8?15cm，紡出絲素蛋白纖維支架后，將其放置在體積分數為80?90 %的乙醇水溶液中后處理25?35min，室溫下放置至干燥，最終得到絲素蛋白纖維支架。7.—種采用權利要求1?5中任一溶解方法制得的溶液經濕法紡絲得到的再生絲素蛋白纖維，其特征是:所述再生絲素蛋白纖維的拉伸強度為150?250MPa，斷裂伸長率為30?55% ； 所述濕法紡絲是將溶解得到的絲素蛋白溶液稀釋為原溶液體積的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，將此溶液透析后濃縮到得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到絲素蛋白濃度為12?30wt%，以乙醇水溶液為凝固浴，進行濕法紡絲得到再生絲素蛋白纖維。8.—種采用權利要求1?5中任一溶解方法制得的溶液經澆注法得到的再生絲素蛋白膜，其特征是:所述再生絲素蛋白膜的拉伸強度為5?7MPa，斷裂伸長率為15?23%，親水性較好； 所述的澆注法，將溶解得到的絲素蛋白溶液稀釋為原溶液體積的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將其倒入模具中，室溫條件下放置18?30h干燥成膜，將絲素蛋白膜從模具中剝離，在干燥器中繼續干燥40?50h后剪裁成為所需形狀，再在體積分數為80?90 %的乙醇中浸泡處理25?35min，室溫下放置至干燥，即得到再生絲素蛋白膜。9.一種采用權利要求1?5中任一溶解方法制得的溶液制成的凝膠，其特征是:凝膠的壓縮強度達到2.5?3.5KPa，且藥物在其中的釋放效果較好； 凝膠制備過程為:將溶解得到的絲素蛋白溶液稀釋為原溶液體積的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，再經透析后濃縮到8被％?14的％時，放入保鮮膜封口的燒杯中，在16?24°C下放置6?Sd即得到凝膠。10.—種采用權利要求1?5中任一溶解方法制得的溶液經冷凍干燥制得的再生絲素蛋白組織工程支架材料，其特征是:所述的再生絲素蛋白纖維支架的壓縮率為6%?30%，平均孔徑為30?200μπι，孔隙率為35%?45% ； 制備過程為:將溶解得到的絲素蛋白溶液稀釋為原溶液體積的I?3倍后進行離心，再進行抽濾，得到透明的絲素蛋白溶液，將此溶液透析后濃縮到絲素蛋白濃度為25wt%?35界丨％時，放置在-20?-30°C條件下冷凍3?6h，再將冷凍干燥樣品放入臺式冷凍干燥機在-45?-55°C下，干燥24?36h后取出，再進行乙醇溶液后處理，晾干后即可得到組織工程支架。
【文檔編號】C08L89/00GK106046133SQ201610345215
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】張耀鵬, 牛欠欠, 邵惠麗, 胡學超, 錢盈, 李艾琳, 王冰芳
【申請人】東華大學