一種檸檬苦素類化合物及其制備方法

一種檸檬苦素類化合物及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種檸檬苦素類化合物及其制備方法。該化合物為首次報道，是一種結構新穎的檸檬苦素類化合物，可以從干燥的枳殼中提取、分離純化得到。本發明化合物(Ⅰ)經體外試驗證明能夠抑制腎癌細胞增殖，并且抑制呈濃度及時間依賴性。而且本發明化合物(Ⅰ)用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用，可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者，可制成多種形式的藥物進行使用，其應用范圍較廣。
【專利說明】
一種檸檬苦素類化合物及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于藥物技術領域，具體涉及從干燥的枳殼中分離得到的一種檸檬苦素類 化合物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 枳殼為蕓香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培變種的干燥未成熟果 實。7月果皮尚綠時采收，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥。味苦、辛、酸。性微寒。歸脾、 胃經。具有理氣寬中，行滯消脹之功效。用于胸脅氣滯，脹滿疼痛，食積不化，痰飲內停，臟器 下垂。枳殼是中藥典型的理氣藥之一，廣泛應用于中醫臨床。
[0003] 枳殼所含化學成分較為復雜，目前已知的有效成分主要有黃酮類、揮發油類、生物 堿類、香豆素類和一些微量元素等。枳殼中黃酮類成分主要有:橙皮苷、新橙皮苷、柚皮苷、 柚皮蕓香苷、異柚皮苷、陳皮素、柚皮素、川陳皮素、紅橘素、去甲基川陳皮素、去甲川陳 皮素、橙黃酮、4'，5,7,8_四甲氧基黃酮、4-0-甲基黃芩素、3-羥基_3'，4'，5,6,7,8_六甲氧 基黃酮和5，6-二羥基-7，4 二甲氧基黃酮等。揮發油主要有檸檬烯、芳樟醇、2-十一烷酮、 γ-松油烯。枳殼中所含的生物堿類活性成分主要有辛弗林、N-甲基酪胺、酪胺、大麥芽堿 等。枳殼中所含的香豆素類成分主要有葡萄內酯、傘形花內酯、異前胡素、馬明丙酮化合物、 潑朗弗林、異米拉素、花椒毒酚、5-異戊烯氧基線呋喃香豆素、5-甲氧基線呋喃香豆素等。
[0004] 枳殼中的橙皮苷具有抗炎、抗氧化、抗癌和保肝等作用；柚皮苷具有抗炎鎮痛、降 血糖等作用；川陳皮素具有抗炎，抗病毒，抗氧化等藥理作用；川陳皮素具有很好的抗腫瘤 的作用；柚皮素具有抗抑郁、保肝、抗氧化、改善大鼠學習記憶障礙、抗血小板聚集的作用。 枳殼揮發油的主要成分是檸檬烯。在臨床上，檸檬烯膠囊已上市，主要用于膽囊炎、膽管炎、 膽結石和膽道術后綜合征等的治療。在枳殼揮發油中，另一重要成分為芳樟醇，具有防腐、 抗菌、抗病毒和鎮靜等作用。

【發明內容】

[0005] 本發明的目的是提供一種從干燥的枳殼中分離得到的一種檸檬苦素類化合物及 其制備方法。
[0006] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0007] -種檸檬苦素類化合物，具有下述結構式的化合物(I)，
[0009]所述的化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)干燥的枳殼粉碎，用70~ 80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正 丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中乙酸乙 酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙醇洗脫12個柱體積， 收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中70%乙醇洗脫物浸 膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80 :1、50:1、30:1、10:1和1:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗 脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1、10:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反 相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10個柱體積洗脫液， 洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。
[0010] 進一步地，步驟(a)中，用75%乙醇熱回流提取，合并提取液。
[0011] 進一步地，所述大孔樹脂為AB-8型大孔吸附樹脂。
[0012] 本發明化合物用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使用。本發明 的化合物以組合物的形式作為藥物組合物時，該藥物組合物中含有治療有效量的本發明化 合物(I)，其余為藥物學上可接受的、對人和動物無毒和惰性的可藥用載體和/或賦形劑。
[0013] 所述的可藥用載體或賦形劑是一種或多種選自固體、半固體和液體稀釋劑、填料 以及藥物制品輔劑。將本發明的藥物組合物以單位體重服用量的形式使用。本發明藥物可 通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者。用于口服時，可將其制成片劑、緩釋片、控 釋片、膠囊、滴丸、微丸、混懸劑、乳劑、散劑或顆粒劑、口服液等;用于注射時，可制成滅菌的 水性或油性溶液、無菌粉針、脂質體或乳劑等。
[0014] 與現有技術相比，本發明的有益效果體現在：
[0015]本發明化合物（I)經體外試驗證明能夠抑制腎癌細胞增殖，并且抑制呈濃度及時 間依賴性。而且本發明化合物（I)用作藥物時，可以直接使用，或者以藥物組合物的形式使 用，可通過口服或注射的形式施用于需要治療的患者，即可制成多種形式的藥物進行使用， 其應用范圍較廣。
【附圖說明】
[0016]圖1為化合物(I)結構式；
[0017]圖2為化合物（I)理論E⑶值與實驗E⑶值比較。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0019] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0020] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0021] 制備方法：（a)將干燥的枳殼(8kg)粉碎，用75 %乙醇熱回流提取(25L X 3次），合并 提取液，濃縮至無醇味(3L)，依次用石油醚(3LX3次）、乙酸乙酯（3LX3次)和水飽和的正丁 醇(3LX3次)萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物(347g)和正丁醇萃取物；（b)步 驟(a)中乙酸乙酯萃取物用AB-8型大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70% 乙醇洗脫12個柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏（129g);(c) 步驟(b)中70%乙醇洗脫浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1(8個柱體積）、50:1(8 個柱體積）、30:1(6個柱體積）、10:1(8個柱體積)和1:1(5個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4(31g)用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為15:1 (8個柱體積）、10:1(10個柱體積)和5:1(6個柱體積）的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組 分；（e)步驟（d)中組分2(14g)用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為 70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8-10個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物 (I)(48mg)〇
[0022] 結構確證:無色晶體（甲醇），冊43頂3顯示[1+他]+為111/2 523.2314，結合核磁特 征可得分子式為C28H36〇8，不飽和度為11。核磁共振氫譜數據δΗ(ρρηι，DMS0_d6，500MHz):H-1 (4.85，d，J = 7.5)，H-2(2.72，dd，J=16.0,7.5)，H-2(3.43，d，J=16.0)，H-5(2.39，d，J = 13.5)，H-6(1.57，d，J = 13.5)，H-6(1.85，t，J=13.5)，H-7(3.33，d，J = 4.5)，H-9(1.96，s)， H-ll(3.78，br，s)，H-12(3.34，d，J = 6.0)，H-14(2.89，s)，H-16(2.41，dd，J=19.0,9.0)，H-16(2.20，dd，J=19.0,9.0)，H-17(4.19，t，J=10.0)，H-18(0.61，s)，H-19(1.41，s)，H-21 (7.45，s)，H-22(6.46，d，J=1.0)，H-23(7.47，t，J=1.5)，H-28(1.22，s)，H-29(1.39，s)，H-30(1.16,8)，7-0!1(4.69，(1，了 = 4.5)，1-(^〇(1.87,8);核磁共振碳譜數據6。(卯111，0130-(1 6， 125MHz):70.7(CH，1-C)，34.5(CH2,2-C)，169.6(C，3-C)，85.1(C，4-C)，38.9(CH，5-C)，27.8 (CH2,6-C)，68.8(CH，7-C)，44.0(C，8-C)，36.2(CH，9-C)，41.7(C，10-C)，70.6(CH，n-C)， 70.1(CH，12-C)，44.0(C，13-C)，57.2(CH，14-C)，220.1(C，15-C)，41.8(CH2，16-C)，34.9 (CH，17-C)，21.1(CH3，18-C)，22.9(CH 3，19-C)，123.3(C，20-C)，140.8(CH，21-C)，111.2(CH， 22-C) ,141.7(CH,23-C), 33.8(CH3,28-0,17.7(CH3,29-C) ,19.3(CH3,30-C) ,169.1(C,1- OAc)，20.3(CH3，l-0Ac);碳原子標記參見圖1。紅外波譜表明該化合物含有羥基(3526CHT 1)， 羰基（1732cm-〇和烯烴（1685cm-〇等基團。1H NMR譜顯示六個甲基信號(δΗΙ · 87，1 ·41，1 · 39， 1.22，1.16,〇.61，各3!1，8)，0型取代的呋喃環0!17.45,8;6.46，(1，了=1.〇!^和7.47，^ = 1.5Hz)，以及一個乙酰氧基[δΗΙ. 87(3Η，s) ]。13C NMR、DEPT和HSQC譜中顯示有28個碳信號， 包括六甲基，三個亞甲基，十一個次甲基（四個含氧碳和三個烯烴碳），以及八個季碳(三個 羰基碳，一個含氧碳和一個烯烴碳）。上述數據表示，該化合物為檸檬苦素類化合物，再結合 不飽和數可知該化合物為五環結構。HMBC譜中，H-1 (δΗ4.85，d，J = 7.5)與C-2 (SC34.5)和兩 個羰基碳[SC169.1(0Ac)和169.6(C-3)]的相關性表明，C-1位連有一個乙酰氧基。HMBC譜中 H-1 與 C-3，C-5 和 C-10，H2-2 與 C-3，Me-28 和 Me-29 與 C-4，Me-19 與 C-1 的相關性表明 A 環為七 元內酯環。HMBC譜中，質子(4.69，d，J = 4.5)與C-7(SC68.8)的相關性表明B環的C-7位連有 一個羥基。此外，兩個含氧碳信號SC70.6(CH，11-C)和70.1(CH，12-C)表明C環存在一個11， 12-環氧基團。HMBC譜中，H-14和H 2-16與酮羰基C-15(SC220.1)的相關性表明D環為五元環。 通過HMBC譜中H-17與C-20，C-21和C-22,以及H 2-16與C-20的相關性可知呋喃環位于C-17位 上。R0ESY 譜中，Η-6β 與 Me-19，Me-19 與 Me-29，Me-19 與 Me-30，Me-30 與 H-7，Me-30 與 H-12 和 H-12 與 H-17 的相關性表明 H-7，H-12，H-17，Me-19，Me-29和Me-30為β構型。此外，H-6α與H-5，H-5與Me-28，H-5與H-9，H-9與H-14，H-14與7-OH，以及H-14與Me-18的相關性表明它們均為α構 型。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和R0ESY譜，以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化 合物如圖1所示，立體構型進一步通過ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致(圖2)。
[0023]實施例2:化合物（I)藥理作用試驗 [0024] -、材料和儀器
[0025] 人腎癌RC-2細胞株購于ATCC細胞庫(美國）。分析純蔗糖購于國藥集團化學試劑公 司。重水(D20)購于青島騰龍微波科技有限公司。1^8、303、30%丙烯酰胺單體、1'冊61120購 于重慶醫科大學基礎研究所實驗室。小牛血清、RPMI-1640購于美國Gibco公司。Centriplus 離心超濾管、Amicon Ultra高回收率高流速切向流超濾離心管（100kD)、PVDF膜購于 Mi 11 ipore公司。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購于上海安亭科學儀器廠。5 X SDS-PAGE蛋白質 上樣緩沖液、BeyoECL熒光檢測試劑、考馬斯亮藍G250、考馬斯亮藍R250購于碧云天生物技 術研究所。化合物（I)自制，HPLC歸一化純度大于98%。鼠抗人批？70單克隆抗體、兔抗人 ICAM-1單克隆抗體、兔抗人G250多克隆抗體購于Sigma公司。兔抗人Survivin多克隆抗體武 漢博士德生物有限公司。
[0026] 超凈工作臺（蘇州華新空調凈化有限公司），自動平衡離心機(上海醫用分析儀器 廠），光學顯微鏡(NIKON，日本），透射電子顯微鏡(LeicaTCS-NT，德國），低溫高速離心機（日 立公司，日本），低溫超高速離心機H-80B(日立公司，日本）。垂直電泳槽、電轉槽(北京六一 廠，中國）。臺式高速離心機、酶標儀(上海安亭科學儀器廠，中國）。96孔培養板(Corning公 司，美國）。凝膠儀、PCR擴增儀(BI0-RAD，美國）。
[0027]二、試驗方法
[0028] 1、MTT檢測化合物（I)不同濃度48h對腎癌細胞株RC-2增殖的影響
[0029]用含10%小牛血清的RPMI-1640培養液(含有0.1 %青霉素、鏈霉素)常規培養人腎 癌細胞株RC-2，根據細胞生長密度1~2天換液一次，3天傳代一次。取對數期生長細胞，按照 如下步驟操作：（1)接種細胞:胰酶消化對數生長期的腎癌RC-2細胞，用含10%小牛血清的 RPMI-1640培養液lmL制成單細胞懸液，混勻后用移液管按照體積100μL7孔，即接種腎癌細 胞數目5 X 103個/孔，加入96孔培養板中。每組細胞設置3個復孔；（2)培養細胞:將培養板小 心置入孵箱中（37 °C、5 % C02)培養3天；（3)處理細胞:分別按空白組(加5yL DMS0液）、0.25、 0.5、0.75、lymol/L化合物（I)處理組分組后加藥處理48h; (4)顯色：在各個時間點，予以每 孔各加入MTT溶液20yL，之后繼續放入孵箱中孵育4h，然后小心把孔內培養液用注射器吸 去;對于當天接種的細胞而言，離心之后（l〇〇〇rpm，5min)，然后將孔內培養液移除。之后把 150yL DMS0加入每孔，使其充分振蕩lOmin后，把結晶物溶解完全；（5)比色:在全自動酶標 儀上檢測各孔在580nm波長下的光密度值[(D580)]，按公式測定細胞活力:D(580)實驗孔/D (580)對照孔 XI00 %。
[0030] 2、MTT檢測0.5μΜ化合物（I)不同時間對腎癌細胞株RC-2增殖的影響
[0031] 接種和處理細胞及顯色和比色步驟同上（1)、（2)、（4)、（5)，處理細胞:分別按空白 組（加5yL DMS0液）、0.5μΜ化合物（I)處理24h、48h、72h分組。
[0032] 3、制備 exosomes
[0033] (1)細胞分組：取6份細胞計數相近的人腎癌RC-2細胞株體外常規培養，其中三份 為對照組（CE)，另外三份為實驗組（CE2)，等細胞呈對數生長時，兩組細胞株按照3 X 106/ 100mL重新傳代至新的培養瓶，嚴格控制每組細胞培養基的體積一致;在實驗組，等細胞培 養48h后加入0.5μΜ的化合物（I)處理細胞48h，之后收集培養上清液各150mL;對照組不加藥 物，加入與實驗組等量的DMS0，48h后收集培養上清液各150mL，置于-20°C冰箱保存；（2)提 取exosomes:培養上清液150mL，300g低溫離心(4°C) 10min去除細胞;800g低溫離心30min獲 取上清l〇〇〇〇g低溫離心30min獲取上清通過100kD MW⑶Centriplus離心超濾管濃縮超濾 (MWC0:分子量截留），以1000g離心30min，得到約20mL超濾液。將超濾液分別移至2mL含30g/ L的蔗糖重水墊的10mL的離心管中，100000g低溫超速離心lh。收集離心管底部的緩沖墊用 PBS稀釋，置于100kD MWC0高回收率高流速切向流超濾離心管中1000g離心30min，得到3mL exosome。。. 22μηι濾膜過濾除菌，_80°C保存備用設置對照組細胞(CE1)來源的exosomes為 EX1 組 exosomes，實驗組細胞(CE2)來源的 exosomes 為EX2 組 exosomes。
[0034] 4、BCA法檢測exosomes蛋白含量
[0035] (1)測定方法:取96孔酶標板，按下表加入試劑并繪制標準曲線：
[0037] 上述試劑加完后，準確吸取10yL樣品溶液于酶標孔中，加入BCA試劑200yL，輕搖， 于37°C保溫30min，冷卻至室溫后，以空白為對照，在酶標儀上562nm處比色，以牛血清白蛋 白含量為橫坐標，以吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。以標準曲線空白為對照，根據樣品的 吸光值從標準曲線上查出樣品的蛋白質濃度；（2)計算方法:exosome濃縮液總蛋白質含量 (mg)=濃縮后的總體積XBCA法測定蛋白質濃度。重復6次實驗，取平均值做統計學分析。 [0038] 5、統計學方法
[0039] 使用軟件GRAGHPAD PRISM 5.0進行圖表制作及統計學分析，計量資料以1±8表 示，比較組間差異使用方差分析或t檢驗。
[0040]三、結果及結論
[0041 ] 1、MTT顯示不同濃度化合物（I)作用腎癌細胞株RC-2后細胞活力變化 [0042] MTT結果顯示當化合物（I)濃度0·75μΜ作用細胞時，細胞活力（71·32±4·68%)與 化合物（I)濃度〇·5μΜ及0·25μΜ作用細胞時細胞組（91.43±2.74%;94.67±1.21%)相比， 差異具有統計學意義(Ρ〈〇. 05)。
[0043] 2、ΜΤΤ顯示0.5μΜ化合物（I)不同時間作用腎癌細胞株RC-2后細胞活力變化 [0044] ΜΤΤ結果顯示當0.5μΜ化合物（I)作用細胞72h組（71.34±1.64%)與作用4811組 (91 ·04±6· 23% )、24h組(94.56± 1 · 13% )對比，細胞活力差異具有統計學意義(Ρ〈0·05)。
[0045] 3、Exosomes計數和蛋白定量
[0046] 電鏡下實驗組(EX2)和對照組(EXl)exosomes計數和exosomes蛋白定量結果:經化 合物（I)處理后，RC-2細胞產生的exosomes數量和exosome蛋白含量較未經藥物處理組都明 顯增加，差異具有統計學意義(P〈〇. 05)。結果見表1。
[0047]結果說明，化合物（I)能夠抑制腎癌細胞株RC-2增殖，這種抑制呈濃度及時間依賴 性。經化合物（I)處理后，透射電鏡觀察腎癌細胞株RC-12源性exosomes形態未見明顯改變， 其分泌量和蛋白含量較處理前明顯增加(P<〇.05)，這些說明化合物（I)對腎癌細胞株RC-12的抑制作用與化合物（I)引起的腎癌細胞RC-2表達野生型p53mRNA上調有關。
[0048] 表1實驗組和對照組分泌exosomes數量及蛋白含量對比
[0050] 實施例3
[0051] 片劑的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重量比為1:9的 比例加入賦形劑，制粒壓片。
[0052] 實施例4
[0053] 口服液制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸檬 酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規口服液制法制成口服 液。
[0054] 實施例5
[0055] 膠囊劑或顆粒劑的制備：按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒 石酸、或檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按其與賦形劑重 量比為1:9的比例加入賦形劑，制成膠囊或顆粒劑。
[0056] 實施例6
[0057] 注射液的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或檸 檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，按常規加注射用水，精濾， 灌封滅菌制成注射液。
[0058] 實施例7
[0059] 無菌粉針的制備:按實施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有機酸如酒石酸、或 檸檬酸或甲酸或乙二酸等、無機酸如鹽酸或硫酸或磷酸制成的鹽，將其溶于無菌注射用水 中，攪拌使溶，用無菌抽濾漏斗過濾，再無菌精濾，分裝于安瓿中，低溫冷凍干燥后無菌熔封 得粉針劑。
[0060] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種檸檬苦素類化合物，其特征在于，具有下述結構式的化合物（I)，2. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將干 燥的枳殼粉碎，用70~80%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙 酸乙酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物； (b)步驟(a)中乙酸乙酯萃取物用大孔樹脂除雜，先用15%乙醇洗脫8個柱體積，再用70%乙 醇洗脫12個柱體積，收集70%乙醇洗脫液，減壓濃縮得70%乙醇洗脫物浸膏；（c)步驟(b)中 70%乙醇洗脫物浸膏用正相硅膠分離，依次用體積比為80:1、50:1、30:1、10:1和1:1的二氯 甲烷-甲醇梯度洗脫得到5個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積 比為15:1、10:1和5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八 烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為70 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集8~10 個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到純的化合物(I)。3. 根據權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，步驟(a)中，用75%乙醇 熱回流提取，合并提取液。4. 根據權利要求2所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，所述大孔樹脂為AB-8型 大孔吸附樹脂。
【文檔編號】A61P35/00GK106046111SQ201610389750
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月2日
【發明人】董秋月
【申請人】杭州更藍生物科技有限公司