一種甘草次酸、阿魏酸和硒代蛋氨酸三元化合物的制備方法及應用
【專利摘要】本發明公開了一種圖1所示新甘草次酸衍生物的制備方法及應用。在甘草次酸30位羧基處引入阿魏酸甲酯；再對其3號位羥基進行結構修飾，引入Boc?L?硒代蛋氨酸；隨后脫掉Boc保護后，得到一種鹽酸鹽形式的甘草次酸衍生物。測定其對2種人乳腺癌MCF?7、MBA?MD?231細胞表現出較好的抑制作用，可以作為抗癌藥物進行進一步的研究與開發。
【專利說明】
一種甘草次酸、阿魏酸和砸代蛋氨酸三元化合物的制備方法 及應用
技術領域
[0001] 本發明屬于醫藥合成及其應用的技術領域，具體涉及一個新的鹽酸鹽形式甘草次 酸衍生物、制備方法及其在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【背景技術】
[0002] 18β-甘草次酸（180_Glycyrrhetinic acid)屬于五環三砲類天然活性化合物，存 在于甘草根莖中，同時甘草所含有的甘草酸在體內代謝會產生甘草次酸。18β_甘草次酸因 其所具有的抗腫瘤、抗炎、抗病毒、抗潰瘍、腎上腺皮質激素樣作用、抗過敏、抗氧化等多種 藥理作用，加之我國甘草資源豐富，已被廣泛應用于臨床，具有非常廣闊的藥用開發前景。 研究發現，甘草次酸具有抗腫瘤活性，對人肝癌、肺癌、胃癌、膀胱癌、乳腺癌、黑色素瘤、白 血病、直腸癌、胰腺癌等多種惡性腫瘤細胞均有一定的抑制效果。以甘草次酸為先導化合 物，對其結構進行修飾得到具有高抗腫瘤活性的新型衍生物越來越受到重視。
【發明內容】
[0003] 本發明首次公開了一個新的鹽酸鹽形式甘草次酸衍生物、制備方法及其在制備抗 腫瘤藥物中的應用。體外活性實驗結果顯示，該化合物對兩種人乳腺癌細胞MCF-7、MBA-MD-231表現出較好的抑制活性。因此，該化合物可進行進一步研究以應用于腫瘤疾病的治療。
[0004] 本發明涉及的新的甘草次酸衍生物，其結構如下圖1所示。
[0005] 太發明i不沸及新的甘苴汝醅衍牛物的制名·方法，其應府路線加下所示"
[0007] 本發明制備方法中，使用薄層硅膠層析法來跟蹤監測反應的完成情況，反應完畢 后采用濃縮、酸洗、柱層析、重結晶等技術進行后處理以得到純的化合物，最終產物采用核 磁共振、質譜等技術來對其進行表征、驗證。
[0008] 本發明還提供了該甘草次酸衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發明得到的鹽 酸鹽形式的甘草次酸衍生物在體外抗腫瘤活性實驗中對兩種人乳腺癌細胞MCF-7、MBA-MD-231表現出較好的抑制活性。
[0009] 本發明抗腫瘤甘草次酸衍生物合成方法的優點在于，通過在天然化合物甘草次酸 的C-30羧基處引入阿魏酸甲酯，再將Boc-L-硒代蛋氨酸引入到3號位羥基處，隨后脫掉Boc 保護后，得到新的鹽酸鹽形式的甘草次酸衍生物。本發明制備方法的反應條件溫和、路線 短、產率高，所用試劑、藥品價格便宜、環境友好。
[0010]本發明通過對甘草次酸進行結構改造，合成得到的衍生物抗腫瘤活性明顯增強。 體外抗腫瘤活性實驗結果表明，該衍生物對兩種人乳腺癌細胞MCF-7、MBA-MD-231表現出較 好的抑制活性，IC5Q值分別為1.88和1.37 μΜ。可作為潛在抗腫瘤藥物進行進一步研究、開 發，用于腫瘤疾病的治療，具有很好的應用前景。
【附圖說明】
[0011]圖1是目標產物甘草次酸、阿魏酸和硒代蛋氨酸三元化合物的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0012]實施例1:阿魏酸甲酯的制備。
[0014] 將0.39 g阿魏酸溶于30 mL甲醇，0 °C滴加幾滴濃H2SO4為催化劑，加熱避光回流12 h。減壓濃縮除掉溶劑后，將殘余物溶于乙酸乙酯，并用5% NaHC03水溶液洗三次。有機相用 無水硫酸鈉干燥后，減壓濃縮后得到阿魏酸甲酯(〇. 41 g，收率99%)。
[0015] 實施例2: Boc-L-硒代蛋氨酸的制備。
[0017] 將0.4 g L-硒代蛋氨酸溶于40 mL二氧六環-水（體積比1:1)溶液，加入0.5 g NaHC03,所得溶液冰浴攪拌20 min，緩慢滴加1.5 eq Boc酸酐的二氧六環溶液，冰浴攪拌1 h后升溫至室溫反應12 h。反應完成后，用乙酸乙酯萃取兩次，保留水相。用1 mol/L的鹽酸 水溶液將水相pH調至1左右，乙酸乙酯萃取兩次，匯總有機相并用無水硫酸鈉干燥，減壓濃 縮即得Boc-L-硒代蛋氨酸(0.6 g，收率98%)，無需進一步純化，可直接用于下一步反應。
[0018] 實施例3: 3β_羥基-11-羰基齊墩果烷-12-烯-30-羧酸-阿魏酸甲酯的制備。
[0019]
[0020] 稱取0.485 g GA溶于40 mL二氯甲烷，冰浴5 min后加入0.23 g EDCI、0.024 g DMAP，繼續冰浴攪拌1 h。加入0.208 g阿魏酸甲酯，繼續冰浴避光反應1 h后，轉為室溫避光 反應12 h。反應完成后，有機相用1M HC1水溶液洗三次，減壓濃縮并使用硅膠柱層析分離純 化(洗脫劑:石油醚-乙酸乙酯），得到白色固體(0.55 g，收率83%)。111? 230~233 °C;咕NMR (400 MHz, CDC13) δ： 0.72-0.74 (m, 1H), 0.83 (s, 3H), 0.90 (s, 3H), 0.96-1.00 (m, 1H), 1.03 (s, 3H), 1.08-1.11 (m, 1H), 1.16 (s, 3H), 1.17 (s, 3H), 1.23-1.25 (m, 1H), 1.27-1.30 (m, 2H), 1.37 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.44-1.45 (m, 1H), 1.46-1.48 (m, 1H), 1.49-1.51 (m, 1H), 1.61-1.63 (m, 1H), 1.65 (dd, / = 13.2, 4.0 Hz, 1H), 1.67-1.68 (m, 1H), 1.70-1.73 (m, 1H), 1.77-1.79 (m, 1H), 1.89 (ddd, /= 14.4, 14.4, 5.2 Hz, 1H), 2.02-2.04 (m, 1H), 2.08-2.10 (m, 1H), 2.12 (dd, /= 13.2, 4.0 Hz, 1H), 2.37 (s, 1H), 2.43-2.45 (m, 1H), 2.80 (ddd, /= 13.2, 3.2, 3.2 Hz, 1H), 3.25 (dd, /= 10.8, 5.6 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 5.73 (s, 1H), 6.42 (d, Jtrans= 12.8 Hz, 1H), 7.02 (d, /= 6.8 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.15 (d, /= 6.8 Hz, 1H), 7.68 (d, Jtrans= 12.8 Hz, 1H); 13C 匪R (100 MHz, CDCh) δ: 200.10， 174.43， 168.44， 166.88， 151.40， 149.95， 147.92, 128.43, 123.12, 121.17, 118.34, 113.48, 109.11, 78.66, 61.63, 55.68, 54.84, 51.64, 48.00, 45.33, 44.37, 43.11, 41.21, 38.04, 38.02, 37.42, 37.06, 32.75, 31.81, 31.13, 28.47, 28.05, 28.04, 27.28, 26.40, 26.35, 23.38, 18.59, 17.44, 16.30, 15.57; ESI-MS: m/z 661.26 [M+H]+〇
[0021] 實施例4:3i3-N-B〇C-L-硒代蛋氨酸酯-11-羰基齊墩果烷-12-烯-30-羧酸-阿魏酸 甲酯的制備。
[0023] 稱取0.15 g Boc-L-硒代蛋氨酸溶于二氯甲烷，冰浴5 min后加入0.125 g EDCI、 0.012 g DMAP，繼續冰浴攪拌1 h。加入0.33 g 3β-羥基-11-羰基齊墩果烷-12-烯-30-羧 酸-阿魏酸甲酯，繼續冰浴避光反應1 h后，轉為室溫避光反應12 h。反應完成后，有機相用1 M HC1水溶液洗三次，減壓濃縮并使用硅膠柱層析分離純化(洗脫劑:石油醚-乙酸乙酯），得 到無色固體(0.36 g，收率80%)。!^ 125~127 °C;咕 NMR (400 MHz, CDC13) δ: 0.82-0.85 (m, 1Η), 0.90 (s, 3H), 0.91 (s, 3H), 0.92 (s, 3H), 1.07-1.11 (m, 1H), 1.14- 1.16 (m, 1H), 1.18 (s, 3H), 1.19 (s, 3H), 1.23-1.25 (m, 1H), 1.27-1.30 (m, 2H), 1.38 (s, 3H), 1.42 (s, 3H), 1.46 (s, 9H), 1.49-1.52 (m, 1H), 1.54-1.56 (m, 1H), 1.58-1.60 (m, 1H), 1.62-1.65 (m, 1H), 1.67 (dd, /= 13.6, 4.4 Hz, 1H), 1.70-1.72 (m, 1H), 1.73-1.76 (m, 1H), 1.77-1.79 (m, 1H), 1.88 (ddd, / = 14.8, 14.8, 5.6 Hz, 1H), 1.89-1.92 (m, 1H), 1.98-2.00 (m, 1H), 2.02 (s, 3H), 2.12 (dd, /= 13.6, 4.4 Hz, 1H), 2.39 (s, 1H), 2.44-2.47 (m, 1H), 2.58-2.61 (m, 2H), 2.83 (ddd, /= 13.6, 2.8, 2.8 Hz, 1H), 3.84 (s, 3H), 3.89 (s, 3H), 4.59 (dd, /= 11.2, 5.2 Hz, 1H), 5.12 (t, /= 8.4 Hz, 1H), 5.73 (s, 1H), 6.42 (d, Jtrans= 16.0 Hz, 1H), 7.02 (d, /= 8.0 Hz, 1H), 7.13 (s, 1H), 7.15 (d, / = 8.0 Hz, 1H), 7.68 (d, Jtrans~ 16.0 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, CDC13) δ: 199.82， 174.40, 171.82, 169.17, 166.85, 154.90, 151.40, 149.94, 145.89, 128.40, 123.02, 121.15, 118.32, 113.49, 109.10, 82.12, 79.72, 61.54, 55.70, 54.97, 52.71, 51.67, 48.02, 45.34, 44.47, 43.15, 41.20, 38.10, 38.06, 37.43, 36.86, 32.65, 32.07, 31.84, 31.15, 29.64, 28.50, 28.27, 28.12, 28.02, 26.41, 26.35, 23.45， 23.30, 18.60， 17.32， 16.75， 16.30， 15.37; ESI-MS: m/z 962.18 [M+Na]+。
[0024]實施例5: 3i3-L_硒代蛋氨酸酯-11-羰基齊墩果烷-12-烯-30-羧酸-阿魏酸甲酯鹽 酸鹽的制備。
[0026] 將0.235 g 3f3-N-Boc-L-硒代蛋氨酸酯-11-羰基齊墩果烷-12-烯-30-羧酸-阿魏 酸甲酯溶于干燥的乙酸乙酯，通干燥的氯化氫氣體15 min，室溫反應12 h，TCL監測。過濾得 到白色固體，干燥的乙酸乙酯重結晶，過濾后得到白色固體(0.17 g，收率81 %) mp 210~213 °C; 4 匪R (400 MHz, DMSO-?) δ: 0.7卜0.74 (m，1H)，0.83 (s，3H)，0.84 (s， 3H), 0.85 (s, 3H), 0.91-0.94 (m, 1H), 1.00-1.04 (m, 1H), 1.07 (s, 3H), 1.08 (s, 3H), 1.12-1.15 (m, 1H), 1.21-1.24 (m, 2H), 1.32 (s, 3H), 1.41 (s, 3H), 1.43-1.45 (m, 1H), 1.49-1.51 (m, 1H), 1.52-1.53 (m, 1H), 1.54-1.57 (m, 1H), 1.63 (dd, /= 13.2, 4.0 Hz, 1H), 1.67-1.69 (m, 1H), 1.71-1.73 (m, 1H), 1.76-1.78 (m, 1H), 1.86 (ddd, /= 14.8, 14.8, 6.0 Hz, 1H), 1.88-1.90 (m, 1H), 1.92-1.93 (m, 1H), 1.94 (s, 3H), 2.28-2.31 (m, 1H), 2.43 (s, 1H), 2.54-2.56 (m, 1H), 2.57-2.59 (m, 2H), 2.64 (ddd, /= 13.2, 3.2, 3.2 Hz, 1H), 3.74 (s, 3H), 3.84 (s, 3H), 4.48 (dd, /= 11.2, 5.2 Hz, 1H), 5.46 (s, 1H), 6.72 (d, Jtrans= 16.0 Hz, 1H), 7.11 (d, /= 8.0 Hz, 1H), 7.33 (dd, /= 8.0, 1.6 Hz, 1H), 7.55 (d, /= 1.6 Hz, 1H), 7.67 (d, Jtrans= 16.0 Hz, 1H); 13C NMR (100 MHz, mSO-de) δ： 199.92, 174.47, 173.82, 169.27, 166.85, 151.40, 149.94, 145.90, 128.42, 123.02, 121.16, 118.32, 113.49, 109.10, 82.42, 61.54, 55.72, 55.00, 52.81, 51.67, 48.02, 45.34, 44.54, 43.15, 41.30, 38.06, 38.00, 37.43, 36.88, 32.65, 32.17, 31.84, 31.28, 29.74, 28.50, 28.27, 28.12, 26.43, 26.36, 23.55, 23.32, 18.71, 17.43, 16.75, 16.34, 15.38; ESI-MS: m/z 840.26 [M+H]+〇
[0027]實施例6:甘草次酸衍生物抗腫瘤活性測定。
[0028]采用MTT法測定合成得到的3i3-L_硒代蛋氨酸酯-11-羰基齊墩果烷-12-烯-30-羧 酸-阿魏酸甲酯鹽酸鹽對2種人乳腺癌細胞MCF-7、MBA-MD-231的抑制率。
[0029] MTT法原理:活細胞中含有琥珀酸脫氫酶，這種酶能夠使MTT還原為水不溶性藍紫 色結晶狀的甲瓚顆粒，這些顆粒堆積在細胞內，而死細胞無此功能。DMS0(二甲基亞楓)能夠 溶解甲瓚，使用酶標儀在570 nm波長下測定其吸光度值，能夠間接反映活細胞的數量。在一 定的細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞數成正比。
[0030] 癌細胞的培養：配置含有10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 U/mL鏈霉素的 RPMI-1640溶液為培養基，將人乳腺癌MCF-7細胞和MBA-MD-231細胞接種于其中并將其置于 37 °C、5% C02的培養箱中進行培養，定時更換培養基。細胞傳代時，棄去培養基，PBS洗兩 次，采用0.25%胰蛋白酶消化法傳代。細胞的生長情況可利用光學顯微鏡觀察得知。
[0031] 抗腫瘤活性測定:取對數生長期，狀態良好的MCF-7細胞和MBA-MD-231細胞，以5 X10 3個/孔的密度接種于96孔板。置于5% C02、37 °C細胞培養箱中培養24 h貼壁后，分別加 入不同濃度待測樣品溶液，每個濃度設3個復孔，以與藥物相同濃度的DMS0為對照組。作用 時間24 h后加 10 yL含MTT(5 mg/mL)的培養基，37°C繼續培養4 h。棄去培養基，每孔加入 200 yL DMS0。待藍紫色的甲瓚顆粒溶解后，用酶標儀在波長570 nm下測定吸光度值(0D)， 每個實驗重復三次，取其平均值，計算各腫瘤細胞的生長抑制率。按照下列公式計算被測物 對腫瘤細胞的生長抑制率： 抑制率=(實驗組平均0D值-對照組平均0D值)/對照組平均0D值X 100% 通過腫瘤細胞的生長抑制率，利用軟件計算得到IC5Q值(半數抑制濃度，即抑制率為 50%所對應的藥物濃度）。
[0032] 甘草次酸及其衍生物對2種人乳腺癌細胞MCF-7、MBA-MD-231的IC5Q值如下表所示。
[0033]由上表可見，相對于甘草次酸(GA)，本發明合成得到的3i3-L_硒代蛋氨酸酯-11-羰 基齊墩果烷-12-烯-30-羧酸-阿魏酸甲酯鹽酸鹽對2種人乳腺癌細胞MCF-7、MBA-MD-231的 抑制均顯著提高，抑制效果分別提高了40.24和61.82倍。
【主權項】
1. 一種甘草次酸、阿魏酸和硒代蛋氨酸三元化合物的制備方法及應用，其特征在于，其 結構如下所示：2. 新的甘草次酸衍生物、制備方法及應用，其特征在于，以甘草次酸為原料，經酯化反 應，在30號位羧基處引入親脂性片段阿魏酸甲酯，再對其3號位羥基進行結構修飾，引入 Boc-L-硒代蛋氨酸，隨后脫掉Boc保護后，得到鹽酸鹽形式的甘草次酸衍生物;所述制備方 法的反應路線如下所示：3. 如權利要求1所述新的甘草次酸衍生物，其特征在于，所述的甘草次酸衍生物對2種 人乳腺癌MCF-7、MBA-MD-231細胞具有很好的抑制作用，可以作為抗癌藥物進行進一步的研 究與開發，用于腫瘤疾病的治療。
【文檔編號】A61P35/00GK106046105SQ201610388449
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】懷其勇, 李陽, 馬慶林
【申請人】山東大學（威海）