一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷Rh4的方法
【專利摘要】本發明公開了一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷Rh4的方法，屬于生物化工領域。該方法包括將三醇組人參皂苷溶解在發酵罐的去離子水中，通N2保護后在線滅菌，然后加有機酸溶液，和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O40·nH2O催化劑，其中Y選自P、Si、Fe或Zn，x為3或4，n為0?30的正整數，N2保護恒溫恒壓進行定向轉化反應，最后收集反應產物進行純化即可得到高純度的人參皂苷Rh4。所得的在線滅菌條件為121℃，維持20min，在線滅菌前通N2保護，添加的有機酸為乳酸、蘋果酸、檸檬酸、α?酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸或丙酮酸中的一種或幾種的組合。本發明工藝簡單易行，副反應少，產物純度高，易于工業化生產。
【專利說明】
一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷Rh4的方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷Rh4的方法，屬于生物化工領域。
【背景技術】
[0002]人參是應用歷史最為久遠的名貴藥用植物，其藥用價值早為世人所公認。人參皂苷作為人參、花旗參、朝鮮參(North Korea ginseng)等五加科人參屬植物的主要活性成分，是由不同糖苷與母環通過苷鍵相連形成的三萜類化合物。由于人參皂苷的結構不同，其表現出的藥理作用和臨床效果也不盡相同。大量的研究表明，人參皂苷具有抗疲勞、延緩衰老、抑制腫瘤細胞生長、調節中樞神經系統、提高機體免疫力、改善心腦血管供血不足等作用，在結抗腫瘤免疫力及抑制腫瘤生長和轉移等方面具有重要的作用，具有很大研究空間。國內外學者已對人參皂苷預防和抑制腫瘤的作用進行了深入的研究，在單體人參皂苷抗癌研究中，報道最多的是20(S)_人參皂苷Rh2，其次是20(S)_人參皂苷Rg3。這兩種人參皂苷從抑制腫瘤血管生成、降低腫瘤微血管密度、誘導腫瘤細胞凋亡、抗腫瘤轉移等方面具有較廣泛的抗腫瘤功效。因此，對于Rh4等人參皂苷及其衍生物的研究具有廣闊的應用前景和潛在市場價值，在治療疾病和保護人們的健康方面起著非常重要的作用。
[0003]人參皂苷是人參的標志性成分，是由皂苷元與糖相聯構成的糖苷類化合物，含量約4%，可通過五加科植物人參、西洋參、三七、假人參、姜狀三七、竹節參等植物提取獲得。從1854年開始，中國、日本、美國、俄國、朝鮮等國家的學者就開始了有關人參皂苷的研究，日本學者北川勛于1980年開始陸續從人參中提取得到了人參皂苷20(R)-Rg3、人參皂苷Rh2，并發現對多種腫瘤細胞有明顯的抑制作用。根據目前對人參皂苷系列化合物的研究結果來看，人參皂苷本身結構含有的糖越少，其抗腫瘤活性越好，因此我們聯想到人參皂苷Rh4等多種去除一定數量糖苷的人參皂苷都會有良好的抗癌效果。經過對人參皂苷相關專利的檢索，查詢到專利CN 103193846 A發明了一種人參皂苷Rk3和人參皂苷Rh4順反異構體的制備方法，涉及人參皂苷Rk3與人參皂苷Rh4順反異構體的分離方法，產量也僅僅達到毫克水平，尚未發現有人參皂苷Rgl為原料定向轉化大規模生產人參皂苷Rh4方法，因為欲得到Rh4等稀有皂苷或皂苷元，通常只有通過降解的辦法才能得以實現。通常降解的方法有光降解、酸催化降解、堿催化降解、酶降解、過碘酸裂解(Smith裂解)、化學修飾降解等方法。而人參皂苷在強酸、強堿溶液中降解，生成較多副產物，且成分很復雜，對于后期化合物的分離提純有一定的影響;酶降解轉化具有專一性，不適用于所有的人參皂苷，而且操作要求嚴格，成本高;而其它降解法過程復雜、成本高、產率低，無法實現大規模生產。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷Rh4的方法。
[0005]本發明的實現過程如下:
一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷Rh4的方法，具體包括如下步驟:在發酵罐中，將三醇組人參皂苷溶解于去離子水中，通犯保護后在線滅菌，然后加有機酸溶液和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，η為0-30的正整數，在70?90 V下反應24?48h，然后靜置收集上清液烘干得到目標產物。
[0006]所述的三醇組人參皂苷的純度大于80%，濃度為50?300g/Lo
[0007]所述的發酵罐裝水量不大于發酵罐有效容積的70%。
[0008]所述的滅菌條件為121°C，維持20min，且加熱前通N2進行保護。
[0009]所述的通N2保護的通氣流速為發酵罐有效容積量的50%/min?200%/min，時間Imin?5min。
[0010]所述的有機酸選自乳酸、蘋果酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸；所述的有機酸的濃度為0.01?0.1mol/L。
[0011 ]上述方法制備的目標產物可以利用工業化色譜柱對目標產物精制純化。
[0012]利用上述方法合成的人參皂苷Rh4原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
[0013]本發明的積極效果:本發明綜合使用有機酸和雜多酸催化劑，催化效果得到大大提升;本發明采用相對溫和的有機酸在生物反應器中的穩定條件下定向轉化得到人參皂苷Rh4，將水溶性良好的三醇組人參皂苷定向轉化為醇溶性(甲醇溶解)的人參皂苷Rh4，轉化率高，收率高，后期精制純化工藝簡單，生產成本低，有利于工業化生產，可顯著提高原料藥及成品藥的市場競爭力。
【附圖說明】
[0014]圖1為人參皂苷Rgl轉化為人參皂苷Rh4的示意圖；
圖2為人參皂苷Rh4標準品的液相色譜圖；
圖3為本發明方法生產得到人參皂苷Rh4的液相色譜圖。
【具體實施方式】
[0015]下面給出的實施例，是為了便于理解本發明。并不以任何方式限定本發明的權利要求和核心內容。
[0016]實施例1
將有效容積為100L的全自動發酵罐中加入65L的去離子水，然后加入3500g純度為85%的人參皂苷Rgl(雜質為其他類型的人參皂苷及多糖)，通％，通氣流量為50L/min，持續5min，然后停止通氣開始加熱在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至90°C以下后，補加濃度為0.15mol/L的無菌檸檬酸溶液5L和1g雜多酸H3PW12O4Q.5H20，然后加熱發酵罐內液體至90 °C并維持48h，同時保持攪拌轉速為200rpm，反應結束后將所有液體放出于容器中靜置12h，收集上清20L并烘干，得到人參皂苷Rh4粗品約3120g，HPLC檢測人參皂苷Rh4的純度為92%。
[0017]對比實例:與上述制備方法類似，不同的是僅使用有機酸或雜多酸，人參皂苷Rh4粗品僅能得到約2000g。
[0018]實施例2
將有效容積為500L的全自動發酵罐中加入300L的去離子水，然后加入90kg純度為95%的人參皂苷Rg2(雜質為其他類型的人參皂苷及多糖)，通％，通氣流量為350L/min，持續4min，然后停止通氣開始在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至90°C以下后，補加濃度為0.8mol/L的無菌蘋果酸溶液20L，濃度為0.6mol/L的無菌丁二酸溶液1L和20g雜多酸H4SiW12O4Q.25H20，然后加熱發酵罐至75°C并維持36h，同時保持攪拌轉速為lOOrpm，反應結束后將所有液體放出靜置于容器中24h，離心，得10L上清，底部約有120L固液混合物，再加入120L去離子水，將底部混合物攪拌均勻后，洗滌一次，再靜置12h后，離心取上清，收集所得液體并烘干，得到人參皂苷Rh4粗品約82kg，HPLC檢測人參皂苷Rh4的純度為93%。
[0019]實施例3
將有效容積為200L的全自動發酵罐中加入120L的去離子水，然后加入28kg純度為90%的人參皂苷Rf(雜質為其他類型的人參皂苷及多糖)，通％，通氣流量為200L/min，持續3min，然后停止通氣開始在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至90°C以下后，補加濃度為0.3mol/L的無菌蘋果酸溶液10L，濃度為0.25mol/L的α-酮戊二酸溶液10L，乳酸225mL和30g雜多酸H3FeW12O4Q.30H20，然后加熱發酵罐至90 °C并維持48h，同時保持攪拌轉速為300rpm，反應結束后將所有液體放出在容器中靜置24h，取上清60L，將剩余底部含有沉淀的液體約40L離心取上清，再加入40L去離子水洗滌一次，將底部混合物攪拌均勻后再靜置24h，離心取上清，收集所有上清并烘干，得到人參皂苷Rh4粗品約24kg，HPLC檢測人參皂苷Rh4的純度為92%。
[0020]實施例4
將有效容積為250L的全自動發酵罐中加入150L的去離子水，然后加入50kg純度為85%的人參皂苷Re(雜質為其他類型的人參皂苷及多糖)，通％，通氣流量為200L/min，持續3min，然后停止通氣開始在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至90°C以下后，補加濃度為0.4mol/L的無菌蘋果酸溶液10L，濃度為0.4mol/L的α-酮戊二酸溶液10L，乳酸250mL和50g雜多酸H3ZnW12O4Q.25H20，然后加熱發酵罐至75°C并維持48h，同時保持攪拌轉速為250rpm，反應結束后將所有液體放出在容器中靜置24h，取上清60L，將剩余底部含有沉淀的液體約50L離心取上清，再加入50L去離子水洗滌一次，將底部混合物攪拌均勻后再靜置12h，離心取上清，收集所有上清并烘干，得到人參皂苷Rh4粗品約41kg，HPLC檢測人參皂苷Rh4的純度為91%。
[0021]實施例5
將有效容積為300L的全自動發酵罐中加入200L的去離子水，然后加入40kg純度為95%的人參皂苷Rhl(雜質為其他類型的人參皂苷及多糖)，通％，通氣流量為200L/min，持續3min，然后停止通氣開始在線滅菌，滅菌條件為121°C，維持20min。降溫至90°C以下后，補加濃度為0.3mol/L的無菌蘋果酸溶液10L，濃度為0.3mol/L的α-酮戊二酸溶液10L，乳酸235mL和1g雜多酸H3PW12O4Q.5H20，然后加熱發酵罐至90°C并維持48h，同時保持攪拌轉速為lOOrpm，反應結束后將所有液體放出在容器中靜置24h，取上清約70L，將剩余底部含有沉淀的液體約60L離心取上清，再加入60L去離子水洗滌一次，將底部混合物攪拌均勻后再靜置24h，離心取上清，收集所有上清并烘干，得到人參皂苷Rh4粗品約38kg，HPLC檢測人參皂苷Rh4的純度為94%。
【主權項】
1.一種利用三醇組人參皂苷大規模轉化生產人參皂苷Rh4的方法，其特征在于:在發酵罐中，將三醇組人參皂苷溶解于去離子水中，通犯保護后在線滅菌，然后加有機酸溶液和催化量的Keggin結構的雜多酸HxYW12O4Q.ηΗ20催化劑，其中Y選自P、S1、Fe或Zn，x為3或4，n為0-30的正整數，在70?90 V下反應24?48h，然后靜置收集上清液烘干得到目標產物。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的三醇組人參皂苷的純度大于80%，濃度為50?300g/Lo3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的發酵罐裝水量不大于發酵罐有效容積的70%。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的滅菌條件為121°C，維持20min，且加熱前通N2進行保護。5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于:所述的通犯保護的通氣流速為發酵罐有效容積量的 50%/min?200%/min，時間 Imin?5min。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述的有機酸選自乳酸、蘋果酸、檸檬酸、 酮戊二酸、丁二酸、反丁烯酸、丙酮酸;所述的有機酸的濃度為0.01?0.lmol/L。7.根據權利要求1至6所述的方法，其特征在于:利用工業化色譜柱對目標產物精制純化。8.利用權利要求1所述的方法合成的人參皂苷Rh4原料藥制成硬膠囊、軟膠囊、片劑、沖劑、滴丸或注射劑。
【文檔編號】A61K9/20GK106046096SQ201610346432
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】范代娣, 惠俊峰, 段志廣, 馬沛, 朱晨輝, 馬曉軒, 李偉娜, 米鈺
【申請人】西北大學