一種頭花蓼中黃酮苷活性組分的制備及應用
【專利摘要】本發明提供一種頭花蓼黃酮苷活性組分的制備方法，通過將頭花蓼粉碎，甲醇浸提，抽濾濃縮，先經硅膠色譜開口柱分離，再通過十八烷基鍵合硅膠開口柱純化獲得，此組分主要成分為五個黃酮苷化合物。本發明建立了抑制疫霉無性孢子囊產生的生物活性系統，并通過該系統，發現這種頭花蓼黃酮苷組分和其中五個黃酮苷化合物均能顯著抑制疫霉無性孢子囊的產生。本發明提供的頭花蓼黃酮苷活性組分可在制備防治植物疫霉病的農藥中應用。本發明制備方法簡單，提取的產物純度高，且頭花蓼為易得便宜的中藥，增加了頭花蓼的藥物用途，為抗疫霉菌農藥的研發奠定了基礎。
【專利說明】
一種頭花蓼中黃酮苷活性組分的制備及應用
技術領域
[0001] 本發明屬醫藥技術領域，涉及花寥中黃酮苷活性組分，尤其涉及花寥中黃酮苷活 性組分的制備方法及在制備抗疫霉病農藥中的應用。
【背景技術】
[0002] 據聯合國數據統計，世界人口正在逐年增加，預計到2050年世界人口將增長到8.9 億，而有效耕地面積在不斷減少，因此需要在較少的耕地面積上生產出更多的食物來避免 大范圍饑餓。在影響作物生產的眾多威脅中，植物病害的發生頻率高、造成的損失也最為嚴 重。其中疫霉菌可引起世界上最具有毀滅性的植物病害，不僅危害農業生產，而且破壞自然 生態系統。另外，化學農藥長期而廣泛的應用使得大多數疫霉菌對許多殺菌劑產生了嚴重 的耐藥性。因此，尋找和發現新的抗疫霉菌活性物質已成為急需解決的問題。
[0003] 目前，抗疫霉菌活性物質的研究主要集中在抑制菌絲生長和游動孢子萌發兩方 面，對具有抑制疫霉菌無性生殖階段孢子囊產生的活性物質的研究極少。而孢子囊的產生 是疫霉菌無性生殖階段的關鍵時期，其產生的游動孢子是疫霉菌蔓延的基礎，因此尋找具 有抑制無性孢子囊產生的天然活性物質，可能會發現新的作用靶點，有助于緩解或解決當 前日益嚴重的耐藥性，推動植物疫病防治藥物的開發與利用。
[0004]頭花寥(Polygonum capitatum)屬于寥科多年生草本植物，是我國著名的藥用植 物。它的藥用價值也已有研究:頭花寥提取物及其在降血糖藥物中的應用;頭花寥提取物在 美白用品中的應用及美白用品；具有抗炎作用的熱淋清顆粒原料頭花寥提取物;具有抗淋 球菌作用的熱淋清顆粒原料頭花寥提取物；用于預防或治療青春痘的頭花寥組合物；用于 治療或預防口腔疾病的頭花寥組合物。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種頭花寥中黃酮苷活性組分，該組分主要包含五個黃酮苷 化合物，所述頭花寥黃酮苷活性組分通過以下步驟制備獲得：
[0006] (1)粉碎和浸提：
[0007] 將頭花寥粉碎后，用工業級甲醇溶液在室溫下浸提2次，每次1天，抽濾濃縮，得甲 醇浸提物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，靜置，將乙酸乙酯層減壓濃縮旋干后，得到乙酸 乙酯層粗樣；
[0008] (2)分離和純化：
[0009] 將乙酸乙酯層粗樣先經硅膠開口柱分離（200-300目，溶劑系統為正己烷：二氯甲 烷、二氯甲烷：乙酸乙酯和甲醇），再進一步通過十八烷基鍵合硅膠開口柱分離(溶劑系統為 甲醇：水），得到兩個黃酮苷活性組分（洗脫體系分別為40%甲醇水溶液和50%甲醇水溶 液），兩個活性組分再分別經十八烷基鍵合硅膠開口柱分離(溶劑系統為甲醇:水），得到較 純的黃酮苷活性組分，然后再分別用反相HPLC純化，流動相為甲醇水溶液，最終得到五個黃 酮苷化合物；五個化合物分別是myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3-〇- iM)-glucopyranoside，quercetin 4 '-Ο-α-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-a-(2''_ galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside〇
[0010] 所述步驟(2)中正己烷:二氯甲烷溶劑系統按體積比為：100:0，90:10，70:30，50: 50，30:70，10:90，0:100;隨后二氯甲烷：乙酸乙酯溶劑系統按體積比為：90:10，70:30，50: 50,30:70,0:100;最后為甲醇。
[0011] 步驟(2)中第一次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統按體積比為： 30:70,35:65,40:60,50:50,60:40,70:30,90:10,100:0。
[0012] 步驟(2)中第二次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統按體積比分 別為：30:70,50:50和30:70,35:65,60:40。
[0013] 步驟(2)中HPLC純化的色譜柱和流動相分別為CAPCELL PAKC18，甲醇:水=38:62 和Develos i 1 C30-UG-5，甲醇：水=48:52 〇
[0014] 本發明的另一個目的是提供所述的黃酮苷活性組分在制備抗疫霉菌農藥中的應 用，所述黃酮苷活性組分主要包括五個黃酮苷化合物。本發明研究發現此活性組分及化合 物在抗疫霉菌化合物的篩選模型中，可以顯著抑制疫霉菌無性孢子囊的產生，從而達到抑 制疫霉菌蔓延的效果。本發明所述藥物是以黃酮苷活性組分或五個黃酮苷化合物為活性成 份，與藥學上可接受的載體或賦形劑制備而成。
[0015] 本發明的藥物劑型選用固體制劑或液體制劑。
[0016] 本發明提供的頭花寥黃酮苷類組分及五個黃酮苷化合物在辣椒疫霉中表現出顯 著的抑制疫霉菌無性孢子囊產生的活性。本發明制備方法簡單，提取的產物純度高，且頭花 寥為易得便宜的中藥，為抗疫霉菌藥物的研發提供基礎性研究，具有重要的現實意義。
【附圖說明】
[0017] 圖1是黃酮苷混合物A2、B2對疫霉菌無性孢子囊產生的抑制作用。
[0018] 圖2是五個黃酮苷化合物對疫霉菌無性孢子囊產生的抑制作用。圖中l:myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，2:quercetin 3-〇-0-D_glucopyranoside，3:quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside，4:quercetin 3_〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside，5:kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside〇
[0019] 圖3是五個黃酮苷化合物抑制疫霉菌無性孢子囊的產生的顯微圖片。圖中a為陰性 對照：0 · 2%DMS0，b為陽性對照：甲霜靈（30yg/mL)，cSmyricetin7-0-a-L-rhamnopyranoside(30yM)d,quercetin 3-〇-0-D-glucopyranoside(3OyM)e,quercetin 4'-〇-a-L-rhamnopyranoside(3yM)f,quercetin 3_〇-a-(2"-ga11oy1)rhamnoside(3yM)g， kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside(10μΜ)〇
【具體實施方式】
[0020] 以下結合附圖和實施例對本發明作進一步的說明。但不應將此理解為本發明上述 主題的范圍僅限于下述的實例，凡基于本發明上述內容所實現的技術均屬于本發明的范 圍。
[0021 ]實施例1從頭花寥中分離提取黃酮苷類組分及五個黃酮苷化合物的制備方法 [0022] (1)粉碎和浸提：
[0023] 取250g干燥的頭花寥粉碎后，用2.5L甲醇(工業級)室溫下浸提2次，每次1天，抽濾 濃縮，得甲醇浸提物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，靜置，將乙酸乙酯層減壓濃縮旋干后， 得到乙酸乙酯層粗樣9g。
[0024] (2)分離和純化：
[0025]將乙酸乙酯層粗樣先經硅膠開口柱分離（200-300目，以下溶劑系統按體積比，正 己烷:二氯甲烷溶劑系統按體積比為：100:0，90:10,70:30,50:50，30:70,10:90，0:100;隨 后二氯甲烷：乙酸乙酯溶劑系統按體積比為 :90:10,70:30,50:50,30:70,0:100;最后為甲 醇）；將活性樣品再用0DS開口柱分離(溶劑系統按體積比為甲醇：水=0:70，35:65，40:60， 50:50,60:40,70:30,90: 10,100:0);得到兩個黃酮苷類混合物Al(975.7mgWPBl (267.4mg)，然后A1和B1分別用0DS開口柱分離（溶劑系統按體積比分別為甲醇：水為：30: 70，50 : 50和30 : 70，35 : 65，60 : 40 )，得到純度較高黃酮苷混合物A2 (129 · 4mg)和B2 (139 · 9mg)。取A2 50mg用HPLC純化，色譜條件:色譜柱PAKC18( 10/250mm)，流速3ml/min，檢測 波長210nm，流動相為為甲醇：水= 38:62,得到化合物11171'；[061:;[117-0-€[-1-rhamnopyranoside(2 · 7mg，保留時間為19 · 5min)，quercetin 3-0-0-D_glucopyranoside (2.6mg,保留時間為25.3min)，quercetin 4'-0-a-L-rhamnopyranoside(35.8mg,保留時間 為38.0111丨11);取82 2011^用冊1^：純化，色譜條件：色譜柱030-1^-5(10/250_)，流速31111/1^11， 檢測波長210nm，流動相為為甲醇:水=48:52，得到化合物quercetin 3-0-a-(2"_galloyl) rhamnoside (5 · 3mg，保留時間為54 · 8min)，kaempferol 3-0-a-L-rhamnopyranoside (2.5mg，保留時間為60.6min)。五個化合物的結構式如下：
[0027] 實施例2
[0028]對實施例1 所得化合物myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3-〇_ iM)-glucopyranoside，quercetin 4 '-Ο-α-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-a-(2''_ galloyl )rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside的理化特征及化學結構 的定性鑒定：
[0029] 化合物myricetin 7-〇-a-L-rhamnopyranoside，quercetin 3-〇-0_D-glucopyranoside, quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside，quercetin 3_〇-a-(2"-galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside的結構經 1H NMR、MS和文 獻比對確定
[0030] 化合物myricetin 7-〇-a-L_rhamnopyranoside的理化性質：棕黃色固體，分子式 為C2iH2〇Oi2;ESI-TOF-MS :m/z 465 · 1027(M+H).，氫譜數據：咕 NMR(500MHz，CD30D): δ = 6 · % (s,2H),6.37(d,lH,J = 2.0Hz) ,6.20(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.31(d,lH,J = 1.5Hz) ,4.22(dd, 1H,J = 3,1.5Hz) ,3.79(dd,lH,J = 9.0,3.0Hz) ,3.52(m,lH) ,3.32(m,lH) ,0.96(d,3H,J = 6.5Hz)〇
[0031 ] 化合物quercetin 3_CHH)-glucopyranoside的理化性質：棕黃色固體，分子式為 C2iH2〇Oi2; ESI-TOF-MS: m/z 465 · 1027 (M+H) +，氫譜數據：咕 NMR( 500MHz，CD30D): δ = 7 · 70 (d， 1H, J = 2.0Hz) ,7.58(dd,lH, J = 8.5,2.0Hz) ,6.86(d, lH,J = 8.5Hz) ,6.19(d, 1H, J = 2.0Hz),6.38(d,lH ,J = 2.0Hz),5.22(d,lH ,J = 8.0Hz),3.47-3.20(m,4H),3.70(dd,lH ,J = 12.0,2.5Hz),3.57(dd,lH ,J = 13.0,6.0Hz)〇
[0032] 化合物quercetin 4'-〇-a-L-rhamnopyranoside的理化性質：棕黃色固體，分子式 為C2iH2〇Oii;ESI-TOF-MS:m/z 449 · 1114(M+H) +，氫譜數據：咕 NMR(500MHz，CD30D): δ = 7 · 33 (d,lH,J=1.5Hz) ,7.30(dd,lH,J = 8.0,1.5Hz) ,6.90(d,lH,J = 8.0Hz) ,6.18(d,lH,J = 2.0Hz) ,6.35(d,lH,J = 2.0Hz) ,5.34(s,lH) ,4.21(s,lH) ,3.39(m,lH) ,3.73(dd,lH,J = 9.5,3.0Hz)，3.43(m，lH)，0.93(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0033] 化合物quercetin 3-〇_a-(2"-galloyl)rhamnoside的理化性質：黃色固體，分子 式為〇281124〇15$51-1'(^-]\^ :111/2 601.1179(]\1+!〇 +，氫譜數據：1!1匪1?(50冊!^，0)3〇0):3 = 7.36(d，lH，J = 2.0Hz)，7.34(dd，lH，J = 8.5,2.0Hz)，，7.07(s，2H)，6.93(d，lH，J = 85Hz)， 6.18(d，lH，J = 2.0Hz)，6.36(d，lH，J = 2.0Hz)，5.63(dd，lH，J = 3.5,2.0Hz)，5.50(d，lH，J = 1.5Hz)，4.01(m，lH)，3.47(m，2H)，1.03(d，3H，J = 6.0Hz)。
[0034] 化合物kaempferol 3-〇-a-L_rhamnopyranoside的理化性質：棕黃色固體，分子式 為C21H20O10; ESI-T0F-MS:m/z 443 · 1125 (M+H) +，氫譜數據：咕 NMR( 500MHz，CD30D): δ = 7 · 77 (d,lH,J = 8.5Hz) ,6.93(d,lH,J = 8.5Hz),6.18(d,lH,J = 2.0Hz),6.35(d,lH,J = 2.0Hz), 5.37(d,lH ,J=1.5Hz) ,4.21 (dd, 1H ,J = 3.0,1.5Hz), 3.70(dd, 1H, J = 9.0,3.5Hz), 3.33-3.16(m，2H)，0.92(d，3H，J = 5.5Hz)。
[0035] 實施例3
[0036] 黃酮苷類組分及五個黃酮苷化合物在抗疫霉菌篩選模型中，顯著抑制疫霉菌無性 孢子囊的產生。
[0037] 目前抗疫霉菌活性物質的研究主要集中在抑制菌絲生長和游動孢子萌發兩方面， 對具有抑制疫霉菌無性生殖階段孢子囊產生的活性物質的研究極少。甲霜靈是目前在防治 植物疫病上面被最廣泛應用的一種農藥，可強烈抑制疫霉菌絲體的生長和無性孢子囊的產 生。本發明發現頭花寥黃酮苷類混合物及五個黃酮苷化合物在辣椒疫霉模型中，顯著疫霉 菌無性孢子囊的產生。
[0038] 1.實驗方法：
[0039] (1)從10°C生化培養箱取出辣椒疫霉菌株，復蘇到25°C，取一小塊接種到20ml固體 培養皿（10%的V8 juice，0.02%的碳酸鈣，2%的瓊脂粉）中。25°C避光培養3-4d備用。
[0040] (2)取￥8加：[06 501111^，碳酸|丐0.28，于離心管中混勾，離心15111；[11(40001'/111；[11)，得到 V8juice上清液。
[0041] (3)取出在生化培養箱中避光培養3-4d的固體平板，用打孔器在菌絲邊緣切下直 徑為6mm的菌塊，放在已滅菌的直徑為6 cm的培養皿中心，然后加入1 OmL液體培養基（3 %的 V8juice上清液），放于25°C生化培養箱避光培養。48h后，除去培養基，并加入10mL無菌水/ 皿。樣品加入時，先將樣品別用20yL DMS0溶解，然后用移液槍吸取培養皿中的無菌水980L， 加入到樣品溶液中，混勻后再均勻加入到培養皿中。測定中以〇. 2%DMS0為陰性對照，以30μ g/mL的甲霜靈為陽性對照。經過16-24h的避光培養，在光學顯微鏡下觀察疫霉菌無性孢子 囊產生的情況并懸浮計數(10倍目鏡，4倍物鏡)統計，然后計算其抑制率。
[0042] 抑制率（％) = (Nd-Ns)/NcX100%
[0043] Nd:陰性對照組單位體積內產生的無性孢子囊數;Ns:樣品組單位體積內產生的無 性孢子囊數。
[0044] 2.實驗結果：
[0045] 在3yg/mL濃度下的黃酮苷類混合物A2和B2對疫霉菌無性孢子囊產生的抑制率分 別為88%和98% (圖1)。五個黃酮苷化合物分別在3(^11、3(^1、3以1、3以1、1(^1的濃度下對疫 霉菌無性孢子囊產生的抑制率為74%、65%、86%、78%、90% (圖2)及相應的顯微圖片（圖 3)〇
【主權項】
1. 一種頭花寥中黃酮苷活性組分，該組分主要包含五個黃酮苷化合物，其特征在于，所 述頭花寥中黃酮苷活性組分通過以下步驟制備獲得： (1) 粉碎和浸提： 將頭花寥粉碎后，用工業級甲醇溶液在室溫下浸提2次，每次1天，抽濾濃縮，得甲醇浸 提物粗樣，用乙酸乙酯和水萃取分離，靜置，將乙酸乙酯層減壓濃縮旋干后，得到乙酸乙酯 層粗樣； (2) 分離和純化： 將乙酸乙酯層粗樣先經硅膠開口柱分離，分離條件:200-300目，溶劑系統為正己烷:二 氯甲烷、二氯甲烷：乙酸乙酯和甲醇，再進一步通過十八烷基鍵合硅膠開口柱分離，溶劑系 統為甲醇：水，在洗脫體系分別為40 %甲醇水溶液和50 %甲醇水溶液時得到兩個黃酮苷活 性組分，兩個黃酮苷活性組分再分別經十八烷基鍵合硅膠開口柱分離，溶劑系統為甲醇： 水，得到較純的黃酮苷活性組分，然后再分別用反相HPLC純化，流動相為甲醇水溶液，最終 得到五個黃酮苷化合物；五個化合物分別是myricetin 7-〇-a-L-rhamnopyranoside， quercetin 3-Ο-β-D-g1ucopyranoside，quercetin 4'-〇-a-L_rhamnopyranoside， quercetin 3_〇-a-(2''-galloyl)rhamnoside，和kaempferol 3-〇-a-L-rhamnopyranoside〇2. 根據權利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，所述步驟(2)中 正己烷:二氯甲烷溶劑系統按體積比為：100:0，90:10，70:30，50:50,30:70,10:90，0:100; 隨后二氯甲烷：乙酸乙酯溶劑系統按體積比為:90:10，70:30，50:50，30:70，0:100;最后為 甲醇。3. 根據權利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，步驟(2)中第一 次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統按體積比為:30:70，35:65，40:60，50: 50,60:40,70:30,90:10，100:0。4. 根據權利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，步驟(2)中第二 次十八烷基鍵合硅膠開口柱純化的甲醇:水溶劑系統按體積比分別為:30:70，50: 50和30: 70,35:65,60:40。5. 根據權利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分，其特征在于，步驟(2)中HPLC 純化的色譜柱和流動相分別為CAPCELL PAKC18,甲醇：水= 38:62和Develosil C30-UG-5， 甲醇：水= 48:52。6. 根據權利要求1所述的一種頭花寥中黃酮苷活性組分在制備抗疫霉菌農藥中的應 用，所述黃酮苷活性組分主要包括五個黃酮苷化合物。7. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述藥物是以黃酮苷活性組分或五個黃酮 苷化合物為活性成份，與藥學上可接受的載體或賦形劑制得。8. 根據權利要求6所述的應用，其特征在于，所述藥物劑型選用固體制劑或液體制劑。
【文檔編號】A01P3/00GK106046081SQ201610408978
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月12日
【發明人】戚建華, 張慧, 王倩, 王源超
【申請人】浙江大學