一種具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物探針及其制備和應用

一種具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物探針及其制備和應用
【專利摘要】本發明涉及一種具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物探針及其制備方法和應用，具體涉及一類既含有線粒體靶向基團又含有次氯酸根(ClO?)識別基團的磷光銥配合物探針及其應用，屬于有機光電功能材料技術領域。該類配合物材料由含肟基團的環金屬配體、金屬中心和含有三苯基膦的線粒體靶向基團的N^N配體組成，結構通式如下式所示。該材料合成步驟簡單、條件溫和，在次氯酸根檢測、線粒體靶向成像和生物標記中有非常好的應用前景。
【專利說明】
一種具有線粒體靶向功能的磷光銥配合物探針及其制備和 應用
技術領域
[0001] 本發明涉及一種具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，具體涉及一類 既含有線粒體靶向基團又含有次氯酸根(CKT)識別基團的磷光銥配合物探針及其應用，屬 于有機光電功能材料技術領域。
【背景技術】
[0002] 分子氧是所有耗氧有機體維持其生命活動的必需組分，活性氧物種(R0S)是人體 代謝過程中產生的分子氧的一種，它包括過氧化物、羥基、過氧自由基、過氧化氫、單線態的 氧和次氯酸/次氯酸根。人體內的活性氧物種R0S主要是通過線粒體呼吸過程產生的氧氣， 同時，也可通過外部干擾誘導有機體內生成，例如外源性化學物質，傳染劑和紫外線。ROSS 與廣泛的生理和病理過程，如信號轉導，炎癥，癌變和神經組織衰退性損傷。雖然在正常的 細胞環境中產生R0S對于生命是必須的，但是當它們在外源性刺激下生成過量時，對有機體 也是有危害的。過量的R0S通過生物分子的氧化引起的氧化應激，例如，脂質、蛋白質和DNA 的氧化作用，并誘導細胞死亡。
[0003] R0S調節各種各樣的生理過程。次氯酸(H0C1)，一個生物學意義的活性氧，是在活 化白細胞內，通過髓過氧化酶催化過氧化氯離子產生的。在自然防御中，次氯酸也是一種重 要的殺菌劑。然而，次氯酸水平的異常與許多炎癥相關的疾病有著密切的聯系，包括心血管 疾病，人體紅細胞的損傷，肺病，類風濕關節炎和癌癥。所以，次氯酸的檢測是非常重要的。 目前，已經發展了許多檢測次氯酸的方法，例如，電解法，電勢法，分光光度法，化學發光檢 測等。Weiying Lin組合成了一種檢測CKT的比率熒光探針，當作用于分析物時，熒光發射 比率（15〇9/1 439)的可從〇.28增加到2.74，且具有較高的選擇性（(^11^1^.入，2009，15， 2305-2309)。此探針是基于熒光信號的檢測。相比于熒光信號，磷光信號檢測具有以下優 勢:具有大的Stokes位移、可見光激發、良好的光穩定性、長的發射壽命、高的量子效率和發 射波長易調節等。我們課題組已開發出基于磷光信號檢測的次氯酸根探針（CN 201310525077.6)，實現了對次氯酸根的磷光信號檢測。
[0004] 不同的活性氧對各種疾病的致病機理作用不同，為了更加深入的研究某種活性氧 物種對疾病的作用機制，這就要求廣大科研工作者設計出能夠專一性檢測某種活性氧的熒 光分子探針。
[0005] 線粒體是細胞中的"能量加工廠"，對細胞存亡起著至關重要的作用。如果線粒體 機能發生紊亂，就會引發一系列的疾病，例如:代謝紊亂和某些癌癥。線粒體也是細胞內產 生活性氧的重要部位，同樣，當這些活性氧的產生發生紊亂的時候也會產生一系列的疾病， 如:癌癥、糖尿病、阿爾茨海默病、神經退行性疾病等等。因此開發出能特定實現線粒體中次 氯酸根檢測的探針是非常重要的。

【發明內容】

[0006] 為解決上述技術問題，本發明的目的在于提供一種具有線粒體靶向功能的磷光銥 配合物探針，給出它們的制備方法，并提出這類配合物在次氯酸根檢測、細胞成像以及生物 標記中的應用。本發明所采用的技術方案如下：
[0007] 為了解決上述其中一個技術問題提出的技術方案是:本發明涉及具有線粒體靶向 功能的磷光銥配合物探針，其環金屬配體上含有次氯酸根(CKT)識別基團肟基(C = N-〇H)， 輔助N~N配體上含有線粒體靶向基團三苯基膦，可以用于線粒體的靶向成像以及其中的次 氯酸根檢測；
[0008] 所述的銥配合物探針具有如下結構通式：
[0010] 其中：
jSl-lO的正整數。
[0011] -種具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的制備方法，該制備方法的 合成路線如下：
S
[0013] 其中，
η為1-10的正整數。
[0014] 具體是在氮氣保護下，
與三水合三氯化銥在2-乙氧基乙醇/ 水(3:1，v: v)混合液中110 °C密閉反應24小時得到相應的銥二氯橋化合物;再將得到的銥二 氯橋化合物與化合物2在二氯甲烷/甲醇(2:1，v:v)混合液中氮氣保護下40°C密閉反應4小 時，冷卻至室溫后加入六氟磷酸鉀繼續反應1小時，分離提純得到含有醛基(CHO)的銥配合 物3;再將含有醛基的銥配合物再與鹽酸羥胺在乙醇/三乙胺混合液中氮氣保護下60°C密閉 反應3小時，分離提純得到含有肟基團（C = N-〇H)的配合物4;最后將4和三苯基磷溶于DMF 中，在氮氣氣氛中l〇〇°C回流72小時，反應結束后減壓旋蒸除去DMF，再經過柱層析提純得到 最終的配合物探針5.
[0015] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，該磷光離子型銥配合物 應用于次氯酸根檢測。
[0016] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，該磷光離子型銥配合物 應用于細胞成像和生物標記。
[0017] 所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，該磷光離子型銥配合物 該材料應用于活細胞線粒體的標記。
[0018] 有益效果：
[0019] 本發明合成的材料用作CKT磷光探針，在CKT存在下磷光發射顯著增強，為turnon 型磷光探針，檢測效果顯著。本發明制備的磷光探針材料對 CKT 具有高的選擇性，并且響 應快。
[0020] 本探針材料具有低生物毒性，具有一定的水溶性，且容易進入細胞線粒體中，使得 這類探針可用于細胞內線粒體中CKT檢測，這對深入研究CKT在生物體體內的生理和毒理 作用具有重要意義。
【附圖說明】
[0021] 下面結合附圖對本發明的作進一步說明。
[0022] 圖1.為實施例1中配合物Irl的CH30H/H20混合溶液的磷光發射光譜對CKT的響應 性。
[0023] 圖2.為實施例1中配合物Irl對C1(T的選擇性示意圖。
[0024]圖3.為實施例1中配合物Irl的MTT細胞毒性實驗。
[0025] 圖4.為實施例1中配合物Irl與商業線粒體染料的共染細胞成像。
【具體實施方式】
[0026] 以下結合說明書附圖對本發明創造作進一步的詳細說明。
[0027]為了更好地理解本發明專利的內容，下面通過具體的實例來進一步說明本發明的 技術方案。但這些實施實例并不限制本發明。
[0028] 實施例1:當n = 2
時，探針Irl的制備：
[0029]合成路線如下所示：
[0031] 化合物2a的制備：在反應瓶中加入氫氧化鉀51mmol和2-吡啶基苯并咪唑 10.2mmol，并加入離子液體20ml。混合物預先攪拌5分鐘后，加入1，6-二溴己燒8ml，在室溫 下攪拌反應5h。反應完成后，用乙醚萃取三次，合并油相，采用旋轉蒸發儀除去溶劑。得到的 粗產物用柱層析進行分離，淋洗液為石油醚：乙酸乙酯= 3:1，最后得到無色油狀液體2.2g， 產率60%</Η NMR(400MHz，CDCl3)j = 8.70(d，J = 4.80Hz，lH)，8.41(d，J = 7.97Hz，lH)， 7.88-7.33(m，2H)，7.46-7.44(m，lH)，7.37-7.30(m，3H)，4.84(t，J=7.6Hz，2H)，3.38(t，J =6·8Hz，2H)，1·95-1·88(m，2H)，1·86-1·79(m，2H)，1·53-1·44(m，2H)，1·42-1·35(m，2H)。
[0032] 配合物3a的制備:稱取4-(2-吡啶基)苯甲醛(2.5mmol)與IrCl3 · 3H20(lmmol)混合 投入三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個 反應體系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進反應體系中，升溫至110°C，磁 力攪拌反應24小時。反應結束后，將體系冷卻至室溫，過濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固 體產物即為吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物。稱取吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物（lmm 〇 1 )、2a (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用 氮氣保護整個反應體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應5小時后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續攪拌反應過夜。反 應結束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結晶，得到固體產物即為銥配合物3a。產 率：64% </H NMR(400MHz，DMS0)S = 9.72((1, J = 7.8Hz，2H)，8.64((1, J = 8.2Hz，2H)，8.47((1, J = 8.1Hz,lH) ,8.37 (d,J = 8.8Hz,lH) ,8.33( td,J = 8.2,1.5Ηζ,1Η) ,8.20(d,J = 8.0Hz, lH),8.18(dd ,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH), 8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t ,J = 7.9Hz,lH),7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH),6.73(d ,J = 1.2Hz,lH) ,6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6·8Hz，2H)，1·98-1·84(m，2H)，1·75-1·63(m，2H)，1·30-1·17(m，2H)·
[0033] 配合物4a的制備:稱取銥配合物3a( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個反應體系。注入 5mL蒸過的乙醇溶液，5mmo 1蒸過的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時。反應結束后，濃縮提純。得 到紅色固體產物即為銥配合物4a。產率：81% ,Η MMR(400MHz，DMS0) :δ = 11.13(s，2H)， 10.36(s,2H) ,8.64(d ,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz , 1H), 8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33 (td ,J = 8.2,1.5Hz,lH),8.20(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.18(dd ,J= 12.9,8.1Hz , 2H) ,8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d ,J = 6.0Hz,lH),7.78 (d ,J = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H) ,7.41 (t ,J = 7.9Hz , 1H), 7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH) ,6.73(d ,J= 1.2Hz , 1H), 6.65(d ,J= 1.2Hz , 1H) ,6.11 (d ,J =8.4Hz, 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m, 2H)，1.30-1.17(m，2H)〇
[0034] 配合物Irl的制備：將4a(0.2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮氣氣氛中 l〇〇°C回流72小時，反應結束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過柱子提純，得到最終 產物Irl。產率60%</Η MMR(400MHz，DMS0) :S = 11.13(s，2H)，10.36(s，2H)，8.64(d，J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz,lH) ,8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz , 1H), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.56(t,2H),1.99(s,3H),1.50(m,6H)〇
[0035] 探針Irl的發射光譜對C10_的響應性：：
[0036] 將銥配合物&1溶解在0130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2)混合溶液中，逐次加入(：10一的 CH30H/H20混合溶液中，每次滴加 C1(T后，在37°C恒溫水浴中加熱攪拌5分鐘，使C1(T與銥配 合物Irl充分反應，隨后測試其熒光發射光譜，如圖1所示。在583nm處，銥配合物Irl溶液本 身發光很弱，隨著CKT的加入，銥配合物Irl溶液的熒光光譜立刻發生了變化，伴隨著CKT滴 加濃度的升高，銥配合物Irl的熒光光譜藍移并在575nm處的熒光強度逐漸升高。當CKT的 滴加濃度當量達到30eq.時，滴定達到終點，再繼續滴加 CKT，光譜則不再發生變化。
[0037] 探針Irl在溶液中對C10_的選擇性實驗：
[0038] 配制1(^11的配合物&1溶液(〇130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2))，移取2.51^所配化合物 溶液于比色皿中，加入過量的（超過200倍當量）的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(：12、!12〇2、似(：10 3、似勵2、他(：10溶液，分別測其發射光譜。測試結果如圖2所 示，其他離子均無明顯影響。實驗數據表明：材料對CKT有較好的選擇性。
[0039] 配合物Irl的MTT細胞毒性實驗：
[0040]將消化后的細胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個/孔，在37°C，5%0)2的 條件下繼續培養24小時。吸除不新鮮的培養液后用不同濃度&1(1、5、10、25、5(^1〇的細胞 培養液繼續培養細胞24小時。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續培養4小時候終止培養。吸除 培養液，每孔加入150yL DMS0,搖床震蕩10分鐘后使用酶標儀測試0D570。
[00411 MTT細胞毒性實驗結果如圖3所示，在配合物的濃度為1~50μΜ時，培養24小時候的 細胞存活率均大于80%，證明該配合物具有較低的細胞毒性，可用于細胞成像。
[0042] 配合物Irl與商業線粒體染料Mito-Track Green對活細胞線粒體的共染實驗：
[0043] 本發明采用的細胞均為人宮頸癌HeLa細胞。將消化后的細胞接種在培養皿中，在 37°C，5%C02的條件下繼續培養24小時使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細胞培養液后用 Irl(5yM)的細胞培養液孵育細胞12小時。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的細胞培 養液繼續培養30分鐘，用PBS溶液清洗三次后成像。
[0044] 配合物Irl與商業線粒體染料Mito-Tracker Green的細胞共染成像圖如圖4所示。 Mito-Tracker Green由488nm藍光激發，收集500_540nm綠光發射，Ir 1由405nm藍紫光激發， 收集560-640nm紅光發射。將線粒體染料Mito-Tracker Green的發射區域與配合物Ir 1的發 射區域向疊加，發現二者重合度高，由計算可得，共染系數為0.85,證明本發明的配合物Irl 能夠靶向活細胞線粒體，可用于活細胞線粒體標記。
[0045] 實施例2:當n = l，
!l時，探針Ir2的制備：
[0046] 合成路線如下所示：
[0048]化合物2b的制備：在反應瓶中加入氫氧化鉀51mmol和2-吡啶基苯并咪唑 10.2mmol，并加入離子液體20ml。混合物預先攪拌5分鐘后，加入1，4-二溴丁烷8ml，在室溫 下攪拌反應5h。反應完成后，用乙醚萃取三次，合并油相，采用旋轉蒸發儀除去溶劑。得到的 粗產物用柱層析進行分離，淋洗液為石油醚：乙酸乙酯= 3:1，最后得到無色油狀液體2.2g， 產率62%</H NMR(400MHz，CDCl3)j = 8.70(d，J = 4.80Hz，lH)，8.41(d，J = 7.97Hz，lH)， 7.88-7.33(m，2H)，7.46-7.44(m，lH)，7.37-7.30(m，3H)，4.86(t，J=7.6Hz，2H)，3.39(t，J =6.8Hz，2H)，1.92-1.886(m，2H)，1.84-1.78(m，2H)。
[0049] 配合物3b的制備:稱取4-(2-吡啶基)苯甲醛(2.5mmol)與IrCl3 · 3H20(lmmol)混合 投入三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個 反應體系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進反應體系中，升溫至110°C，磁 力攪拌反應24小時。反應結束后，將體系冷卻至室溫，過濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固 體產物即為吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物。稱取吡啶基苯甲醛銥二氯橋化合物（lmm〇 1)、2b (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用 氮氣保護整個反應體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應5小時后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續攪拌反應過夜。反 應結束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結晶，得到固體產物即為銥配合物3b。產 率：71% ,Η ΜΚΗΟΟΜΗζ,ΟΜΒΟ)1!! NMR(400MHz，DMS0)S = 9.72((1, J = 7.8Hz，2H)，8.64((1, J = 8.2Hz,2H),8.47(d ,J = 8.1Hz,lH),8.37(d ,J = 8.8Hz,lH),8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz,lH), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m,2H).
[0050] 配合物4b的制備:稱取銥配合物3b( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個反應體系。注入 5mL蒸過的乙醇溶液，5mmo 1蒸過的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時。反應結束后，濃縮提純。得 到紅色固體產物即為銥配合物4a。產率：81% ,Η MMR(400MHz，DMS0) :δ = 11.13(s，2H)， 10.36(s,2H) ,8.64(d ,J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz , 1H), 8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33 (td ,J = 8.2,1.5Hz,lH),8.20(d ,J = 8.0Hz,lH) ,8.18(dd ,J= 12.9,8.1Hz , 2H) ,8.17(d ,J = 8.1Hz,lH),8.06(td ,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d ,J = 6.0Hz,lH),7.78 (d ,J = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H) ,7.41 (t ,J = 7.9Hz , 1H), 7.26(t ,J = 6.7Hz,2H),7.07-6.97(m,lH) ,6.73(d ,J= 1.2Hz , 1H), 6.65(d ,J= 1.2Hz , 1H) ,6.11 (d ,J =8.4Hz, 1H), 5.03-4.79(m, 2H), 3.38(t ,J = 6.8Hz,2H), 1.98-1.84(m,2H), 1.75-1.63(m, 2H)〇
[0051 ] 配合物Ir2的制備：將4b(0 · 2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮氣氣氛中 l〇〇°C回流72小時，反應結束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過柱子提純，得到最終 產物Ir2。產率60%</Η MMR(400MHz，DMS0) :S = 11.13(s，2H)，10.36(s，2H)，8.64(d，J = 8.2Hz,2H) ,8.47(d ,J = 8.1Hz,lH) ,8.37(d ,J = 8.8Hz , 1H), 8.33(td ,J = 8.2,1.5Hz , 1H), 8.20(d,J = 8.0Hz,lH),8.18(dd,J=12.9,8.1Hz,2H),8.17(d,J = 8.1Hz,lH) ,8.06(td,J = 8.1,1.5Hz,lH),8.02-7.90(m,3H),7.84(d,J = 6.0Hz,lH),7.78(dJ = 5.9Hz,lH),7.71-7.64(m,lH),7.63-7.52(m,2H),7.41(t,J = 7.9Hz, 1H),7.26(t,J = 6.7Hz,2H) ,7.07-6.97 (m,lH),6.73(d ,J=1.2Hz,lH),6.65(d ,J=1.2Hz,lH) ,6.11 (d ,J = 8.4Hz , 1H), 5.03-4.79 (m,2H),3.56(t,2H),1.99(s,3H),1.50(m,6H)〇
[0052] 探針Ir2的發射光譜對C10_的響應性：：
[0053] 將銥配合物&2溶解在0130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2)混合溶液中，逐次加入(：10一的 CH30H/H20混合溶液中，每次滴加 C1(T后，在37°C恒溫水浴中加熱攪拌5分鐘，使C1(T與銥配 合物Ir2充分反應，隨后測試其熒光發射光譜。在583nm處，銥配合物Ir2溶液本身發光很弱， 隨著CKT的加入，銥配合物Ir2溶液的熒光光譜立刻發生了變化，伴隨著CKT滴加濃度的升 高，銥配合物Ir2的熒光光譜藍移并在575nm處的熒光強度逐漸升高。當CKT的滴加濃度當 量達到30eq.時，滴定達到終點，再繼續滴加 CKT，光譜則不再發生變化。
[0054] 探針Ir2在溶液中對C10_的選擇性實驗：
[0055] 配制ΙΟμΜ的配合物Ir2溶液(CH30H/H20(v/v，2:1，pH 7 · 2))，移取2 · 5mL所配化合物 溶液于比色皿中，加入過量的（超過200倍當量）的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(：1 2、!12〇2、似(：103、似勵2、他(：10溶液，分別測其發射光譜。實驗數據表明 ：材 料對CKT有較好的選擇性。
[0056] 配合物Ir2的MTT細胞毒性實驗：
[0057]將消化后的細胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個/孔，在37°C，5%0)2的 條件下繼續培養24小時。吸除不新鮮的培養液后用不同濃度&2(1、5、10、25、5(^1〇的細胞 培養液繼續培養細胞24小時。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續培養4小時候終止培養。吸除 培養液，每孔加入150yL DMS0，搖床震蕩10分鐘后使用酶標儀測試0D570 JTT細胞毒性實驗 結果表明在配合物的濃度為1~50μΜ時，培養24小時候的細胞存活率均大于80 %，證明該配 合物具有較低的細胞毒性，可用于細胞成像。
[0058] 配合物Ir2與商業線粒體染料Mito-Track Green對活細胞線粒體的共染實驗： [0059]本發明采用的細胞均為人宮頸癌HeLa細胞。將消化后的細胞接種在培養皿中，在 37°C，5%C02的條件下繼續培養24小時使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細胞培養液后用 Ir2(5yM)的細胞培養液孵育細胞12小時。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的細胞培 養液繼續培養30分鐘，用PBS溶液清洗三次后成像。
[0000] 配合物Ir2與商業線粒體染料Mito-Tracker Green的細胞共染成像結果表明本發 明的配合物Ir3能夠靶向活細胞線粒體，可用于活細胞線粒體標記。
[0061 ] 實施例3:當n = 2，
I時，探針Ir3的制備：
[0062]合成路線如下所示：
[0064] 對醛基苯喹啉（lc)的合成:在250mL兩口瓶中加入2-氯喹啉(818mg，5.Ommol)，對 醛基苯硼酸(750mg，5.0mmol)和四（三苯基膦)鈀催化劑(200mg)。體系密封，除氧充氮氣保 護。然后用注射器加入鼓氮除氧半小時之后的溶劑甲苯(30mL)，乙醇（10mL)，飽和碳酸鈉水 溶液(10mL)。反應時體系避光，80°C下回流反應15小時。待反應結束后，體系冷卻到室溫。用 二氯甲烷/水萃取反應液3次，收集有機相，有機相濃縮，TLC點板，確認產物點。粗產物過柱 提純(石油醚/二氯甲烷=1:4)得到產物。產率85 %。4 NMR(CDC13，400MHz): δ (ppm) = 1 〇 · 12 (s，lH)，8.35(d，2H)，8.28(d，lH)，8.19(d，lH)，7.93(d，lH)，7.86(d，lH)，7.77(t，lH).
[0065] 配合物3c的制備:稱取對醛基苯喹啉(2.5mmol)與IrCl3 · 3H20(lmmol)混合投入三 頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個反應體 系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進反應體系中，升溫至110°C，磁力攪拌 反應24小時。反應結束后，將體系冷卻至室溫，過濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固體產物 即為對醛基苯喹啉銥二氯橋化合物。稱取對醛基苯喹啉銥二氯橋化合物（lmmol)、2a (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用 氮氣保護整個反應體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應5小時后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續攪拌反應過夜。反 應結束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結晶，得到固體產物即為銥配合物3c。 [00 66] 配合物4c的制備:稱取銥配合物3c( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個反應體系。注入 5mL蒸過的乙醇溶液，5mmo 1蒸過的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時。反應結束后，濃縮提純。得 到紅色固體產物即為銥配合物4c。
[0067] 配合物Ir3的制備：將4c(0.2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮氣氣氛中 l〇〇°C回流72小時，反應結束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過柱子提純，得到最終 產物Ir3。
[0068] 探針Ir3的發射光譜對C10_的響應性：：
[0069] 將銥配合物&3溶解在0130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2)混合溶液中，逐次加入(：10_的 CH30H/H20混合溶液中，每次滴加 CKT后，在37°C恒溫水浴中加熱攪拌5分鐘，使CKT與銥配 合物Ir3充分反應，隨后測試其熒光發射光譜。在610nm處，銥配合物Ir3溶液本身發光很弱， 隨著CKT的加入，銥配合物Ir3溶液的熒光光譜立刻發生了變化，伴隨著CKT滴加濃度的升 高，銥配合物Ir3的熒光光譜藍移并在603nm處的熒光強度逐漸升高。當CKT的滴加濃度當 量達到30eq.時，滴定達到終點，再繼續滴加 CKT，光譜則不再發生變化。
[0070] 探針Ir3在溶液中對C10_的選擇性實驗：
[0071] 配制1(^的配合物&3溶液(〇130!1/!120(￥八，2 :1，？!17.2))，移取2.51^所配化合物 溶液于比色皿中，加入過量的（超過200倍當量）的AlCl3、CuCl2、LiC10 3、MgCl2、Na2⑶3、 他23〇4、似(^、211(：12、!12〇2、似(：10 3、似勵2、他(：10溶液，分別測其發射光譜。實驗數據表明：材 料對CKT有較好的選擇性。
[0072] 配合物Ir3的MTT細胞毒性實驗：
[0073] 將消化后的細胞接種在96孔板中，每孔的接種密度為104個/孔，在37°C，5%0)2的 條件下繼續培養24小時。吸除不新鮮的培養液后用不同濃度&3(1、5、10、25、5(^1〇的細胞 培養液繼續培養細胞24小時。每孔加入10yL MTT(5mg/mL)繼續培養4小時候終止培養。吸除 培養液，每孔加入150yL DMS0，搖床震蕩10分鐘后使用酶標儀測試0D570 JTT細胞毒性實驗 結果表明在配合物的濃度為1~50μΜ時，培養24小時候的細胞存活率均大于80 %，證明該配 合物具有較低的細胞毒性，可用于細胞成像。
[0074] 配合物Ir3與商業線粒體染料Mito-Track Green對活細胞線粒體的共染實驗：
[0075] 本發明采用的細胞均為人宮頸癌HeLa細胞。將消化后的細胞接種在培養皿中，在 37°C，5%C02的條件下繼續培養24小時使之貼壁。用PBS溶液洗去不新鮮的細胞培養液后用 Ir3(5yM)的細胞培養液孵育細胞12小時。再用含有Mito-Tracker Green(200nM)的細胞培 養液繼續培養30分鐘，用PBS溶液清洗三次后成像。
[0076] 配合物Ir3與商業線粒體染料Mito-Tracker Green的細胞共染成像圖結果表明本 發明的配合物Ir3能夠靶向活細胞線粒體，可用于活細胞線粒體標記。
[0077] 實施例4:當n = 2，
I時，探針Ir4的制備：
[0078]合成路線如下所示：
[0080] 對醛基苯異喹啉（Id)的合成：在250mL兩口瓶中加入2-氯異喹啉（818mg， 5.0mmol)，對醛基苯硼酸(750mg，5.0mmol)和四（三苯基膦)鈀催化劑(200mg)。體系密封，除 氧充氮氣保護。然后用注射器加入鼓氮除氧半小時之后的溶劑甲苯(30mL)，乙醇（10mL)，飽 和碳酸鈉水溶液（10mL)。反應時體系避光，80°C下回流反應15小時。待反應結束后，體系冷 卻到室溫。用二氯甲烷/水萃取反應液3次，收集有機相，有機相濃縮，TLC點板，確認產物點。 粗產物過柱提純(石油醚/二氯甲烷=1:4)得到產物。產率85 %。
[0081 ] 配合物3d的制備:稱取對醛基苯異喹啉(2.5mmol)與IrCh · 3H2〇(lmmol)混合投入 三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個反應 體系。將體積比為3:1的乙二醇乙醚和水的混合物注射進反應體系中，升溫至110°C，磁力攪 拌反應24小時。反應結束后，將體系冷卻至室溫，過濾沉淀，并用乙醇和水洗，得到的固體產 物即為對醛基苯異喹啉銥二氯橋化合物。稱取對醛基苯異喹啉銥二氯橋化合物（lmmol)、2a (2.3mmo 1)加入至三頸瓶中，在雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用 氮氣保護整個反應體系。將體積比為2:1的二氯甲烷和甲醇的混合物注入體系中，將溫度升 至40°C，攪拌回流。反應5小時后，加入0.72mmol的六氟磷酸鉀固體，繼續攪拌反應過夜。反 應結束后濃縮提純，最后用二氯甲烷和正己烷重結晶，得到固體產物即為銥配合物3d。 [00 82] 配合物4d的制備:稱取銥配合物3d( lmmol)和鹽酸輕胺（5mmol)加入雙頸瓶中，在 雙排管上抽真空-保氮氣-抽真空，循環往復三次，最后采用氮氣保護整個反應體系。注入 5mL蒸過的乙醇溶液，5mmo 1蒸過的三乙胺，60 °C混合攪拌4小時。反應結束后，濃縮提純。得 到紅色固體產物即為銥配合物4d。
[0083] 配合物Ir4的制備：將4d(0.2mmol)和三苯基磷（2mmol)溶于DMF中，在氮氣氣氛中 l〇〇°C回流72小時，反應結束后減壓旋蒸除去DMF，將得到的油狀液體過柱子提純，得到最終 產物Ir4。
[0084] 本發明的不局限于上述實施例所述的具體技術方案，凡采用等同替換形成的技術 方案均為本發明要求的保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針，其特征在于其環金屬配體上 含有次氯酸根(C1CT)識別基團肟基(C = N-〇H)，輔助N~N配體上含有線粒體靶向基團三苯基 膦;該銥配合物具有如下結構通式：2. -種如權利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的制備方 法，其特征在于該制備方法的合成路線如下：具體是在氮氣保護下，^與三水合三氯化銥在2-乙氧基乙醇/水3:1，v: 0昆合液中ll〇°C密閉反應24小時得到相應的銥二氯橋化合物;再將得到的銥二氯橋化合物 與化合物2在二氯甲烷/甲醇2:1，v: v混合液中氮氣保護下40 °C密閉反應4小時，冷卻至室溫 后加入六氟磷酸鉀繼續反應1小時，分離提純得到含有醛基(CHO)的銥配合物3;再將含有醛 基的銥配合物再與鹽酸羥胺在乙醇/三乙胺混合液中氮氣保護下60°C密閉反應3小時，分離 提純得到含有肟基團（C = N-〇H)的配合物4;最后將配合物4和三苯基磷溶于DMF中，在氮氣 氣氛中100°C回流72小時，反應結束后減壓旋蒸除去DMF，再經過柱層析提純得到最終的配 合物探針5。3. -種如權利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的應用， 其特征在于該磷光離子型銥配合物應用于次氯酸根檢測。4. 一種如權利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的應用， 其特征在于該磷光離子型銥配合物應用于細胞成像和生物標記。5. -種如權利要求1所述的具有線粒體靶向功能的磷光離子型銥配合物探針的應用， 其特征在于該磷光離子型銥配合物該材料應用于活細胞線粒體的標記。
【文檔編號】G01N21/64GK106046059SQ201610398197
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月6日
【發明人】許文娟, 趙強, 楊繼光, 黃維, 劉淑娟, 楊靖, 陳鍵, 狄隆康
【申請人】南京郵電大學