一種石杉堿甲的藥物組合物及其醫藥用圖
【專利摘要】本發明公開了一種石杉堿甲的藥物組合物及其醫藥用途，本發明提供的石杉堿甲的藥物組合物中含有石杉堿甲和一種結構新穎的天然產物化合物(Ⅰ)，石杉堿甲、化合物(Ⅰ)單獨作用時，對牙周炎具有治療作用；石杉堿甲和化合物(Ⅰ)聯合作用時，治療效果進一步提高，可以開發成治療牙周炎的藥物，與現有技術相比具有突出的實質性特點和顯著的進步。
【專利說明】
一種石杉堿甲的藥物組合物及其醫藥用途
技術領域
[0001] 本發明屬于生物醫藥領域，涉及石杉堿甲的新用途，具體涉及石杉堿甲的藥物組 合物及其在治療牙周炎中的應用。
【背景技術】
[0002] 石杉堿甲臨床用于中、老年良性記憶障礙及各型癡呆、記憶認知功能及情緒行為 障礙。尚可用于治療重癥肌無力。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種石杉堿甲的藥物組合物，該藥物組合物中含有石杉堿 甲和一種天然產物，石杉堿甲和該天然產物可以協同治療牙周炎。
[0004] 本發明的上述目的是通過下面的技術方案得以實現的：
[0005] 一種具有下述結構式的化合物（I)，
[0007] -種石杉堿甲的藥物組合物，包括石杉堿甲、如權利要求1所述的化合物（I)和藥 學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。
[0008] 進一步地，藥學上可以接受的載體包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、 崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體或潤滑劑。
[0009] 進一步地，所述劑型包括片劑、膠囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、 膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。
[0010] 上述化合物（I)的制備方法，包含以下操作步驟：（a)將苦楝皮粉碎，用80~90%乙 醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯和水飽和的正丁醇萃 取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中正丁醇取物用 大孔樹脂除雜，先用30 %乙醇洗脫6個柱體積，再用85 %乙醇洗脫12個柱體積，收集85 %洗 脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗脫濃縮物用正相硅膠分 離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d) 步驟(C)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、12:1和2:1的二氯甲烷-甲 醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的反相硅膠分離，用體 積百分濃度為88%的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積洗脫液，洗脫液減壓濃縮 得到化合物(I)。
[0011]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)用85%乙醇熱回流提取，合并提取 液。
[0012]進一步地，化合物（I)的制備方法中，所述大孔樹脂為D101型大孔吸附樹脂。
[0013]進一步地，化合物（I)的制備方法中，步驟(a)中用二氯甲烷代替乙酸乙酯進行萃 取，得到二氯甲烷萃取物。
[0014] 上述化合物(I)在制備治療牙周炎的藥物中的應用。
[0015] 上述石杉堿甲的藥物組合物在制備治療牙周炎的藥物中的應用。
[0016] 本發明的優點：
[0017] 本發明提供的石杉堿甲的藥物組合物中含有石杉堿甲和一種結構新穎的天然產 物，石杉堿甲、化合物（I)單獨作用時，對牙周炎具有治療作用;石杉堿甲和化合物（I)聯合 作用時，治療效果進一步提高，可以開發成治療牙周炎的藥物。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合實施例進一步說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明保護范 圍。盡管參照較佳實施例對本發明作了詳細說明，本領域的普通技術人員應當理解，可以對 本發明的技術方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發明技術方案的實質和范圍。
[0019] 實施例1:化合物(I)分離制備及結構確證
[0020] 試劑來源：乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二氯甲烷為分析純，購自上海凌峰化 學試劑有限公司，甲醇，分析純，購自江蘇漢邦化學試劑有限公司。
[0021]分離方法：（a)將苦楝皮(2kg)粉碎，用85 %乙醇熱回流提取（15L X 3次），合并提取 液，濃縮至無醇味（3L)，依次用石油醚（3L X 3次）、乙酸乙酯（3L X 3次）和水飽和的正丁醇 (3LX3次）萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b)步驟(a)中 乙酸乙酯萃取物用D101型大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個柱體積，再用85%乙醇洗脫 12個柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1 (12個柱體積）、50:1 (10個柱體積）、25:1 (8個柱體積)和12:1(8個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組 分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1(6個柱體積）、12:1(8個柱體積)和2:1(6 個柱體積)的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵 合的反相硅膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積 洗脫液，洗脫液減壓濃縮得到化合物（I) (HPLC歸一化純度大于98% )。
[0022] 結構確證:冊431-]\^顯示[]\?^]+為111/2 519.3122，結合核磁特征可得分子式為 C31H44〇5，不飽和度為 10。核磁共振氫譜數據δΗ(ρρπι，DMS〇-d6，400MHz):H-7 (2 · 03，dd，J = 13.8,7.4)，H-7(2.51，m)，H-8(1.86，m)，H-10(1.42，m)，H-10(1.84，m)，H-ll(1.75，m)，H-ll (2.11，m)，H-12(2.46，m)，H-14(1.91，d，J=14.3)，H-14(2.87，d，J = 14.3)，H-15(1.38，s)， H-16(1.29，s)，H-17(2.88，m)，H-17(2.91，m)，H-18(5.17，t，J=7.3)，H-20(1.62，s)，H-21 (1.73，s)，H-22(2.54，m)，H-22(2.63，dd，J=ll ·6,6·7)，H-23(4.81，t，J = 8.0)，H-25 (1.47，s)，H-26(1.39，s)，H-28(2.63，dd，J=14.2,7.5)，H-28(3.01，dd，J=14.2,6.4)，H-29(2.20，111)，!1-30(0.82，(1，了 = 6.7)，!1-31(0.91，(1，了 = 6.7);核磁共振碳譜數據6。（卯111， DMS0-d6，100MHz):196.8(C3-C)，112.6(C，2-C)，197.4(C，3-C)，59.3(C，4-C)，208.5(C，5-C)，60.4(C，6-C)，27.1(CH2,7-C)，42.9(CH，8-C)，78.4(C，9-C)，40.2(CH2，10-C)，22.7(CH2， 11-C)，44.8(CH，12-C)，70.6(C，13-C)，38.7(CH2，14-C)，27.8(CH3，15-C)，23.6(CH 3，16-C)， 33.5(CH2，17-C)，118.2(CH，18-C)，135.6(C，19-C)，25.5(CH3,20-C)，17.3(CH 3,21-C)，41.6 (CH2,22-C)，116.3(CH，23-C)，138.1(C，24-C)，25.5(CH 3,25-C)，17.6(CH3,26-C)，204.1(C， 27-0,47.8(012,28-0,25.4(01,29-0,22.1(013,30-0,22.4(013,31-0,11-^^ 譜顯示 八個甲基信號（δΗ0·82,0·91，1.29,1.38,1.39,1.47,1.62,1.73)，以及兩個烯屬次甲基質 子(δΗ4.81和5.17)。 130匪1?譜顯示31個碳信號，包括八個甲基，七個亞甲基，五個次甲基(兩 個烯屬次甲基），以及十一個季碳(三個酮羰基，三個烯屬季碳，兩個含氧季碳，以及一個烯 屬含氧季碳 hHMBC 譜中 Η2-7 和 Η2-14 與 C-3，C-4 和 C-5，Me-15 與 C-12，C-13 和 C-14，Me-16 與 C-8，C-9和C-10,以及H2-17和H2-22與C-l，C-5和C-6的相關性表明該化合物為間苯三酚類化合 物。HMBC譜中，H2-17和H2-22與C-l，C-5和C-6，Me-20和Me-21 與C-19和C-18，以及Me-25和Me-26與C-24和C-23的相關性表明C-6位連有兩個2-甲基-2-丁烯基團。根據兩個含氧碳信號[δ C70.6(C-13)和78.4(C-9)]，以及核磁數據和不飽和度，可知C-9和C-13之間存在一個氧橋。 此外，通過對HMBC譜和 1H-1!! COSY譜仔細分析可知該化合物還含有一個異丁基結構[δΗ2.63 (lH，dd，J = 14.2,7.5Hz)，3.01(lH，dd，J=14.2,6.4Hz)，2.20(lH，m)，0.82(3H，d，J = 6.7抱）和0.91(3!1，(1，了 = 6.7抱）；3047.8,25.4,22.1和22.4]川(^5￥譜中，!1-1你（3!11.91)與 H-12和Η-7β(δΗ2.03)的相關性表明B環為椅式構象。NOESY譜中H-8與Me-16和H-12，Me-15與 H-12和Η-14β的相關性表明H-8，Me-15和Me-16為β構型。此外，H-18與Η-7β，以及H-23與H-14 β的相關性表明Α環中C-5與C-6的序列在螺碳C-4的上側。綜合氫譜、碳譜、HMBC譜和NOE SY 譜，以及文獻關于相關類型核磁數據，可基本確定該化合物如下所示，立體構型進一步通過 ECD試驗確定，理論值與實驗值基本一致。該化合物化學式及碳原子編號如下：
[0024] 實施例2:藥理作用
[0025]本實施例采用劃割剝離大鼠牙齦并喂以白砂糖制備牙周炎大鼠模型，觀察藥物改 善動物牙齦紅腫，潰瘍，萎縮等方面的抗牙周炎的作用。
[0026] 1、材料與方法
[0027] 1.1動物
[0028] 選用牙體牙列完整，無齲壞及牙周病的5周齡SD大鼠，雌雄各半，體重200±20g，由 湖北省實驗動物研究中心提供。
[0029] 1.2試劑與樣品
[0030] 石杉堿甲購自中國藥品生物制品檢定所。化合物（I)自制，制備方法見實施例1。白 砂糖，配成10%糖水作為飲用水，常規飼料，喂時用此糖水浸泡成軟飼料。口泰(復方氯己定 含漱液），深圳南粵藥業有限公司。
[0031] 1.3儀器
[0032] 眼科及手術器材一套;注射器;體視鏡;動物全自動血球計數儀，特康科技有限公 司。
[0033] 1.4大鼠分組及模型制備
[0034]大鼠隨機分為6組，每組13只大鼠（其中1只在造模2周后處死，取病理材料），分籠 飼養在已取得屏障環境使用許可證的設施中，分別為正常對照組、模型對照組、陽性對照組 (口泰組，l〇mg · kg-4和石杉堿甲組（10mg · kg-4、化合物⑴組（10mg · kg-4、石杉堿甲與 化合物（I)組合物組【5mg · kg^1石杉堿甲+5mg · kg^1化合物（I)】。以一把大鑷子開口，以眼 科用彎剪對兩側牙齒周圍牙齦進行劃割剝離，然后喂以用10%的白砂糖水、并喂白砂糖水 浸泡的軟飼料，造模結束改用正常飲食，每天觀察動物狀況。
[0035]造模成功后，每天兩次按照上述劑量口腔內滴注給藥，用藥后禁飲食4h。連續給藥 3天。
[0036] 1.5銀出血指數（sulus bleeding index，SBI)測定實驗
[0037] 用探針輕探選用牙的牙周袋或齦溝10s:不出血，游離齦緣無炎癥為0;游離齦緣無 紅腫，探診出血為1;游離齦緣發紅水腫，探診出血為2;自發性出血，牙齦明顯紅腫，潰瘍為 3〇
[0038] 1.6菌斑指數(plaque index，PLI)測定實驗
[0039]用小棉粒蘸菌斑染色劑(2%堿性品紅)涂于選用牙上30s后，自來水沖洗10s，觀察 牙面上紫紅色的面積和深淺情況，近齦緣區無菌斑為0,近齦緣區牙面有薄菌斑為1，齦緣或 鄰面有菌斑為2，齦溝和/或齦緣及鄰近面有大量菌斑為3。
[0040] 1.7探診深度(probing depth，PD)測定實驗
[0041] 用自制帶有刻度(刻度單位3mm)的細探針探選用牙牙周袋，每牙選近中頰、頰側、 遠中頰3個點測量，取均值。
[0042] 1.8牙齒松動度(Tooth mobility，TM)測定實驗
[0043] 不松動為0，輕度松動即向頰向松動為1，中度松動即向近遠中向松動為2，重度松 動即垂直向松動為3。
[0044] 1 · 9牙槽骨吸收值(alveolar bone loss，ABL)測定實驗
[0045] 大鼠處死后，取下頭顱，沸水煮，去肉存骨，解剖鏡下測量，從釉牙骨質界到牙槽骨 嵴頂的長度，每牙選近中舌、舌側、遠中舌3個點測量，取均值。
[0046] 1.10統計學方法
[0047]實驗數據用均數土標準差(x土s)表示，應用SPSS18.0版統計軟件進行單因素方差 分析和t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。
[0048] 2、實驗結果
[0049] 2.1對牙周炎模型大鼠齦出血指數(SBI)、菌斑指數(PLI)、探診深度(PD)的影響
[0050] 與正常對照組比，模型對照組大鼠齦出血指數SBI、菌斑指數PLI、探診深度ro明顯 增加(P<〇.01);與模型對照組比，石杉堿甲與化合物（I)組合物組和口泰組大鼠齦出血指 數SBI、菌斑指數PLI、探診深度PD明顯降低(P<0.01);與模型對照組比，石杉堿甲組、化合 物（I)組大鼠齦出血指數SBI、菌斑指數PLI、探診深度ro降低(P<0.05)。實驗結果見表1。 [0051 ] 2.2對牙周炎模型大鼠牙槽骨吸收值(ABL)和牙齒松動度(TM)的影響
[0052]與正常對照組比較，模型對照組大鼠的牙槽骨吸收值和牙齒松動度明顯增加(P< 〇. 01)。與模型對照組比較，石杉堿甲與化合物（I)組合物組和口泰組牙槽骨吸收值和牙齒 松動度明顯減小(P<〇.01);與模型對照組比較，石杉堿甲組、化合物（I)組牙槽骨吸收值和 牙齒松動度減小(P<〇. 05)。結果見表1。
[0053]表1對牙周炎模型大鼠臨床指標的改善和牙槽骨吸收值、牙齒松動度的影響
[0055] 目前常用局部刺激或全身因素+局部刺激共同作用制備牙周炎。主要的局部刺激 因素有高糖飲食、結扎、手術刺激、口腔接種特異菌等方法，自身因素要應用激素與免疫抑 制劑。應用激素或免疫抑制方法造模或是周期長，模型不穩定，或是與臨床病理變化不一 致，或是操作不方便，易使動物死亡或個體差異大等不足，影響藥物療效的觀察和評價。
[0056] 本實驗采用局部剝離加高糖飼料和高糖飲水喂養的方法，使實驗動物口腔明顯地 出現了菌群失調及類似人類牙周炎病理改變。牙齦局部剝離為高糖飼料提供固著點，能使 厭氧菌快速增殖，高糖飲水為厭氧菌生長提供良好環境，高糖飼料進一步為厭氧菌生長提 供穩定的營養和環境。該方法制備模型方便易行，便于普及，實驗周期短，二至三周即可形 成典型牙周炎，并可見牙周袋形成，模型穩定，個體差異小。
[0057] 牙周探診是牙周病最重要的檢查方法，包括探診深度和探診出血陽性率等內容。 牙齦的炎癥和出血以及牙周袋形成是牙周炎最重要的病理改變。探診深度可反映牙周袋深 度的變化，袋深者炎癥較重;探診是否出血是顯示牙齦有無炎癥較客觀的指標，探診不出血 的牙位提示牙周組織處于較健康狀態，而出血陽性部位則提示需要繼續治療。
[0058] 結果表明，石杉堿甲、化合物（I)單獨作用時，對牙周炎具有治療作用;石杉堿甲和 化合物(I)聯合作用時，治療效果進一步提高，可以開發成治療牙周炎的藥物。
[0059] 上述實施例的作用在于說明本發明的實質性內容，但并不以此限定本發明的保護 范圍。本領域的普通技術人員應當理解，可以對本發明的技術方案進行修改或者等同替換， 而不脫離本發明技術方案的實質和保護范圍。
【主權項】
1. 一種具有下述結構式的化合物（I)，2. -種石杉堿甲的藥物組合物，其特征在于:包括石杉堿甲、如權利要求1所述的化合 物(I)和藥學上可以接受的載體，制備成需要的劑型。3. 根據權利要求2所述的石杉堿甲的藥物組合物，其特征在于:藥學上可以接受的載體 包括稀釋劑、賦形劑、填充劑、粘合劑、濕潤劑、崩解劑、吸收促進劑、表面活性劑、吸附載體 或潤滑劑。4. 根據權利要求2所述的石杉堿甲的藥物組合物，其特征在于:所述劑型包括片劑、膠 囊劑、口服液、口含劑、顆粒劑、沖劑、丸劑、散劑、膏劑、丹劑、混懸劑、粉劑、溶液劑、注射劑、 栓劑、噴霧劑、滴劑或貼劑。5. 權利要求1所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于，包含以下操作步驟：（a)將苦 楝皮粉碎，用80~90%乙醇熱回流提取，合并提取液，濃縮至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙 酯和水飽和的正丁醇萃取，分別得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物和正丁醇萃取物；（b) 步驟(a)中正丁醇取物用大孔樹脂除雜，先用30%乙醇洗脫6個柱體積，再用85%乙醇洗脫 12個柱體積，收集85%洗脫液，減壓濃縮得85%乙醇洗脫濃縮物；（c)步驟(b)中85%乙醇洗 脫濃縮物用正相硅膠分離，依次用體積比為100:1、50:1、25:1和12:1的二氯甲烷-甲醇梯度 洗脫得到4個組分；（d)步驟(c)中組分4用正相硅膠進一步分離，依次用體積比為20:1、12:1 和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脫得到3個組分；（e)步驟(d)中組分2用十八烷基硅烷鍵合的 反相硅膠分離，用體積百分濃度為88 %的甲醇水溶液等度洗脫，收集13~16個柱體積洗脫 液，洗脫液減壓濃縮得到化合物(I)。6. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)用85%乙醇熱回 流提取，合并提取液。7. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:所述大孔樹脂為D101型 大孔吸附樹脂。8. 根據權利要求5所述的化合物（I)的制備方法，其特征在于:步驟(a)中用二氯甲烷代 替乙酸乙酯進行萃取，得到二氯甲烷萃取物。9. 權利要求1所述的化合物（I)在制備治療牙周炎的藥物中的應用。10. 權利要求2~4任一所述的石杉堿甲的藥物組合物在制備治療牙周炎的藥物中的應 用。
【文檔編號】A61K31/4748GK106046017SQ201610398831
【公開日】2016年10月26日
【申請日】2016年6月7日
【發明人】黃芳
【申請人】黃芳