發酵纖維素水解液來生成乙醇的方法【專利摘要】本發明涉及發酵纖維素水解液來生成乙醇的方法。本發明揭示一種用于制備乙醇的方法，它包括下列步驟：提供纖維素水解液，它含有可發酵糖與至少一種選自于由下列所構成的群組中的發酵抑制物：醋酸、羥甲糠醛、糠醛以及酚類化合物；添加含氨的水性溶液至該纖維素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及將木糖?利用的釀酒酵母菌添加至該混合液中，并容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。DSM2550820111220【專利說明】發酵纖維素水解液來生成乙醇的方法
技術領域：
[0001]本發明有關于一種用于制備乙醇的方法，它包括下列步驟：提供纖維素水解液（cellulosichydrolysate)，它含有可發酵糖（fermentablesugars)與至少一種選自于由下列所構成的群組中的發酵抑制物（fermentationinhibitor):醋酸、輕甲糠醛(hydroxymethylfurfural)、糖酸（furfural)以及酸類化合物（phenoliccompounds);添加含氨的水性溶液（aqueoussolutioncomprisingammonia)至該纖維素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及將木糖-利用的釀酒酵母菌(xylose-utilizingSaccharomycescerevisiae)添加至該混合液中，并容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。【
背景技術：
】[0002]木質纖維素生物質（lignocellulosicbiomass)是一種經由工業與農林業運作而被大量地生產的可再生能量資源（renewableenergyresources)。利用化學方法或生物學方法來將木質纖維素生物質轉換成生物質能[也就是說纖維素乙醇（cellulosicethanol)]已被廣泛地研究與探討。相較于化學方法，生物學方法因為對于生態環境較為有利并且能源需求較低而特別受到重視。[0003]由于木質纖維素具有特殊的結晶結構（crystallinestructure)，它主要含有纖維素（cellulose)、半纖維素（hemicellulose)以及木質素（lignin)，因此在生成纖維素乙醇的過程中必須經過下面2個步驟：（1)將木質纖維素經過適當的前處理（pretreatment)與水解處理（hydrolysisprocess)而使得纖維素與半纖維素釋出六碳糖（主要為葡萄糖）與五碳糖（主要為木糖）；以及（2)將所得到的六碳糖與五碳糖進行微生物發酵(microbialfermentation)以產生乙醇。在利用木質纖維素生物質來生成乙醇的過程中會得到纖維素水解液，該纖維素水解液除了含有六碳糖與五碳糖等外，還具有部分因上述前處理造成五碳糖或六碳糖以及木質素降解而釋放出的發酵抑制物[例如醋酸、糠醛、羥甲糠醛（HMF)以及酚類化合物等]。[0004]釀酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae)具有將纖維素水解液中的六碳糖(例如葡萄糖）轉化為乙醇的代謝能力，因而已被廣泛地利用于工業發酵產業上。但是，釀酒酵母菌無法有效利用該纖維素水解液中所存在的大量五碳糖（例如木糖、阿拉伯糖等）。因此，近年來有許多研究是通過遺傳代謝工程（geneticmetabolicengineering)的方式來改善上述問題的。例如，將木糖-發酵細菌（xylose-fermentationbacteria)中與木糖代謝路徑有關聯的基因導入至釀酒酵母菌中，由此所得到的木糖-發酵釀酒酵母菌（xylose-fermentingSaccharomycescerevisiae)可以有效地共發酵五碳糖與六碳糖，進而增加乙醇的產量（B.Hahn-I-Idgerda丨等人（2007)，Appl.Microbiol.Biotechnol.，74:937-953)。[0005]此外，于TW1450963(對應于US20140087438A1和CN103695329A)當中，申請人也揭示一種具有木糖還原酶基因（xylosereductasegene)、木糖醇脫氫酶基因(xylitoldehydrogenasegene)與木酮糖激酶基因（xylulokinasegene)的釀酒酵母菌，它以寄存編號DSM25508被寄存于德國微生物菌種保藏中心（DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，DSMZ)，并且以寄存編號BCRC920077被寄存于新竹食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心（FIRDI的BCRC)。這件前案專利的全部公開內容在此并入本申請以作為參考。[0006]雖然已有文獻揭示通過對釀酒酵母菌進行基因修飾來提高乙醇的產量，但是纖維素水解液中所含有的發酵抑制物會抑制釀酒酵母菌的生長與發酵，而使得五碳糖與六碳糖的利用率降低，進而影響乙醇的產量。[0007]為了降低發酵抑制物所造成的不利影響，已有研究利用菌種的馴化(acclimation)或基因改造（geneticmodification)的方式來提高釀酒酵母菌對于這些發酵抑制物的耐受性，借此提升乙醇的產量。例如，在CarlosMartin等人(2007)，BiosourceTechnology,98:1767-1773中，CarlosMartin等人將基因重組的木糖-利用的釀酒酵母菌培養于添加有甘鹿渣水解液（sugarcanebagassehydrolysates)的培養基中，并將含有各種抑制物[包括酚類化合物、糠醛以及脂族酸（aliphaticacid)]的甘蔗渣水解液，以持續進料的方式添加至該培養基中以提高抑制物的濃度，借此讓該木糖-利用的釀酒酵母菌可以進行適應（adaptation)。所得到的經適應的菌株可以較快的速率來轉化糠醛與HMF，并且相較未經適應的原始菌株具有較高的乙醇產量。[0008]在PeterssonA?等人（2006)，Yeast,23:455-464中，PeterssonA?等人通過轉基因的方式讓釀酒酵母菌可以大量表達負責還原HMF的NADPH-依賴的乙醇脫氫酶(NADPH-dependantalcoholdehydrogenase)ADH6基因，所得到的過度表達ADH6基因的酵母菌菌株經由實驗證實，在糠醛存在下可以有效地利用人工培養基中所含有的葡萄糖，并且具有較高的HMF轉換率（conversionrate)[也就是說可將更多的HMF還原成5-輕甲糠醇（5-hydroxymethylfurfurylalcohol)]，這表示該過度表達ADH6的菌株對于HMF更具耐受性。[0009]另外，在GorsichSW等人（2006)，ApplMicrobiolBiotechnol.，71:339-349中，GorsichSW等人發現過度表達ZWF-1的釀酒酵母菌菌株在添加有毒性濃度的糠醛的人工葡萄糖培養基中可以生長，這表示該會過度表達ZWF-1的菌株對于糠醛具有耐受性并且能更有效地將木質纖維素轉化為乙醇。[0010]雖然上述涉及基因工程的研究已可提高釀酒酵母菌對于發酵抑制物的適應性，但是轉基因的穩定性須長期追蹤與確認，若要將其大規模地應用于發酵工業上來達致大量發酵產乙醇的目的，仍有其限制并且存在有高風險。[0011]為此，即有人提出在無須使用經特殊轉基因的菌株的情況下，通過去毒處理(detoxification)來移除纖維素水解液中的發酵抑制物，以降低發酵抑制物的不利影響。常見的去毒處理包括：⑴物理去毒處理（physicaldetoxification)，諸如蒸發(evaporation)以及膜介導的去毒處理（membranemediateddetoxification);(2)化學去毒（chemicaldetoxification)，諸如中和（neutralization)、氫氧化|丐超施石灰(calciumhydroxideoverliming)、活性炭處理（activatedcharcoaltreatment)以及離子交換樹脂（ionexchangeresins);以及（3)生物去毒（biologicaldetoxification)，諸如使用蟲漆酶（laccase)或木質素過氧化物酶（ligninperoxidase)等。但是，這些去毒處理會使得纖維素乙醇的制程變得較為繁雜，而所需要的成本也相對提高，同時可能會使纖維素水解液中的還原糖流失。[0012]因此，發展出一種無須經去除發酵抑制物的處理且直接對纖維素水解液進行發酵產乙醇的方法，從而能簡化操作程序、降低成本與耗能，以及有效地利用有機廢棄物來生產乙醇以供作為干凈的生物質能源，會是我們所企望達成的。【
發明內容】[0013]于是，在第一個方面，本發明提供一種用于制備乙醇的方法，它包括：[0014]提供纖維素水解液，它含有可發酵糖與至少一種選自于由下列所構成的群組中的發酵抑制物：醋酸、羥甲糠醛、糠醛以及酚類化合物；[0015]添加含氨的水性溶液至該纖維素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及[0016]將木糖-利用的釀酒酵母菌添加至該混合液中，并容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。[0017]本發明的方法，在發酵所述混合液的過程中，通過添加所述含氨的水性溶液而使得所述混合液的pH值被維持落在5.5至7.0的范圍內。[0018]本發明的方法，所述混合液具有pH值落在5.5至6.5的范圍內。[0019]本發明的方法，所述混合液具有pH值落在5.8至6.2的范圍內。[0020]本發明的方法，所述含氨的水性溶液選自于下列所構成的群組：氫氧化銨水溶液、硫酸銨水溶液、氯化銨水溶液，以及它們的組合。[0021]本發明的方法，所述可發酵糖包含一種五碳糖以及一種六碳糖。[0022]本發明的方法，所述可發酵糖包含葡萄糖與木糖。[0023]本發明的方法，所述纖維素水解液通過對一種纖維素生物質依序地進行前處理以及水解處理而被制得，所述纖維素生物質選自于下列所構成的群組：生物能源作物、農業殘余物、都市固體廢棄物、工業固體廢棄物、來自造紙的淤泥、庭園廢棄物、廢材與林業廢棄物，以及它們的組合。[0024]本發明的方法，所述纖維素生物質選自于下列所構成的群組：芒草、軟木、硬木、玉米穗軸、作物殘渣、玉米秸桿、禾草、麥桿、大麥桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、蜀黍植物材料、大豆植物材料、得自谷粒的研磨的組分、樹木、樹枝、根、葉、木肩、灌木與灌木叢、蔬菜、水果以及花，以及它們的組合。[0025]本發明的方法，所述前處理選自于下列所構成的群組：蒸氣爆裂、熱化學前處理法、機械粉碎、酸處理、有機溶解、亞硫酸鹽前處理，以及它們的組合。【具體實施方式】[0026]本發明的上述以及其它目的、特征與優點，在參照以下的詳細說明與較佳實施例后，將變得明顯。[0027]除非另外有所定義，在本文中所使用的所有技術性與科學術語具有熟悉本發明所屬技藝的人士所共同了解的意義。熟悉本技藝者會認知到許多與那些被描述于本文中的相似或等效的方法和材料，它們可被用于實施本發明。當然，本發明決不受到所描述的方法和材料的限制。[0028]為了有效解決能源枯竭的問題以及避免生態環境持續遭受破壞，本
技術領域：
的研究人員致力于開發潔凈的生物質能。利用生物質性廢棄物作為酵母菌的發酵原料來生產乙醇不但可以解決廢棄物所造成的環保問題，也可達到廢棄物再利用的目的，因而成為目前最受重視的研究方向。[0029]植物性生物質含有大量的纖維素、半纖維素及木質素等成分，這些成分會互相纏繞包覆而形成復雜且堅韌的網狀結構，這會使得在利用植物性生物質來生產乙醇的過程中受到限制，因此該植物性生物質通常會先經過適當的前處理[如熱化學分解(thermochemicaldegradation)]來幫助它的網狀結構打開，繼而經由纖維素分解酶將其水解成五碳糖以及六碳糖。然而，植物性生物質在經過上述處理后所產生的發酵抑制物(例如，醋酸、糠醛以及羥甲糠醛等）會影響酵母菌發酵產乙醇的能力。為了解決此問題，目前較常使用的方法是對酵母菌菌株進行基因改造或馴化，或是進一步將所述發酵抑制物移除，從而提高乙醇的整體產率。但是，經基因改造或馴化的酵母菌菌株需要定期追蹤以確保它所具有的特性仍存在，而移除抑制物會使得制程復雜化且導致成本遽增。[0030]基于上述，【申請人】致力于發展一種可供工業發酵產業更有效地利用纖維素并大規模地生成乙醇的方法，特別地，該方法不需要對纖維素水解液進行去毒處理，也不需要通過馴化或基因重組的方式來降低發酵抑制物對于釀酒酵母菌菌株的影響，同時能提升木糖-利用的釀酒酵母菌對于纖維素水解液的木糖利用率，并降低木糖醇的累積，進而增加乙醇的產量。[0031]于是，【申請人】經多方研究后，于本發明中提供一種用于制備乙醇的方法，它包括下列步驟：[0032]提供纖維素水解液，它含有可發酵糖與至少一種選自于由下列所構成的群組中的發酵抑制物：醋酸、羥甲基糠醛、糠醛以及酚類化合物；[0033]添加含氨的水性溶液至該纖維素水解液中，以形成具有pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及[0034]將木糖-利用的釀酒酵母菌添加至該混合液中，并容許該釀酒酵母菌來發酵該混合液，而使得乙醇被生成。[0035]依據本發明，在發酵該混合液的過程中，通過添加該含氨的水性溶液而使得該混合液的pH值被維持落在5.5至7.0的范圍內。[0036]較佳地，該混合液的pH值被維持在為5.5至6.5的范圍內。更佳地，該混合液的pH值被維持在為5.8至6.2的范圍內。在本發明的一個較佳具體例中，該混合液的pH值被維持在6.0。[0037]如本文中所用的，術語"木糖-利用的釀酒酵母菌"與"木糖-發酵的釀酒酵母菌"可被交替地使用，它意欲涵蓋具有木糖發酵能力的所有釀酒酵母菌菌株，其中包括那些為熟習此項技術人士所易于獲得者（例如，可購自于國內或國外寄存機構者），或者利用本技藝中所慣用的基因改造方法將不具有木糖發酵能力的天然釀酒酵母菌菌株進行轉基因而制得者。有關木糖-利用的釀酒酵母菌菌株可參見，但不限于：CarlosMarin等人（2002)，EnzymeandMicrobialTechnology,31:274-282;MiroslavSedlak和Nancyff.Y.Ho(2004),AppliedBiochemistryandBiotechnology,113-116:405-416；B.Halltl-H3ger^al等人（2007)(同上述）；ZhangA?等人（2007)，LettersinAppliedMicrobiology,44:212-217；HubmannG?等人(2011),AppliedandEnvironmentalMicrobiology,77:5857-5867;US20130196399A1;以及TW1450963等。[0038]在本發明的一個較佳具體例中，該木糖發酵的釀酒酵母菌是一株fpsl基因與gpd2基因皆被刪除或破壞的釀酒酵母菌菌株。在本發明的一個更佳具體例中，該木糖發酵的釀酒酵母菌通過將一株以寄存編號BCRC920077被寄存于食品工業發展研究所的生物資源保存及研究中心（FIRDI的BCRC)的釀酒酵母菌的基因組DNA中的fpsl基因與gpd2基因進行刪除或破壞而被制得。[0039]如本文中所用的，術語"含氨的水性溶液（aqueoussolutioncomprisingammonia)"意指在水性介質中添加下列物質：氨氣（ammoniagas)(NH3)、包含銨離子（ammoniumions)(NH4)的化合物[諸如，氫氧化銨（ammoniumhydroxide)、氯化銨(ammoniumchloride)或硫酸銨（ammoniumsulfate)]、在分解后釋放氨的化合物（諸如尿素），以及它們的組合。[0040]依據本發明，該含氨的水性溶液是氫氧化銨水溶液（即氨水）或氯化銨水溶液。在本發明的一個較佳具體例中，該含氨的水性溶液是氨水。[0041]依據本發明，該纖維素水解液通過對纖維素生物質（cellulosicbiomass)依序地進行前處理以及水解處理而被制得。[0042]如本文中所用的，術語"纖維素水解液"與"木質纖維素水解液"和"生物質水解液(biomasshydrolysate)"可被交替地使用，并且意指由生物質的糖化（saccharification)所產生的產物，其中術語"糖化（saccharification)"表示從多糖產生可發酵糖。[0043]如本文中所用的，術語"纖維素生物質"與"木質纖維素生物質（lignocellulosicbiomass)"可被交替地使用，并且意指任何包括纖維素、半纖維素、木質素、淀粉、寡糖和/或單糖的纖維素材料。[0044]依據本發明，該纖維素生物質可以衍生自單一來源，或者該纖維素生物質可以包含衍生自多種來源的混合物。例如，該纖維素生物質可以為由玉米秸桿（cornstover)與玉米穗軸（corncobs)所構成的混合物，或者由禾草（grass)與葉所構成的混合物。[0045]適用于本發明的纖維素生物質包括，但不限于：生物能源作物（bioenergycrops)、農業殘余物（agriculturalresidues)、都市固體廢棄物（municipalsolidwaste)、工業固體廢棄物（industrialsolidwaste)、來自造紙的齡泥（sludgefrompapermanufacture)、庭園廢棄物（yardwaste)、廢材（woodwaste)與林業廢棄物(forestrywaste)，以及它們的組合。[0046]較佳地，該纖維素生物質選自于下列所構成的群組：芒草（miscanthus)、軟木(softwood)、硬木（hardwood)、玉米糖軸（corncobs)、作物殘渣（cropresidues)[諸如玉米殼（cornhusks)]、玉米猜桿（cornstover)、禾草（grasses)、麥桿（wheatstraw)、大麥桿（barleystraw)、干草（hay)、稻桿（ricestraw)、柳枝稷（switchgrass)、廢紙（wastepaper)、甘鹿渣（sugarcanebagasse)、蜀黍植物材料（sorghumplantmaterial)、大豆植物材料（soybeanplantmaterial)、得自谷粒（grains)的研磨的組分、樹木、樹枝、根、葉、木肩（sawdust)、灌木（shrubs)與灌木叢（bushes)、蔬菜、水果以及花，以及它們的組合。[0047]適用于本發明的前處理包括，但不限于：蒸氣爆裂（steamexplosion)、熱化學前處理法（thermalchemicalpretreatment)、機械粉碎、酸處理、有機溶解（organosolve)、亞硫酸鹽前處理（sulfitepretreatment)，以及它們的組合。在本發明的一個較佳具體例中，該纖維素生物質在被進行該水解處理前有先經過蒸氣爆裂處理。[0048]依據本發明，該纖維素水解液在加入該含氨的水性溶液前可進一步被混合以營養鹽組合物。在本發明的一個較佳具體例中，該營養鹽組合物包含有下列鹽類：(NH4)2S04、MgS04?7H20以及KH2P04。[0049]〈實施例〉[0050]本發明將就下面的實施例來做進一步說明，但應了解的是，這些實施例僅供例示說明用，而不應被解釋為本發明的實施上的限制。[0051]-般實驗材料：[0052]1?制備AfpslAgpd2雙突變的釀酒酵母菌接種源（inoculumoftheAfpslAgpd2doublemutantofSaccharomycescerevisiae)：[0053]在下面實驗中所使用的釀酒酵母菌菌株是AfpslAgpd2雙突變的釀酒酵母菌，它大體上依據ZhangA?等人（2007)(同上述）以及HubmannG?等人（2011)(同上述）當中所述的方法而被制備。簡言之，首先，依據ZhangA.等人（2007)(同上述）當中所述的方法，將可共發酵五碳糖與六碳糖的釀酒酵母菌BCRC920077(得自于【申請人】先前專利申請TW1450963,也以寄存編號DSM25508被寄存于DSMZ)的fpsl基因剔除，繼而將所得到的Afpsl突變菌株進一步依據HubmannG.等人（2011)(同上述）當中所揭示的方法來進行gpd2基因的剔除，借此而得到AfpslAgpd2雙突變的釀酒酵母菌菌株（下面簡稱"經雙突變的釀酒酵母菌"）。[0054]之后，將上述所得到的經雙突變的釀酒酵母菌接種于YH)培養基中，并于恒溫振蕩培養箱（30°C、200rpm)內進行培養直到0D_值達至20。接著，將所形成的培養物予以離心，然后收集細胞沉淀物并使用無菌水予以清洗數次，繼而以無菌水來充分懸浮菌體，由此所得到的細胞懸浮液被拿來作為下面實施例中的經雙突變的釀酒酵母菌接種源。[0055]2.纖維素水解液（cellulosichydrolysate)的制備：[0056]在下面實施例中所使用的纖維素生物質包括：稻桿（得自于弘遠農產商行）以及芒草（得自于嘉義大學農改場）。首先，將芒草或稻桿切成適當的尺寸，繼而以粉碎機予以粉碎，接著加入3wt%硫酸溶液予以混合均勻，并在60°C下進行反應歷時60分鐘。之后，將所得到的混合物置于立式圓筒型高壓蒸煮槽（購自于七福工業股份有限公司），繼而通入蒸氣并在為190至200°C的溫度下進行加熱歷時7分鐘。接著，將通過上述酸催化蒸氣爆裂前處理（acid-catalyzedsteamexplosionpretreatment)所得到的蒸煮液以NaOH來調整pH值至5.0,繼而加入由纖維素酶（cellulase)與半纖維素酶（hemicellulase)所構成的混合物（NovozymesCellic?CTec3,使用量為0.12克酶混合物/克纖維素生物質），并在為50°C的溫度下以及為120rpm的攪拌速率下進行纖維素分解處理（cellulolyticprocesses)歷時72小時，借此而得到經酸催化蒸氣爆裂的稻桿或芒草纖維素水解液。[0057]另外，經蒸氣爆裂的稻桿或芒草纖維素水解液大體上依據上述方式來進行制備，不同的地方在于：在進行前處理時，以水代替硫酸溶液來與經粉碎的纖維素生物質進行混合。[0058]3.在下面的實施例中，用于添加至纖維素水解液的營養鹽組合物具有下面表1所示的配方。[0059]表1.營養鹽組合物的配方[0060][0061]-般實驗方法：[0062]1.高效液相層析（highperformanceliquidchromatography,HPLC)分析：[0063]在下面的實施例中，纖維素水解液以及發酵代謝物（fermentationmetabolites)中所含有的成分及其濃度（g/U參考美國國家再生能源實驗室（NationalRenewableEnergyLaboratory,NREL)所頒布的有關標準生物質分析的實驗室分析程序（laboratoryanalyticalprocedures,LAPs)，并通過使用配備有一個折射率（RI)偵測器（refractiveindexdetector)的高效液相層析儀（DI0NEXUltimate3000)來進行測定，其中所使用的管柱以及操作條件如下：分析管柱為AminexHPX-87H管柱（BioRad);流動相為5mM硫酸(配于水中）；流速被控制為0.6mL/分鐘；樣品注射體積為20yL;RI溫度控制在65°C。[0064]此外，為供比對，使用不同濃度的葡萄糖（1.2-24mg/mL)、木糖（1.2-24mg/mL)、木糖醇（〇?2-6mg/mL)、甘油（0?2-8mg/mL)、輕甲糠醛（HMF)(0?2-8mg/mL)、醋酸（0?2-12mg/mL)、乙醇（1.0-15mg/mL)、糠醛（0?2-8mg/mL)以及酸類化合物（0?2-8mg/mL)來分別作為校正標準品（controlstandard)并進行相同的分析，這些化學物質購自于Sigma。[0065]實施例1.在使用經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液作為基質下，添加NH40H對于經雙突變的釀酒酵母菌發酵產乙醇的影響[0066]在本實施例中，依據上面"一般實驗材料"的第2項[纖維素水解液的制備]所得到的經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液被拿來作為基質，并探討于發酵過程中NH40H堿性溶液的添加與否，對于經雙突變的釀酒酵母菌利用葡萄糖與木糖來進行發酵產乙醇的影響。[0067]此外，為供比較，經去毒處理的稻桿纖維素水解液（下稱"去毒水解液"）被拿來一起進行相同的發酵實驗。有關稻桿纖維素水解液的去毒處理依據Jing-PingGe等人(2011)，AfricanJournalofMicrobiologyResearch,5:1163-1168當中所述的超施石灰(overliming)以及使用活性炭（activatedcharcoal)來進行，并略作修改。簡言之，將依據上面"一般實驗材料"的第2項[纖維素水解液的制備]所得到的經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液以適量的Ca(0H)2來調整pH值至10,繼而置于室溫下反應歷時120分鐘，接著于l〇〇〇〇rpm下予以離心歷時5分鐘，然后收集上清液并以職04溶液來調整pH值至5.0。之后，加入5%活性炭（購自于和泰股份有限公司，型號MAX-703)并在40°C下反應歷時60分鐘，接著經由過濾以及離心處理來移除活性碳濾餅（filtercake)等不可溶物質，所得到的濾液即為該去毒水解液。[0068]在進行發酵產乙醇前，該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液以及該去毒水解液分別依照上面"一般實驗方法"的第1項[高效液相層析分析]所述的方法來測量各種糖類以及抑制物的濃度，而所測得的結果被顯示于下面表2中。[0069]表2.各個水解液中的糖類以及抑制物的濃度[0070][0071]從表2可見，與該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液相較下，該去毒水解液中不含有HMF、糠醛以及酚類化合物，而僅含有較少量的醋酸。此外，該去毒水解液中的葡萄糖濃度也較低。由此可知，去毒處理會去除大部分的抑制物，但同時會使得葡萄糖的含量被降低。[0072]實驗方法：[0073]將該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液分成2組（包括對照組以及NH40H組），接著將如表1中所示的營養鹽組合物添加至各組水解液中，繼而分別以NH40H來調整pH值至6。之后，將依據上面"一般實驗材料"的第1項[制備AfpslAgpd2雙突變的釀酒酵母菌的接種源]所得到的經雙突變的釀酒酵母菌接種源以為l:20(v/v)的接種量接種至各個培養瓶中并予以混合均勻，繼而置于恒溫震蕩培養室內，并在為30°C的溫度下以及為150rpm的震蕩速率下進行發酵反應歷時72小時。在整個發酵期間，對NH40H組適時地添加NH40H以使其pH值被維持在6。至于對照組則不作任何處理。[0074]另外，該去毒水解液大體上參照上面NH40H組的方式來進行相同的實驗，唯獨使用NaOH來取代NH40H。之后，將各組的發酵培養物于12000rpm下予以離心歷時10分鐘，所得到的發酵代謝物分別依照上面"一般實驗方法"的第1項[高效液相層析分析]當中所述的方法來進行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析。有關葡萄糖或木糖的利用率是以所測得的葡萄糖或木糖的總量相對于發酵前各自所測得的總量的百分比值（％)來表示。此外，將發酵后所測得的木糖醇的總量與發酵期間木糖的總利用量（即發酵前所測得的木糖總量減去發酵后所測得者）相比較，從而獲得一個比值（即木糖醇生成量），若該比值越低，代表越多的木糖被轉化為乙醇，而非以木糖醇的形式累積。至于乙醇產量（yield)，則是通過將發酵后所生成的乙醇總量與發酵期間葡萄糖和木糖的總利用量（即發酵前所測得的葡萄糖與木糖的總量減去發酵后所測得者）相比較而被計算出。[0075]結果：[0076]本實驗所測得的結果被顯示于下面表3中。[0077]表3.各組水解液被接種以經雙突變的釀酒酵母菌并經過發酵后所測得的糖類利用率、木糖醇生成量與乙醇產量[0078][0079]從表3可見，當以經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液作為基質（無論在發酵過程中是否添加NH40H)，或者直接以去毒水解液作為基質，各組發酵代謝物所測得的葡萄糖利用率皆為100%，至于木糖利用率以及乙醇產量，NH40H組則皆顯著優于對照組。由此可知，在發酵過程中添加NH40H可以顯著地提升木糖利用率，進而增加乙醇的產量。[0080]此外，將經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液的NH40H組與去毒水解液作比較可發現，以經酸催化蒸氣爆裂的稻桿纖維素水解液作為基質并且以NH40H來調整該水解液的成分或在發酵過程中添加NH40H可以產生更佳的木糖利用率與乙醇產量。這個實驗結果顯示，本發明所揭示的技術不需要進一步經過水解液的去毒處理步驟即可以有效地提高木糖利用率與乙醇產量。[0081]實施例2.在使用經酸催化蒸氣爆裂的稻桿與芒草纖維素水解液作為基質下，添加不同堿性溶液對于經雙突變的釀酒酵母菌發酵產乙醇的影響[0082]本實施例使用依據上面"一般實驗材料"的第2項[纖維素水解液的制備]所制得的經酸催化蒸氣爆裂的稻桿或芒草纖維素水解液作為基質，并探討以不同的堿性溶液（包括NH40H、K0H以及NaOH溶液）來調整水解液的pH值，并于發酵過程中添加所述堿性溶液對于經雙突變的釀酒酵母菌利用葡萄糖與木糖來進行發酵產乙醇的影響。[0083]在進行發酵產乙醇前，該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿或芒草纖維素水解液分別依照上面"一般實驗方法"的第1項[高效液相層析分析]所述的方法來測量各種糖類以及醋酸的濃度，而所測得的結果被顯示于下面表4中。[0084]表4.經酸催化蒸氣爆裂的芒草與稻桿纖維素水解液中的葡萄糖、木糖以及醋酸的濃度[0085][0086]實驗方法：[0087]首先，將該經酸催化蒸氣爆裂的稻桿與芒草纖維素水解液各自分成3組（包括K0H組、NaOH組以及NH40H組），接著各自以K0H、Na0H以及NH40H來調整pH值至6,所得到的各組稻桿與芒草纖維素水解液大體上依據上面實施例1所述的實驗方法來進行經雙突變的釀酒酵母菌的發酵產乙醇實驗，不同的地方在于：在整個發酵期間，分別對K0H組、NaOH組以及NH40H組適時地添加NaOH、K0H以及NH40H，而使得它們的pH值皆被維持在6.0。[0088]之后，各組的發酵代謝物分別依照上面"一般實驗方法"的第1項[高效液相層析分析]當中所述的方法來進行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析，繼而依據實施例1當中的所述的方式來分別計算出糖類利用率、木糖醇生成量與乙醇產量。[0089]結果：[0090]本實驗所測得的結果被顯示于下面表5中。[0091]表5.各組稻桿與芒草纖維素水解液被接種以經雙突變的釀酒酵母菌并經過發酵后所測得的糖類利用率、木糖醇生成量與乙醇產量[0093]從表5可見，無論以稻桿或芒草纖維素水解液作為基質，各組發酵代謝物所測得的葡萄糖利用率皆為100%，至于木糖利用率以及乙醇產量，NH40H組皆顯著優于NaOH組或K0H組。由此可知，與NaOH與K0H相較下，以NH40H來調整水解液的pH值并在發酵過程中添加NH40H可以更加顯著地提升木糖利用率，并降低木糖醇累積，進而增加乙醇的產量。[0094]實施例3.在使用經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液作為基質下，通過添加NH40H來調整pH值對于經雙突變的釀酒酵母菌發酵產乙醇的影響[0095]本實施例使用依據上面"一般實驗材料"的第2項[纖維素水解液的制備]所制得的經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液作為基質，并探討于發酵過程中通過添加NH40H來將該芒草纖維素水解液的pH值分別維持在5、6或7下，對于經雙突變的釀酒酵母菌利用葡萄糖與木糖來進行發酵產乙醇的影響。[0096]在進行發酵產乙醇前，該經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液依照上面"一般實驗方法"的第1項[高效液相層析分析]所述的方法而被測量到含有7.3g/L的醋酸、81.8g/L的葡萄糖以及34.7g/L的木糖。[0097]實驗方法：[0098]首先，將該經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液分為3組（包括pH5組、pH6組以及pH7組），接著以NH40H來將pH5組、pH6組以及pH7組的pH值分別調整至5、6以及7，所得到的各組芒草纖維素水解液大體上依據上面實施例1所述的實驗方法來進行經雙突變的釀酒酵母菌的發酵產乙醇實驗，不同的地方在于：在整個發酵期間，分別對各組適時地添加NH40H，而使得它們的pH值被維持在最初所既定的數值下。[0099]之后，各組的發酵代謝物分別依照上面"一般實驗方法"的第1項[高效液相層析分析]當中所述的方法來進行葡萄糖、木糖、木糖醇以及乙醇的含量分析，繼而依據實施例1當中的所述的方式來分別計算出糖類利用率、木糖醇生成量與乙醇產量。[0100]結果：[0101]本實驗所測得的結果被顯示于下面表6中。[0102]表6.具有不同pH值的芒草纖維素水解液被接種以經雙突變的釀酒酵母菌并經過發酵后所測得的糖類利用率、木糖醇生成量與乙醇產量[0104]從表6可見，無論該經蒸氣爆裂的芒草纖維素水解液的pH值維持在5、6或7,各組發酵代謝物所測得的葡萄糖利用率皆為100%，至于木糖利用率、木糖醇生成量以及乙醇產量，pH6組皆顯著優于pH7組與pH5組。【申請人】據此而認為，在發酵過程中，通過添加NH40H來控制纖維素水解液的pH值在6.0可以達至最佳的木糖利用率，并有效降低木糖醇的累積，進而提尚乙醇的廣量。[0105]于本說明書中被引述的所有專利和文獻以其整體被并入本申請作為參考資料。若有所沖突時，本申請詳細說明（包含界定在內）將占上風。[0106]雖然本發明已參考上述特定的具體例被描述，明顯地在不背離本發明的范圍和精神下可作出很多的修改和變化。因此意欲的是，本發明只受如隨文檢附的權利要求書所示者的限制。牛物材料保藏信息說明保藏編號：DSM25508分類命名：釀酒酵母菌保藏日期：2011年12月20日保藏單位：德國微生物菌種保藏中心GmbH保藏單位地址：銀浩芬斯徹7BD-38124不倫瑞克【主權項】1.一種用于制備乙醇的方法，其特征在于，所述方法包含下列步驟：提供一個纖維素水解液，它含有一種可發酵糖與至少一種選自于由下列所構成的群組中的發酵抑制物：醋酸、羥甲基糠醛、糠醛以及酚類化合物；添加一個含氨的水性溶液至所述纖維素水解液中，以形成一個具有pH值落在5.5至7.0內的混合液；以及將一種木糖-利用的釀酒酵母菌添加至所述混合液中，并容許所述釀酒酵母菌來發酵所述混合液，而使得乙醇被生成。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，在發酵所述混合液的過程中，通過添加所述含氨的水性溶液而使得所述混合液的pH值被維持落在5.5至7.0的范圍內。3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液具有pH值落在5.5至6.5的范圍內。4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述混合液具有pH值落在5.8至6.2的范圍內。5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述含氨的水性溶液選自于下列所構成的群組：氫氧化銨水溶液、硫酸銨水溶液、氯化銨水溶液，以及它們的組合。6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述可發酵糖包含一種五碳糖以及一種六碳糖。7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述可發酵糖包含葡萄糖與木糖。8.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述纖維素水解液通過對一種纖維素生物質依序地進行前處理以及水解處理而被制得，所述纖維素生物質選自于下列所構成的群組：生物能源作物、農業殘余物、都市固體廢棄物、工業固體廢棄物、來自造紙的淤泥、庭園廢棄物、廢材與林業廢棄物，以及它們的組合。9.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述纖維素生物質選自于下列所構成的群組：芒草、軟木、硬木、玉米穗軸、作物殘渣、玉米秸桿、禾草、麥桿、大麥桿、干草、稻桿、柳枝稷、廢紙、甘蔗渣、蜀黍植物材料、大豆植物材料、得自谷粒的研磨的組分、樹木、樹枝、根、葉、木肩、灌木與灌木叢、蔬菜、水果以及花，以及它們的組合。10.根據權利要求8所述的方法，其特征在于，所述前處理選自于下列所構成的群組：蒸氣爆裂、熱化學前處理法、機械粉碎、酸處理、有機溶解、亞硫酸鹽前處理，以及它們的組合。【文檔編號】C12R1/865GK106032542SQ201510124812【公開日】2016年10月19日【申請日】2015年3月20日【發明人】莊育泉【申請人】遠東新世紀股份有限公司