一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法
【專利摘要】本發明公開了一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法，涉及植物病原菌的分離與純化技術。從采集的輪紋病枝上，切取新鮮的輪紋病斑或病鍵交界處的寄主組織，在滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養液中侵泡5~20分鐘后，直接接種30~80日齡蘋果幼果的人制傷口，在20~30℃環境下保濕培養5~7天；待接種果實發病并形成0.2~1cm寬的環狀病斑后，轉入黑光燈或紫外燈下培養5~10天，誘導病斑產生分生孢子；將孢子涂布到2%瓊脂平板上，在顯微鏡下挑取單個的分生孢子，轉入PDA培養基中培養，可獲得蘋果輪紋病菌的單孢分離菌株。本發明以克服了常規方法分離純化方法工作量大、誘導產孢困難、分離頻率低等問題，為輪紋病的研究提供了一套簡便、快捷、準確、可靠的病原菌分離純化技術。
【專利說明】
一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法
技術領域
[0001]本發明屬于植物病原菌的分離與純化研究領域，涉及病原真菌的分離、純化、誘導產孢與培養技術。
【背景技術】
[0002]蘋果輪紋病是蘋果上的重要病害，主要為害枝干和果實，在環渤海灣和黃河故道蘋果產區危害尤為嚴重，已成為蘋果樹上的第一大病害。
[0003]病菌侵染枝干形成病瘤、粗皮和干腐病斑，嚴重影響樹勢，當樹體受到干旱脅迫或衰弱時，輪紋病菌在枝干內迅速擴展，形成干腐病斑，最終導致樹體或枝干死亡；2008年，對全國7個蘋果主產省，88個果園枝干輪紋病調查表明，蘋果枝干輪紋病的總體發病率達77.6%。
[0004]輪紋病菌侵染果實，導致果實輪紋病，嚴重影響果實的產量和品質；在未套袋果實上，因輪紋病導致的爛果每年都在5%~30%之間，重病園高達80%以上。
[0005]蘋果輪紋病是由子囊菌亞門葡萄座腔菌屬方oiriWfMaeria spp.的真菌侵染引起的一種真菌病害；分離純化病原菌是開展病原菌生物學、群體遺傳、病害發生流行規律、篩選防治藥劑等項研究的前提和基礎，這些研究都需要純化的輪紋病菌。
[0006]分離與純化蘋果輪紋病的常規方法需要病菌分離、誘導產孢、單孢分離和致病性驗證4個步驟；病菌分離是從果園內采集枝條或果實上的病斑，切取病健交界處的寄主組織，用70%的酒精和次氯酸鈉消毒后，轉入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上分離培養，獲得病菌；誘導產孢是在分離獲得病原菌后，通過黑光照謝處理，誘導PDA上培養的病菌產生分生孢子；單孢分離是當誘導病菌產生孢子后，挑取單個的孢子轉入PDA培養基中，獲得單孢分離菌株；致病性驗證則是將獲得單孢分離菌株回接到蘋果果實或枝條上，能使接種果實和枝條發病的分離菌株才是致病的輪紋病，才能用于下一步的試驗研究。
[0007]蘋果輪紋病菌常規分離純化方法的缺點是:工作量大，步驟繁瑣，而且從寄主組織內分離到的雜菌多，獲得目標菌株的概率低，利用純培養的菌株誘導產孢困難，獲得單孢分離菌株的概率低。
【發明內容】
[0008]針對常規方法的缺點和不足，本發明的目的在于提供一套簡便、快捷、準確、可靠的分離純化技術，以解決蘋果輪紋病菌分離純化工作量大、誘導產孢困難、分離頻率低等問題。
[0009]本發明采用的技術原理如下:輪紋病菌能夠從傷口侵染幼齡的蘋果果實，并誘發褐色病斑；不能誘發幼果發病的真菌，不是輪紋病菌，或不是致病的輪紋病，從而對病菌的致病性進行篩選；果實發病并形成較大的病斑后，對發病果實進行黑光或紫外光照謝處理，誘導病菌產生分生孢子；蘋果幼果上的輪紋病斑在短波光的照謝下很容易產生分生孢子；挑取病斑上的單個分生孢子培養，可獲得純化且具有致病的輪紋病菌；通過單孢分離，實現對病菌的分離與純化。
[0010]本發明采用的技術方案如下:切取輪紋病的病組織直接接種蘋果幼齡果實，誘發果實產生輪紋病斑，果實發病后，將病果放在短波光下照謝，誘導病菌產生分生孢子；當病菌產孢后，挑取單個的分生孢子，轉入PAD中培養，獲得純化菌株。
[0011]具體實施方案如下:
(1)樣品采集:從目標果園內采集帶有輪紋病斑的枝條和果實，用小刀切取病斑或病健交界處的寄主組織，修成不超過5毫米見方的組織塊；接種時無需要進行消毒處理；
(2)幼果準備:從果園內摘取30~80日齡蘋果的幼果，其中50~60日富士品種果實誘導產孢效果最好；蘋果幼果可以放在3°C ~5°C的冷藏箱內長期保存；接種時，取保存的幼果，用70%的酒精擦試果實表面消毒；取直徑5毫米的消毒打孔器，或者消毒小刀，沿幼果腰部均勻挖孔，人為制造2~4個傷口，傷口直徑和深度都不能超過5毫米，傷口間的距離不小于2厘米；
(3)接種與培養:取輪紋病的病組織在滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養液中浸泡5~20分鐘，用消毒攝子將病組織直接塞入幼果的傷口中，每孔一塊病組織，讓病組織盡可能多地接觸果肉；將接種幼果放入鋪有濕潤濾紙的保濕缸或保濕盒內，轉入20°C ~25°C的環境中保濕培養5~7天；待大部分接種傷口發病，并形成0.2~lcm寬的環狀病斑后，取出果實，誘導產孢；
(4)誘導產孢:將發病的果實放在10W~60W，波長約為365nm黑光燈，或波長為256nm紫外燈下培養5~10天，病斑上產生黑色球狀的分生孢子器，并溢出灰白色的線狀分生孢子角；病果離燈的距離不超過20厘米，環境溫度控制在20°C ~30°C之間，相對濕度控制在60%-90% 之間；
(5)分離單孢:稱取2克瓊脂粉，加入98毫升蒸餾水，經121°C滅菌20min;在超凈工作臺上，用移液槍取5毫升融化的水瓊脂，均勻的涂布到滅菌的載玻片上，制成平板，平板厚度為0.5~1毫米；取玻璃毛細管，在酒精燈上從中間灼燒后拉細，冷卻后折斷；用燒制后的玻璃毛細管挑取分生孢子角，涂布到水瓊脂上，滴加1~2滴無菌水，將孢子涂開；在100倍顯微境下，找單個的分生孢子，用燒制的毛細管挑出，轉入PDA培養基上；自每塊病組織產生的分生孢子中，挑取3~4個分生孢子，置入同一個培養皿中，在25°C下培養3-4天，選取生長良好，性狀典型的菌落，即為純化后的蘋果輪紋病菌。
[0012]本發病的優點在于:方法簡便，分離純化病菌的效率高，獲得的菌株可靠，不需要再作致病性驗證。
[0013]應用實例，用于抗藥檢測輪紋病菌菌株的分離與純化:
(1)樣品準備:2014年8月份，自山東沂源的果園內，采集的帶有3個以上輪紋病瘤或馬鞍狀病斑的枝段20個，每個枝段長約5厘米，以枝段為單位分離輪紋病菌；病菌分離時，用小刀從每個枝段上切取3個輪紋病瘤或馬鞍狀病斑，修成約0.5厘米見方的組織塊，在滅菌的馬鈴薯葡萄糖液體培養基中浸泡5~10分鐘；
(2)幼果接種:取6月采集，且在5°C冷藏箱中保存的蘋果幼果20個，用70%的乙醇擦拭表面消毒后，用直徑0.5厘米打孔器，沿果實腰部均勻打3個深度3~5毫米的孔，把在滅菌馬鈴薯葡萄糖液體培養基中浸泡的組織塊直接塞入孔內，每個枝條上的病組織接種于同一個果實上，共接種20個果實； (3)誘導產孢:把接種幼果放入保濕缸內，在保濕缸內加入蒸餾水，將缸內相對濕度控制在100%，然后轉入25°C的恒溫箱中培養，5天后共有18個果實發病，每個果實至少有I個典型的輪紋病斑；把發病的果實轉入30W的黑光燈下誘導產孢，病果離黑光燈5厘米左右，相對濕度控制在60%~90%之間，溫度控制在20~30°C之間，培養5天后，發病果實陸續產孢，并溢出孢子角；病斑的產孢率在90%以上；
(4)單孢分離:挑取病斑上的分生孢子角，涂布在2%水瓊脂上，顯微鏡下用毛細管挑取單個孢子轉入PDA平板培養基中，從每個病果上挑取3~6個分生孢子，轉入2個培養皿中，25°C培養3~5天后，選取典型菌落，即為純化的單孢菌株；
(5)結果:從20個枝條接種的20個幼果中，共分離獲得18個純化的單孢菌株。
【主權項】
1.一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法；其特征在于:在蘋果幼齡果實的傷口內直接接種輪紋病的病組織，保濕培養，待果實發病并形成病斑后，誘導病斑產生分生孢子，挑取單個的分生孢子培養，獲得輪紋病菌的單孢菌株； 所述蘋果幼齡果實為從果園內摘取的30~80日齡的蘋果幼果，其中用50~60日齡的富士品種幼果誘導產孢效果最好；蘋果幼果可以放在3°C ~5°C的冷藏箱內長期保存； 所述傷口是對蘋果幼果進行表面消毒后，用打孔器或小刀，在果實表面均勻挖孔，人為制造傷口，傷口直徑和深度不要超過5毫米，間距不小于2厘米； 所述輪紋病的病組織是從果園內采集帶有輪紋病斑的枝條和果實，用小刀切取病斑，或病健交界處的寄主組織，病組織大小不超過5毫米； 所述接種是將輪紋病的病組織在滅菌的馬鈴薯葡萄糖培養液中浸泡5~20分鐘后，直接塞入幼果的傷口中，每個傷口一塊病組織； 所述保濕培養是把接種幼果放入保濕缸或保濕盒內，轉入20°C ~25°C的環境中保濕培養5~7天，誘導接種果實發病； 所述誘導病菌產生分生孢子是當發病幼果形成0.2~lcm寬的環狀病斑后，將病果放在10W~60W，波長約為365nm黑光燈，或波長約為256nm紫外燈下培養5~10天；病果離燈的距離不超過20厘米，環境溫度控制在20°C ~30°C之間，相對濕度控制在60%~90%之間，誘導病斑上的輪紋病菌產生分生孢子；其中黑光燈誘導果實產孢的效果更好； 所述挑取單個的分生孢子培養是用玻璃毛細管挑取分生孢子角，涂布到2%水瓊脂平板上，在100倍顯微境下，找單個的分生孢子，用燒制的毛細管或挑針挑出，轉入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上培養。2.權利要求1所述的一種分離純化蘋果輪紋病菌的簡易方法，其特征是:在蘋果幼果的傷口內直接接種輪紋病的病組織，待果實發病后，在黑光燈或紫外燈誘導病菌產孢，然后挑取單個分生孢子培養，順序操作。
【文檔編號】C12R1/645GK106032523SQ201510116069
【公開日】2016年10月19日
【申請日】2015年3月17日
【發明人】李保華, 靳丹丹, 董向麗
【申請人】李保華, 青島農業大學