位于大豆第3號染色體上的耐鹽性調控基因qNaCl3及其使用方法

位于大豆第3號染色體上的耐鹽性調控基因qNaCl3及其使用方法
【專利摘要】本發明提供大豆耐鹽性基因qNaCl3、該基因的cDNA和該基因所編碼的蛋白。該基因是調控植物的耐鹽脅迫、且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白的qNaCl3基因。
【專利說明】
位于大豆第3號染色體上的耐鹽性調控基因 qNaC 13及其使用 方法
技術領域
[0001] 本發明涉及在大豆中調控耐鹽性的基因及其使用方法。
【背景技術】
[0002] 大豆是世界上重要的豆科作物之一，作為主要的蛋白和油脂原料，其應用廣泛。但 是，大豆的產率比水稻或玉米等稻科作物低，因各種環境脅迫（ス卜レス， StreSS)的影響而 不穩定。據報道，鹽害會影響到大豆的發芽和生長以及根粒生成，導致產量減少。目前，世界 上灌溉耕地面積的約1/3受到了土壤鹽性化的影響。另外，隨著全球變暖，因水不足和不良 灌溉導致鹽類聚集地正在擴大。即使在日本，也報道了因2011年3月11日發生的東日本大地 震的影響導致海水流入而引起鹽害。作為對策，培育耐鹽性大豆品種是有效的手段，嘗試著 利用栽培種內的基因突變來改良大豆的耐鹽性。目前，有人報道了與大豆耐鹽性有關的多 個數量的基因座(QTL)，正在確定可用于大豆育種的與這些QTL有關的DNA標志物(參照非專 利文獻1~4)。但是，目前耐鹽性QTL的原因基因的鑒定或功能分析還尚未充分進行，尚未形 成可有效用于育種的狀況。
[0003] 現有技術文獻 非專利文獻 非專利文獻l:Lee, G. J?等人?，（2004) Theor. Appl. Genet. 109: 1610-1619.; 非專利文獻2:Hamwieh, A?和Xu, D. H. (2008) Breed. Sci. 58: 355-359.; 非專利文獻3:Chen, H. T?等人?，（2008) Aust. J. Agr. Res. 59: 1086-1091; 非專利文獻4:Hamwieh A等人?，（2011) Euphytica, 179: 451-459。

【發明內容】

[0004] 本發明提供大豆耐鹽性基因qNaC13、和該基因所編碼的蛋白。而且，本發明還以提 供耐鹽性植物的制作等的基因應用技術為課題。通過解決這些課題，不僅可以促進闡明大 豆耐鹽性的表達機制，還非常有助于利用所分離的基因確立新的耐鹽性品種培育等。
[0005] 本發明人發現了來自大豆的qNaC13基因是大豆耐鹽性的原因基因，還發現了通過 使qNaC13基因在鹽敏感型的大豆品種中過剩地強烈表達，大豆的耐鹽性提高，可以期待開 發耐鹽性比現有的耐鹽性大豆品種高的耐鹽品種。另外，還可以根據所分離的qNaC13基因 的DNA信息開發耐鹽性的DNA標志物，并將其用作耐鹽性大豆的育種的DNA標志物。而且，通 過利用該基因及其類似基因，不僅在大豆中還在其他豆類作物或谷類作物中制作出耐鹽性 有所提高的轉化體，可以開發與增產有關的品種。
[0006] 即，本
【發明內容】
如下。
[0007] [1]基因，該基因包含下述(a)~(f)中的任一種DNA; (a) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA; (b) 在嚴格條件下和包含與包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA互補的核苷 酸序列的DNA雜交、并且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白的DNA; (c) 包含與SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列具有90%以上的序列同源性的核苷酸序 列、并且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白的DNA; (d) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的縮聚異構體的DNA; (e) 編碼包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白的DNA;以及 (f) 作為包含對SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列有1個或多個氨基酸被取代、缺失和/或 添加了的氨基酸序列的蛋白、并且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白的DNA。
[0008] [2] [1]的基因，該基因是調控植物的耐鹽脅迫、且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白 活性的蛋白的qNaC13基因。
[0009] [3]植物轉化用載體，該載體含有[1]或[2]的基因。
[0010] [4]轉化植物，其是通過[3]的植物轉化用載體進行了轉化的耐鹽脅迫有所提高 的轉化植物。
[0011] [5] [4]的轉化植物，該轉化植物為雙子葉植物。
[0012] [6] [4]的轉化植物，該轉化植物為大豆。
[0013] [7]通過向植物中導入[1]或[2]的基因來提高該植物的耐鹽脅迫的方法。
[0014] [8] [7]的提高植物的耐鹽脅迫的方法，其中，植物為雙子葉植物。
[0015] [9] [7]的提高植物的耐鹽脅迫的方法，其中，植物為大豆。
[0016] [10]培育具有耐鹽性的植物的方法，該方法包括：以位于qNaC13基因內或其附近 的DNA標志物的存在為指標，篩選具有耐鹽性的植物。
[0017] [ 11 ] [ 10]的方法，其中，作為DNA標志物，使用作為SSR標志物的SSR25.8和/或 SSR55.5。
[0018] [12] [11]的方法，其中，使用包含SEQ ID N0: 5的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0: 6的核苷酸序列的引物的引物對來檢測SSR25.8,使用包含SEQ ID N0: 7的核苷酸 序列的引物和包含SEQ ID N0: 8的核苷酸序列的引物的引物對來檢測SSR55.5。
[0019] [13]用于檢測qNaC13基因的下述的任一種SSR標志物引物對： (i) 包含SEQ ID N0: 5的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0: 6的核苷酸序列的引 物的引物對;以及 (ii) 包含SEQ ID N0: 7的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID N0: 8的核苷酸序列的引 物的引物對。
[0020] [14]培育具有耐鹽性的植物的方法，其中，篩選不具有約3.8kb的插入片段的植 物作為具有耐鹽性的植物進行培育，所述插入片段包含qNaC13基因的外顯子3下游的SEQ ID N0: 9所示核苷酸序列。
[0021] [15]弓丨物對，該引物對用于檢測qNaC13基因的外顯子3下游的約3.8kb的插入片 段。
[0022] [16] [15]的引物對，該引物對包含:包含SEQ ID N0: 10所示核苷酸序列的引物 和包含SEQ ID N0: 11所示核苷酸序列的引物。
[0023]本說明書包含作為本申請的優先權基礎的日本國專利申請2014-027979號的說明 書和/或附圖中記載的內容。
【附圖說明】
[0024]圖1是顯示通過大豆耐鹽性的高精度QTL分析在第3號染色體上顯示QTL (數量性 狀基因座）的位置的物理地圖（圖1A)的圖。顯示大豆第3號染色體上的物理位置(Mb)。 [0025]圖2是顯示使用RT-PCR法分析耐鹽性系統NILsl8-T和敏感性系統NILsl8-S中的耐 鹽性候選基因qNaC13表達的結果的圖。
[0026] 圖3A是顯示通過RACE法由耐鹽性系統NILsl8_T合成的qNaC13基因的全長cDNA的 核苷酸序列（SEQ ID NO: 1)的圖。
[0027]圖3B是顯示由qNaC13基因編碼的蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO: 2)的圖。
[0028]圖4A-1是顯示耐鹽性系統NILsl8_T中的耐鹽性基因qNaC13的基因組核苷酸序列 (SEQ ID N0: 3)的圖（持續至圖4A-2)。
[0029]圖4A-2是顯示耐鹽性系統NILsl8_T中的耐鹽性基因qNaC13的基因組核苷酸序列 (SEQ ID N0: 3)的圖（圖4A-1的持續）。
[0030]圖4B-1是顯示敏感性系統NILS18-S中的耐鹽性基因qNaC13的基因組核苷酸序列 (SEQ ID N0: 4)的圖（持續至圖4B-2)。
[0031]圖4B-2是顯示敏感性系統NILsl8_S中的耐鹽性基因qNaC13的基因組核苷酸序列 (SEQ ID N0: 4)的圖（圖4B-1的持續）。
[0032]圖4B-3是顯示敏感性系統NILsl8_S中的耐鹽性基因qNaC13的基因組核苷酸序列 (SEQ ID N0: 4)的圖（圖4B-2的持續）。
[0033]圖5是顯示大豆耐鹽性系統NILsl8-T (圖5A)和敏感性系統NILsl8-S (圖5B)的 qNaC13基因結構的圖。
[0034]圖6是顯示來自世界各國的126個大豆品種、系統(包括野生大豆）中的大豆耐鹽性 基因 qNaC13的實時定量PCR表達量與耐鹽性的關系的圖。耐鹽性評價通過包含100mM NaCl 的水耕培養液來進行。耐鹽指數分為1 (耐鹽性弱）~5 (耐鹽性強)這5個等級。
[0035]圖7是顯示在Na/H+反向轉運蛋白缺損的酵母突變體(B31)中導入有qNaC13基因的 轉化體(qNaCl 3 1 -5株)在含有NaCl的培養基中的生長的圖。圖中，Nhal顯示酵母的Na+/H+反 向轉運蛋白基因。
[0036] 圖8是顯示導入qNaC13基因的轉化大豆系統（54-1-1、34-2-7、20-1-4、16-1_8)在 鹽脅迫處理（100mM NaCl、24小時）后的靶基因表達分析的結果的圖。圖8A顯示通過RT-PCR 進行的表達分析的結果，圖8B是通過實時PCR以相對表達水平顯示表達量的分析結果。 "Kariyutaka"顯示野生型品種，"GFP"顯示Kariyutaka的35S : GFP基因轉化大豆系統， "NILsl8-T"和"NILsl8-S"顯示大豆耐鹽性擬同質系統的耐鹽性系統和敏感性系統。
[0037] 圖9是顯示導入耐鹽性基因9恥(：13的轉化大豆系統（54-1-1、34-2-7、20-1-4、16- 1 -8)在100mM NaCl處理14天后表現出葉身的黃化程度的葉的SPAD值的圖。顯示與野生 型品種Kariyutaka存在顯著差異(P〈0.01，t_檢驗）。"Kariyutaka"顯示野生型，"GFP"顯示 Kariyutaka的35S:GFP基因轉化大豆系統，"NILsl8-T"和"NILsl8-S"顯示大豆耐鹽性擬同 質系統的耐鹽性系統和敏感性系統。
[0038]圖10是顯示表現出高耐鹽性的T2世代的35S:qNaC13轉化大豆系統20-1-4的生長 狀況的圖。圖10的右半部分顯示導入了靶基因的35S:qNaC13轉化大豆系統個體的生長，圖 10的左半部分顯示不具有靶基因的個體(無效的）的生長。
[0039] 圖11是顯示由DNA標志物篩選培育的耐鹽性基因qNaCl 3的擬同質系統中的耐鹽性 系統(NILs25-T)和敏感性系統(NILs25-S)在鹽害田地中的生育狀況(2009)的圖。圖11的右 半部分的大豆是耐鹽性系統(NILs25-T)，左半部分的大豆是敏感性系統(NILs25-S)。
[0040] 圖12是顯示由DNA標志物篩選培育的耐鹽性擬同質系統的耐鹽性系統(NILS18-T、 NILs25-T、NILs72-T)和敏感性系統（NILsl8-S、NILs25-S、NILs72-S)在鹽害田地中的地上 部分總干燥物重的比較的圖。縱向柱形圖顯示標準偏差(反復3次）。另外，"Tachiyutaka"和 "C01"是對照品種。"**"顯示與敏感性系統存在顯著差異(P〈0.01)。
【具體實施方式】
[0041] 以下，對本發明進行詳細說明。
[0042] 1.本發明的基因 本發明涉及大豆(Glycine max)的位于第3染色體上的調控耐鹽脅迫的基因qNaCl3。 qNaC13基因產物起到Na+/H+反向轉運蛋白的作用。Na+/H+反向轉運蛋白是經由生物體膜進 行Na+和H+的相向輸送的輸送體，其參與細胞內的Na+水平、pH、細胞容量等的調節，在植物中 其參與將鹽脅迫時流入細胞內的Na+向細胞外排放或者與液胞隔離。
[0043] 鹽脅迫是指植物暴露在鹽中，耐鹽脅迫是指即使在暴露于鹽中的狀態下也能生長 的能力，也稱作耐鹽性。不具有耐鹽脅迫的鹽敏感性植物通過暴露于鹽中而顯示出葉子發 黃或枯死等鹽害癥狀。
[0044] qNaC13基因可通過定位克隆(map-based cloning，基于作圖的克隆）由夾入耐鹽 性大豆品種的第3染色體的BARCS0YSSR_03_1338和BARCS0YSSR_03_1341中的約58.8kb的基 因組區進行鑒定、分離。
[0045]在具有耐鹽性的大豆系統中qNaC13基因有5個外顯子，但在失去了耐鹽性而呈鹽 敏感性的大豆系統中，通過在外顯子3的下游部分插入約3.8kb的片段而喪失基因的功能， qNaC13基因突變成由3個外顯子組成。
[0046] qNaC13基因并不是在暴露于鹽中時被誘導表達，而是經常維持表達。qNaC13基因 的表達越強，則耐鹽脅迫越強。
[0047] qNaC13基因的cDNA核苷酸序列見SEQ ID NO: 1和圖3A，qNaC13基因所編碼的蛋白 的氨基酸序列見SEQ ID N0: 2和圖3B。
[0048] 而且，qNaC13基因的基因組核苷酸序列見SEQ ID NO: 3以及圖4A-1和圖4A-2。圖 4A-2的序列是持續圖4A-1的序列。
[0049]在本發明中，上述SEQ ID NO: 1或3的核苷酸序列所表示的DNA只要具有各自的 DNA所具有的活性或各自的DNA編碼的蛋白所具有的活性、即耐鹽脅迫或Na+/H+反向轉運蛋 白活性即可，核苷酸序列中可以具有突變。例如，本發明的DNA還包含下述DNA:在嚴格條件 下和具有與SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列互補的核苷酸序列的DNA雜交的DNA;在利用 SEQ ID NO: 1 或3所不核苷酸序列和BLAST (Basic Local Alignment Search Tool at the National Center for Biological Information (美國國立生物學信息中心的基本 局部比對檢索工具））等(例如利用缺省即初期設定的參數)進行計算時具有至少85%以上、 優選90%以上、進一步優選95%以上、特別優選97%以上的序列同源性的DNA;或編碼包含對由 上述DNA編碼的蛋白的氨基酸序列有1個或多個（1~10個、優選1~5個、進一步優選1個或2 個)氨基酸被取代、缺失和/或添加了的氨基酸序列的蛋白的DNA。這里，"嚴格條件"例如是 "1 X SSC、0 ? 1%的SDS、37°C"程度的條件，更嚴格的條件是"0 ? 5 X SSC、0 ? 1%的SDS、42°C"程度 的條件，進一步嚴格的條件是"〇. 2 X SSC、0.1%的SDS、65°C"程度的條件。這樣，雜交的條件 變得越嚴格，就越能夠期待分離與探針序列具有高度同源性的DNA。但是，上述的SSC、SDS和 溫度的條件組合僅是例示，通過將DNA的濃度、DNA的長度、雜交的反應時間等適當組合，可 以實現必要的嚴格性。而且，還包含在SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列中含有基于遺傳暗 號的縮聚的序列(縮聚序列）的DNA。
[0050] 向本發明的qNaC13基因中導入突變時，可以通過Kunkel法或Gapped duplex法等 公知的方法或以其為基礎的方法，例如使用采用了位點定向誘變法(位點特異性誘變法)的 突變導入用試劑盒(例如Mutant-K (TAKARA公司制造)或Mutant-G (TAKARA公司制造)等）、 或者使用TAKARA公司的LA PCR體外誘變系列試劑盒來進行。
[0051] 根據本發明的大豆qNaC13基因的序列信息，可以在其他種類的植物中探索序列同 源性高且具有相同功能的同源基因。本發明還包含作為大豆qNaC13基因的同源基因的其他 植物種的基因。例如，上述的由核苷酸中具有突變的核苷酸序列組成的qNaC13基因中包含 與大豆qNaC13基因的核苷酸序列同源性高的其他種的同源基因。
[0052] 還包含本發明的qNaC13基因的cDNA。
[0053]另外，還包含上述基因所編碼的、具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白。
[0054] 2.導入了本發明的qNaC13基因的轉化植物的制作 通過利用基因工程學方法將本發明的qNaC13基因DNA導入植物宿主中，可以制作出具 有耐鹽脅迫的轉化植物。作為將本發明的qNaC13基因導入植物宿主中的方法，可以列舉:土 壤桿菌感染法等間接導入法;或電穿孔法、基因槍法、聚乙二醇法、脂質體法、微量注射法等 直接導入法等。本領域技術人員可以適當選擇適當的導入方法。
[0055]例如，在采用土壤桿菌感染法時，如下操作，可以制作出導入了本發明的qNaC13基 因的轉化植物。
[0056]最初，制作轉化用重組載體，然后通過土壤桿菌進行轉化。
[0057]轉化用重組載體可如下獲得：用適當的限制酶剪切包含本發明的qNaC13基因的 DNA，之后根據需要連接適當的接頭，再插入植物細胞用的克隆載體中即得。作為克隆用載 體，可以使用 口8￡21131*^48121131*^481211348110148112146厶48246厶114816等雙元 (13；[1^50載體系質粒，或口1^23如041'01'410'1200等中間載體系質粒。
[0058] 使用雙元載體系質粒時，在上述雙元載體的邊界序列(LB、RB)間插入qNaC13基因， 在大腸桿菌中擴增該重組載體。然后，通過電穿孔法等將所擴增的重組載體導入根癌土壤 桿菌t腫e/aciaoce) ￡說105、〇58、1^^4404、￡撤101、〇58(]11^;1^等中，再將 導入了 qNaC13基因的土壤桿菌用于植物的轉化即可。此外，還可以通過三者接合法 (Nucleic Acids Research, 12:8711 (1984))調制包含本發明的qNaC13基因的用于轉化 的土壤桿菌。即，將保有包含本發明的qNaC13基因的質粒的大腸桿菌或保有輔助質粒(例如 PRK2013)的大腸桿菌和土壤桿菌混合培養，之后在包含利福平和卡那霉素的培養基上進行 培養，從而可以獲得轉化用的接合體土壤桿菌。
[0059]為了使作為外來基因的本發明的qNaC13基因在植物體內表達，優選在qNaC13基因 的前后連接植物用的啟動子、增強子、終止子等。作為在本發明中可利用的啟動子，例如可 以列舉：來自花椰菜花葉病毒（CaMV)的35S啟動子、玉米的泛素啟動子、胭脂氨酸合成酶 (NOS)基因啟動子、章魚堿(OCT)合成酶基因啟動子等。作為增強子，可以使用病毒起源的翻 譯增強子或植物起源的翻譯增強子。作為病毒起源的翻譯增強子，例如可以列舉:煙草花葉 病毒、苜蓿花葉病毒RNA4、雀麥花葉病毒RNA3、馬鈴薯病毒X、煙草蝕紋病毒等的序列。另外， 作為植物起源的翻譯增強子，可以列舉:來自大豆的jS-1，3-葡聚糖酶(Glu)的序列、來自煙 草的鐵氧化還原蛋白結合性亞單位(PsaDb)的序列等。作為終止子，例如可以使用來自花椰 菜花葉病毒或來自胭脂氨酸合成酶基因的終止子等。但是，啟動子、增強子、終止子并不限 于上述的這些，只要是已知在植物體內起作用的啟動子、增強子、終止子均可使用。連接這 些啟動子、增強子、終止子，使得想要表達的本發明的qNaC13基因能夠起作用。
[0060] 而且，為了有效選擇目標轉化植物，優選使用選擇標志物基因。作為選擇標志物， 可以列舉卡那霉素耐性基因（NPTII )、對植物賦予抗生素潮霉素抗性的潮霉素磷酸轉移酶 (htp)基因和賦予雙丙氨磷(bialaphos)抗性的草銨膦乙酰轉移酶(bar)基因等。本發明的 基因和選擇標志物基因可以一起插入單一載體中，也可以使用將這兩種基因分別插入單個 的載體中而獲得的兩種重組DNA。
[0061] 導入本發明的qNaC13基因的宿主植物可以是植物培養細胞、栽培植物的植物體整 體、植物器官(例如葉、花瓣、莖、根、根莖、種子等）、或植物組織(例如表皮、韌皮部、薄壁組 織、木質部、維管束等)的任一種。
[0062] 對植物種沒有限定，可以列舉不具有耐鹽脅迫的鹽敏感性大豆、大豆以外的豆類 植物或谷類植物。對大豆以外的豆類植物沒有限定，可以列舉:赤豆、菜豆、鷹嘴豆、花生、豌 豆、蠶豆等。對谷類植物沒有限定，可以列舉:水稻、玉米、小麥、大麥、黑麥、燕麥、薏苡、野燕 麥、蕎麥、稗子、小米、黃米等。另外，雙子葉植物、單子葉植物均可使用。通過向鹽敏感性的 大豆中導入qNaC13基因使其過度表達，使鹽敏感性大豆對鹽脅迫具有耐性，可以開發耐鹽 性比現有的耐鹽性大豆品種強的品種。另外，通過向大豆以外的豆類植物或谷類植物中導 入大豆的qNaC13基因或作為大豆qNaC13基因的同源基因的其他種植物的qNaC13基因，可獲 得耐鹽脅迫有所提高的轉化體。
[0063]當以植物培養細胞、植物體、植物器官或植物組織作為宿主時，通過土壤桿菌感染 法、基因槍法或聚乙二醇法等將載體導入所采集的植物切片中，本發明的基因可以轉化植 物宿主。或者，還可以通過電穿孔法導入原生質體中制作出轉化植物。
[0064]向植物細胞中導入qNaC13基因時，可以通過公知的組織培養法由所得的轉化細胞 再生轉化體。例如，可以依照"植物細胞培養^二二(植物細胞培養手冊)"山田康之編 著，講談社1984等文獻，由植物細胞再生植物體。
[0065]關于在導入了本發明的qNaC13基因的轉化植物及其下一代中插入有qNaC13基因， 可如下進行確認:按照常規方法從這些細胞和組織中提取DNA，采用公知的PCR法或DNA印跡 分析檢測所導入的qNaC13基因，由此即可確認。
[0066]本發明的轉化植物體除了包含進行轉化而再分化了的當代即"T1世代"以外，還包 含由該植物的自體繁殖或異體繁殖的種子獲得的后代等、以T1世代為起點的所有通過栽培 或育種的方法能夠獲得的世代或個體。
[0067] 3.轉化植物對鹽脅迫的耐性評價 關于導入了本發明的qNaC13基因的轉化植物對鹽脅迫的耐性，例如可以如下進行評 價:將轉化植物種在裝有水耕培養液或包含蛭石、珍珠巖等的培養土的容器中，研究在施加 鹽脅迫使其生長時的存活或生長狀況，由此進行評價。例如，可以使用包含100~200mM、優 選100~150mM NaCl的水耕培養液，在20~35°C下每隔1小時~30天、優選10~20天、進一步 優選14天進行鹽處理，之后研究存活率或生長狀況，由此進行評價。此時，可以研究耐鹽指 數(STR)或葉綠素含量(SPAD值）。耐鹽指數可以通過目視觀察植物體來進行，分為5個等級 (1~5)。另外，葉綠素含量(SPAD值)可以通過SPAD值計測器來測定。葉綠素含量是顯示葉子 的黃化程度的值。另外，當為大豆等豆類植物或谷類植物等形成谷粒(子実）的植物時，使植 物生長形成谷粒，根據谷粒的形成情況進行評價。
[0068]導入了本發明的qNaC13基因的植物的耐鹽脅迫有所提高。
[0069] 即，例如使用包含100~150mM NaCl的水耕培養液，將導入了本發明的qNaC13基因 的植物和不具有耐鹽脅迫的鹽敏感性系統在20~35°C下培養2~3周時，相對于鹽敏感性系 統而言，導入了本發明的qNaC13基因的植物存活率提高，耐鹽指數提高，可以維持葉的葉綠 素含量。而且，相對于鹽敏感性系統而言，導入了本發明的qNaC13基因的植物，谷粒的形成 變好，田地的每單位面積的產量提高。
[0070] 4.耐鹽性植物篩選和用于篩選的標志物 本發明還包含：用于篩選耐鹽性植物的標志物、和使用了該標志物的耐鹽性植物的篩 選或育種方法。
[0071] 在對選自至少包含大豆的植物組的植物進行的耐鹽性檢測、具有與參與耐鹽性的 Na+/H+反向轉運蛋白基因（qNaC13基因）類似的功能的新基因的探索、大豆育種上的DNA標志 物的篩選等中可以使用這些標志物。
[0072]具有本發明的qNaC13基因且具有耐鹽性的植物可以通過將具有qNaC13基因的植 物和其他植物雜交、再篩選具有qNaC13基因的雜種來進行育種。作為具體的篩選育種方法， 例如可以列舉下述方法:使任意的植物系統X與具有qNaC13基因的植物系統Y雜交得到雜 種，將所得的雜種和植物系統X回交，篩選具有qNaC13基因的雜種，再進行回交。優選回交和 篩選反復進行數次、優選2~10次。通過這種方法，可以獲得具有qNaC13基因的擬同質基因 系統。此時，具有qNaCl 3基因的植物系統可以利用標志物進行篩選。
[0073]用于耐鹽性植物的篩選或育種的標志物是包含作為本發明qNaC13基因存在位置 的標記的DNA序列的DNA標志物，只要使用存在于qNaC13基因內、或者與qNaC13基因相鄰、或 者存在于其附近的DNA標志物即可。例如，可以使用微衛星標志物作為這樣的DNA標志物，作 為微衛星標志物，可以列舉SSR (單純反復序列)標志物等。以這些標志物的存在為指標進 行篩選的植物個體具有qNaC13基因，具有耐鹽性這種性狀。作為位于qNaC13基因附近的DNA 標志物，例如可以列舉:作為大豆第3染色體上的SSR標志物的Satt339、Satt237、Satt255、 Sat_091 和Sat_304 (公知大豆標志物、參照Song等人?（2004) Theor. Appl. Genet., 109: 122-128)等。這些標志物例如可以使用標志物特異性引物對來進行檢測。
[0074]另外，qNaCl 3基因存在于夾入 BARCS0YSSR_03_1338 和BARCS0YSSR_03_1341 中的約 58.8kb的基因組區（圖 1)。因此，BARCS0YSSR_03_1338和BARCS0YSSR_03_1341也可用作耐鹽 性基因的篩選標志物。
[0075] 另外，還可以利用新開發的SSR標志物SSR25.8和SSR55.5，只要使用以下的SSR標 志物引物組（引物對)即可。
[0076] (1)在qNaC13基因的上游5.2kb處開發的微衛星（單純反復序列、SSR)標志物 (SSR25.8)的引物組：5'-TTAAGCACCAGCAAATAGTTC-3'（SEQ ID N0: 5)和5'_ CGACCAACTATTCCCATATAC-3' （SEQ ID NO: 6); (2)在qNaC13基因的下游13kb處開發的微衛星(單純反復序列、SSR)標志物(SSR55.5) 的引 物組：5 '-TTGGATAGTAATGTTGTCTTCG-3 ' ( SEQ ID NO: 7)和5'- AAGAAAAGTGATGTGACTTGA-3， (SEQ ID NO: 8)〇
[0077]使用上述引物組，對根據大豆的耐鹽性和敏感性提取的DNA進行PCR使其擴增，確 認明確的多態性。通過檢測這2個或1個SSR標志物，可以識別是否存在標志物耐鹽性基因 qNaC13基因。
[0078]通過篩選DNA標志物來進行的耐鹽性大豆系統的育種例如可以按照Hamwieh等人. (2011) Euphytica, 179: 451-459的記載來進行。
[0079]而且，在鹽敏感性系統中，qNaC13基因在外顯子3的下游具有約3.8kb的插入片段， 失去了基因的功能（圖5)。約3.8kb的插入片段的核苷酸序列見SEQ ID N0: 9。因此，以是否 存在該插入片段為指標，可以檢測大豆系統是否具有耐鹽性，以不具有該插入片段為指標， 可以篩選培育具有qNaC13基因的耐鹽性大豆。是否存在插入片段可以使用作為插入片段的 一部分片段的寡核苷酸或其互補序列、或者包含在嚴格條件下能夠與這些序列雜交的序列 的寡核苷酸來檢測。這里，嚴格條件如上所述。
[0080] 該寡核苷酸是探針或引物，可以根據SEQ ID N0: 9的約3.8kb的插入序列的序列 信息來設計。具體而言，根據上述插入片段兩側的核苷酸序列設計引物，根據PCR產物的長 度檢測是否存在3.8kb的插入片段。
[0081]探針包含qNaC13基因的插入片段的核苷酸序列或與該核苷酸序列互補的核苷酸 序列、或者包含由在嚴格條件下能夠與這些序列雜交的序列構成的核苷酸片段(優選DNA片 段），核苷酸數為5~50、優選10~30、進一步優選為10~25。通過使用該探針與由作為被檢 體的植物獲得的核酸樣品雜交，可以檢測是否存在插入片段。
[0082] 引物是可以檢測存在qNaC13基因的插入片段的引物，例如是可以擴增具有包含一 部分qNaC13基因的序列的區的序列。引物是正向引物和反向引物的引物對。引物包含 qNaC13基因的插入片段的核苷酸序列或與該核苷酸序列互補的核苷酸序列、或者由在嚴格 條件下能夠與這些序列雜交的序列構成的核苷酸片段(優選DNA片段），核苷酸數為5~50、 優選10~30、進一步優選為15~25。使用引物通過PCR可以檢測是否存在插入片段。
[0083] 作為這樣的引物，例如有5'-CTCGCAAGTGTTCTCACGAA-3'（SEQ ID N0: 10)和5'-TTAGCTCCACCAACCCTTTG-3'（SEQ ID NO: 11)的引物組。
[0084] 本發明包含用于檢測qNaC13基因的插入片段的探針和引物(優選至少一對引物 組）。另外，還包含固定有探針的DNA芯片。而且，還包含用于檢測qNaC13基因的插入片段的 包含探針、DNA芯片、引物等的試劑盒。
[0085] 通過以下的實施例來具體地說明本發明，但本發明并不受這些實施例的限定。 [0086] 實施例1通過定位克隆(map-based cloning，基于作圖的克隆）鑒定位于大豆第 3號染色體上的調控耐鹽脅迫的基因qNaC13 圖1是通過大豆耐鹽性的高精度數量基因座(QTL)分析在第3號染色體上顯示QTL的位 置的物理地圖。大豆耐鹽性的QTL存在于圖1的58.8kb的QTL區，通過定位克隆從該58.8kb的 區域中選定與大豆耐鹽性有關的候選基因。
[0087] 迄今為止，對將大豆品種FT-Abayara (耐鹽性)和C01 (敏感性)交配而得到的F7 分離集團（ri=97)進行數量性狀基因座(QTL)分析，明確了在大豆第3染色體上耐鹽性QTL位 于SSR標志物Satt255和Sat_091 的附近（Hamwieh等人?（2011) Euphytica, 179: 451-459)。然后，使用大規模的分離集團，通過定位克隆進行了耐鹽性QTL區的詳細連鎖分析。具 體而言，在耐鹽性QTL位于第3染色體的區上SSR標志物Satt255和Sat_091顯示出異源性的 Fs世代的個體自體繁殖，從1，053個體的分離集團中篩選了 SSR標志物Satt255與Sat_091間 的染色體重組個體。其結果，得到了在Satt255與Sat_091之間產生的14個體的重組個體。使 這些重組個體再一次自體繁殖，獲得了 14個重組固定系統。然后，利用Satt255和Sat_091間 的15個新的SSR標志物，將所得的14重組固定系統整列化，根據各系統的耐鹽性評價結果， 明確了耐鹽性 QTL 存在于夾入 BARCS0YSSR_03_1338 和 BARCS0YSSR_03_1341 中的約58.8kb的 基因組區（圖1)。對該候選基因組區的核苷酸序列進行基因預測以及類似性研究時，明確了 在該區存在7個推測基因（Nature (2010) 463: 178-183)。特別是，在推測基因 Glyma03g32890和Glyma03g32900中發現了具有與鈉/氫交換蛋白家族類似的結構的區，認 為是耐鹽性QTL的原因基因。接著，進行基因表達的分析，其結果，Glyma03g32900在大豆耐 鹽性系統和敏感性系統間顯示出明確的差別，選定該基因作為大豆耐鹽性的候選基因，命 名為 qNaC13。
[0088] 實施例2 qNaC13基因的分析 關于大豆耐鹽性系統NILsl8-T和敏感性系統NILsl8-S，提取總RNA，通過RT-PCR進行耐 鹽性候選基因qNaC13基因的表達分析。
[0089] 大豆耐鹽性系統NILsl8-T和敏感性系統NILsl8-S分別是通過DNA標志物篩選培育 的（Hamwieh等人?（2011) Euphytica, 179: 451-459) dNILsIS-T和NILsl8-S在晝溫25±2 °C、夜溫20±2°C、日長14小時的條件下通過水耕法（1/2濃度Hoagland和Arnon營養液、pH= 6.0-6.5)進行了栽培。關于鹽處理，從大豆的第一片葉展開期(VI期)起用100mM NaCl進行 了鹽處理。關于提取總RNA，利用經100mM NaCl進行了 1天和3天的鹽處理的大豆和對照(OmM NaCl)的大豆，使用Trizol (Invitrogen公司）從大豆根部進行了提取。
[0090] RT-PCR (逆轉錄-PCR)使用PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒（TAKARA BIO INC)來進 行。使用的引物是5'-CCACCAACATGTCACGACTC-3' （SEQ ID N0: 12)和5'- ACCCCACGATTGACTAGCAC-3'（SEQ ID NO: 13)。以作為持家基因的肌動蛋白基因作為對照， 使用的引 物是 5 '-GAGCTATGAATTGCCTGATGG-3 ' ( SEQ ID NO: 14)和5'- CGTTTCATGAATTCCAGTAGC-3'（SEQ ID NO: 15) JCR程序（PTC-100? programmable Thermal controller MJ-Research Inc)是在95°C/30秒、56°C/30秒、72°C/30秒下反應25 個循環后通過72°C/7分鐘的伸長反應來進行的。反應結束后，通過1.5%的瓊脂糖凝膠電泳 確認了擴增片段。
[0091] 結果見圖2。圖2的上半部分的畫面顯示qNaC13基因的表達，下半部分的畫面顯示 作為持家基因的肌動蛋白基因的表達。如圖2所示，在耐鹽性系統中，與敏感性系統相比， qNaC13基因顯示出高度表達的趨勢。另外，關于耐性系統中的qNaC13基因的表達量，在 100mM NaCl鹽處理和對照（100mM NaCl)之間沒有確認到明確的差異，暗示了耐性系統的 qNaC13基因不是鹽脅迫的誘導性基因，而經常維持高度表達。
[0092]利用RACE (cDNA末端快速擴增)法從作為耐鹽性系統的NILsl8-T系統中分離鑒定 qNaC13基因，確定了cDNA的核苷酸序列和qNaC13基因所編碼的蛋白的氨基酸序。3' Full RACE使用3'-Full RACE Core Set (TAKARA BIO INC)來進行，5' Full RACE-PCR使用5'-Full RACE Core Set (TAKARA BIO INC)來進行。cDNA序列見圖3A和圖3B以及SEQ ID NO: 1和2。核苷酸序列的長度為2670bp (SEQ ID NO: 1)，氨基酸序列的長度為811個氨基酸 (SEQ ID NO: 2)〇
[0093]另外，確定了耐鹽性系統NILsl8_T和敏感性系統中的qNaC13基因區的基因組核苷 酸序列。圖4A和圖4B中顯示的是各自的核苷酸序列（SEQ ID N0: 3和SEQ ID N0: 4)。需要 說明的是，圖4A-1和圖4A-2以及圖4B-1~圖4B-3的序列分別是一系列的連續序列，圖4A-2 的序列是圖4A-1的序列的持續，而圖4B-3的序列是圖4B-2的序列的持續、圖4B-2的序列是 圖4B-1的序列的持續。
[0094]根據上述的核苷酸序列信息分析了qNaC13基因的結構。圖5顯示了耐鹽性系統 NILsl8_T和敏感性系統中的qNaC13基因的結構圖。如圖5所示，耐鹽性系統NILsl8_T中的 qNaC13基因有5個外顯子，相對于此，在敏感性系統NILsl8_S中保有3個外顯子。明確了其原 因在于:在敏感性系統NILsl8-S中通過在外顯子3的下游部分插入約3.8kb的片段而產生了 聚腺苷酸化現象，失去了基因的功能。
[0095]實施例3 126個大豆品種、系統中的大豆耐鹽性基因qNaC13基因的表達分析 獲取了來自世界各國的包括野生品種在內的126個大豆品種、系統。126個大豆品種、系 統從美國USDA National Plant Germplasm System (http://www.ars-grin.gov/npgs/)、 日本的農業生物資源GeneBank (http: //www. gene ? affrc ? go ? jp/index_j ? php)和國立生 物資源項目（National Bio Resource Project) (http:// www.legumebase.brc.miyazaki_u.ac. jp/)獲取。
[0096]對這126個品種、系統的大豆進行了耐鹽性評價和qNaC13的表達量測定。
[0097] 供試的126個大豆品種、系統在晝溫25 ± 2°C、夜溫20 ± 2°C、日長14小時的條件下 通過水耕法（1/2濃度Hoagland和Arnon營養液、pH = 6.0-6.5)進行了栽培。關于鹽處理，從 大豆的第一片葉展開期（VI期）起使用100mM NaCl進行了鹽處理。關于提取總RNA，利用經 100mM NaCl進行了 1天的鹽處理的大豆，使用Trizol (Invitrogen公司）從大豆的根部進行 提取，進行大豆耐性基因qNaC13基因的實時定量PCR，測定了表達量。在鹽處理約3周后，研 究了各系統的耐鹽指數和葉綠素含量（SPAD值）。通過目視將耐鹽指數(STR)分為5個等級 (1-5)。耐鹽指數1表示耐鹽性最弱，耐鹽指數5表示耐鹽性最強。葉綠素含量通過以SPAD值 的形式表示的計測器SPAD-502 (Konica Minolta社)來測定。
[0098]耐鹽性評價的結果，供試的126個大豆品種、系統的耐鹽性顯示出大的變異。圖6顯 示了 126個品種、系統中的qNaC13通過實時定量PCR測定的表達量與耐鹽指數(STR)的關系。 qNaC 13的實時定量PCR表達量以qNaC13基因與肌動蛋白基因的表達量之比表示。
[0099]如圖6所示，大豆的qNaCl3的表達量越大，耐鹽指數越高，明確了qNaCl3基因的表 達量調控大豆的耐鹽性。
[0100]實施例4導入了qNaC13基因的酵母轉化體的制作和評價 向缺損了Na+/H+反向轉運蛋白基因的酵母突變體(B31)中導入qNaCl3基因，制作了轉 化體(qNaC13 1-5株）。
[0101] 用含有0~l，〇〇〇mM NaCl、10mM KC1的pH3.5的培養基培養了該轉化體。另外，用含 有500mM NaCl、10mM KC1的pH3.5~6.5的培養基培養了該轉化體。另外，使用經不含qNaC13 的載體轉化了的酵母突變體作為對照。而且，還對經作為酵母的Na+/H+反向轉運蛋白基因的 Nha 1基因轉化了的轉化體進行了培養。
[0102] 結果見圖7。圖7A顯示因NaCl濃度引起的生長差異，圖7B顯示因pH引起的生長差 異。qNaC13的1~5顯示5個系統的轉化體各自的結果。Vector顯示用載體轉化了的對照的結 果，Nhal顯示經作為酵母的Na+/H+反向轉運蛋白基因的Nhal基因轉化了的轉化體的結果。圖 7是根據培養皿上的生長狀況顯示各培養的結果。圖中，看起來白的部分顯示已生長的酵母 集落的集合，白的部分越大，表示生長越好。
[0103] 如圖7所示，即使培養基的NaCl濃度為750mM，qNaC13基因轉化體也可以生長。關于 其生長情況，在培養基的pH低時與對照(Vector)的差別明顯，但在接近中性時沒有確認到 差別。其結果顯示:qNaC13基因起到Na+/H+反向轉運蛋白的作用。
[0104] 在實施例4中，轉化體按照http: //genetic ? eng? yamaguchi-u.ac ? jp/KoboHome/ KoboKobo.html和Kitagawa, T., Hoshida, H. and Akada, R. : Infect. Immun., 75 (3)，1393 (2007).中記載的方法進行。
[0105] 具體而言，按照下述步驟進行。
[0106] 1 ?制作一步緩沖液(One-Step Buffer)。
[0107] 60%PEG 667 //L 4M LiAc 50#L 1M DTT 100//L D.ff. 183//L 2.在1.5mL的微型管中分別注入50 的一步緩沖液。
[0108] 3.取20#L左右的在YH)板培養基中進行了o/n培養的酵母B31系統加入到微型管 的緩沖液中，充分混合，之后通過離心除去上清，分別加入50 -步緩沖液、5 載體RNA、 5 質粒DNA (pYES2、qNaC13-pYES2、Nhal-pYES2等）充分混合。
[0109] 4.在42°C下培養1.5小時。
[0110] 5.加入100//L的D.W.進行混合，接種在SD板培養基(-URA的選擇培養基)上。
[0111] 6.通過30°C、2-3天的培養出現轉化集落。
[0112] 另外，轉化體的培養通過以下的方法來進行。
[0113] 稀釋用SD (-URA)液體培養基進行了o/n培養的轉化酵母使0D 600達到1.0,在各 種鹽濃度、或pH條件的SD (-URA)板培養基中分別滴加2.5 # L，在30°C下培養，1周后拍攝照 片。
[0114] 實施例5導入qNaC13基因的轉化大豆的鹽脅迫處理 1.對qNaC13基因表達的影響 制作了導入qNaC13基因的轉化大豆T2世代4個系統(54-1-1、34-2-7、20-1-4、16-1-8)。
[0115] 利用下述方法制作了導入qNaC13基因的轉化大豆T2世代系統。
[0116] 使用國內大豆品種"力!；二夕力"作為轉化體材料。即使在大豆品種中該品種的培 養品種也特別優異(Plant Biotechnology 24: 533-536)，因此將其用于供試材料。另外， 關于轉化的方法，使用現有(Plant Biotechnology 27: 217-220)的方法進行轉化。首先， 將種子在保濕了 1周左右的密閉容器中調濕(提高吸水含量）。將該種子浸泡一夜，使其吸 水。之后，除去種皮，用刀剪斷，準備了外植片。特別是，在可以誘導不定芽的胚軸基部，使用 刀制造小的傷口，促進土壤桿菌的感染。作為基因表達載體，構建了將耐鹽性基因qNaC13與 35S啟動子(花椰菜花葉病毒35S啟動子)連接、還包含bar (草銨膦耐性)基因作為篩選標志 物的表達質粒載體。將該載體導入土壤桿菌EHA105株中。用土壤桿菌EHA105株感染外植片， 所述土壤桿菌EHA105株保有使qNaC13基因恒定地過剩表達的雙元載體。在5天的共存培養 后，清洗土壤桿菌，用含有6mg/L草銨膦的黃麻誘導培養基培養了 2周X 2次。之后，用含有相 同濃度的草銨膦的黃麻伸長培養基培養2周X4次，在此期間將充分伸長了的黃麻移植到生 根培養基中。生根后，移植到培養土中，培育約3個月后收獲了種子。播種這些種子，在幼植 物體的葉上涂抹稀釋至1，〇〇〇倍的除草劑"パス夕，BASTA"，篩選了保有導入基因的個體。使 用所篩選的個體及其后代作為各分析對象的材料。
[0117] 對所得的導入qNaC13基因的轉化大豆系統(54-1-1、34-2-7、20-1_4、16-1-8)進行 鹽脅迫處理（l〇〇mM NaCl、24小時），之后從大豆的根中提取總RNA，通過RT-PCR進行qNaC13 基因的表達分析，再通過實時PCR分析了qNaC13基因的表達量。此時，對于作為野生型品種 的Kariyutaka、經Kariyutaka的35S:GFP基因轉化的大豆系統、以及大豆耐鹽性擬同質系統 的耐性系統即NI Ls 18-T和敏感性系統即NI Ls 18-S也進行了分析，作為對照。
[0118] 結果見圖8。圖8中，"Kariyutaka"表示野生型品種，"GFP"表示Kariyutaka的35S: GFP基因轉化大豆系統，"NILsl8-T"和"NILsl8-S"表示大豆耐鹽性擬同質系統的耐性系統 和敏感性系統。圖8A顯示RT-PCR的表達分析結果，圖8B是通過實時PCR以相對表達水平顯示 表達量的分析結果。如圖8A所示，在導入qNaC13基因的轉化大豆系統和作為耐性系統的 NILs 18-T系統中，確認到了qNaCl3基因的表達。另外，如圖8B所示，實時PCR的分析結果，轉 化20-1-4系統的平均表達量為耐性系統NILsl8-T的4.72倍。
[0119] 該結果表明：通過使用以使目標基因過剩表達的方式構建的該載體，與直接使用 以自然變異的方式存在的遺傳資源相比，可以有意地使目標基因更強地表達。而且，通過加 強基因的表達，可以期待進一步增強對鹽脅迫的耐性。
[0120] 2.對轉化大豆系統的耐鹽性的影響 關于轉化大豆系統，利用與實施例3相同的方法評價耐鹽性，還測定了 SPAD。
[0121] 圖9顯示：導入耐鹽基因 qNaC13的轉化大豆系統(54-1-1、34-2-7、20-1-4、16-1_8) 在100mM NaCl處理14天后表現出葉身的黃化程度的葉的SPAD值。圖中，#顯示與野生型品 種Kariyutaka存在顯著差異（P〈0.01，t_檢驗）。另外，"Kariyutaka"顯示野生型品種， "GFP"顯示Kariyutaka的35S (花椰菜花葉病毒35S啟動子）：GFP基因轉化大豆系統， "NI Ls 18-T"和"NI Ls 18-S"顯示大豆耐鹽性擬同質系統的耐性系統和敏感性系統。
[0122] 圖10顯示14天后的生長狀態。圖10的右半部分顯示導入了靶基因的q35S:qNaC13 轉化大豆系統個體的生長，圖10的左半部分顯示不具有靶基因的個體(無效的）的生長。如 圖10所示，在導入了靶基因的q35S:qNaC13轉化大豆系統個體中確認到了良好的生長。
[0123] 實施例6耐鹽性基因qNaC13的擬同質系統在鹽害田地(圃場)中的栽培 對于迄今為止本發明人培育的大豆耐鹽性基因擬同質基因系統（Near isogenic 1 ines，NILs)，通過含有NaCl的培養液的水耕法進行苗期的耐鹽性評價，確認了耐性基因 效果(Hamwieh等人?（2011) Euphytica, 179: 451-459)。但是，關于這些系統在其他生長 期(開花期、成熟期）的耐鹽性尚不明確，另外，關于在實際的鹽脅迫田地條件下對產量的影 響也不明確。本研究中，在2009-2010年這兩年間在鹽脅迫田地栽培了 3組大豆的耐鹽性擬 同質基因系統011^18、見1^25、見1^72)，研究了耐鹽性基因的效果。
[0124] 評價了 3組大豆耐鹽性擬同質基因系統的各自的耐鹽性系統和敏感性系統共計6 個系統01118^1118-1'川1125-5川1125-1'川1172-5川1172-1')和鹽敏感性對照品種 (Tachiyutaka)。田地試驗區的設計按照隨機區組設計法反復進行了3次。栽培密度是株間 為0.2m、行距為0.8!11。2009年6月1日進行了播種。鹽處理則是在7月7日通過鹽水灌溉進行了 鹽脅迫。灌溉鹽水的濃度為海水濃度的約1/4 (120mM NaCl)。2010年6月4日進行播種，7月 27日進行了鹽處理。收割后，對于每10個系統研究了地上部分干燥物和粒重等性狀。
[0125] 通過鹽水處理，所有的鹽敏感性系統均顯示出葉子發黃和枯死等嚴重的鹽害癥 狀。在評價的3組耐鹽性擬同質基因系統中，具有耐鹽性對立基因的系統(NIL18-T、NIL25-T、NIL72-T)的地上部分干燥物重和谷粒重均顯示出高于不具有耐鹽性對立基因的系統 (NIL18-S、NIL25-S、NIL72-S)的值。耐鹽性系統的谷粒重以兩年平均值計為敏感性系統的 谷粒重的4.2倍，在鹽害田地中可以確認到耐鹽性基因的效果。
[0126] 圖11顯示通過DNA標志物篩選培育的耐鹽性基因qNaCl 3的擬同質系統中的耐性系 統(NILs25-T)和敏感性系統(NIL25-S)在鹽害田地中的生長狀況。
[0127] 圖12顯示通過DNA標志物篩選培育的耐鹽性擬同質系統中的耐鹽性系統011^18_ T、NILs25-T、NILs72-T)和敏感系統(NILsl8-S、NILs25-S、NILs72-S)在鹽害田地中的谷粒 重的比較結果。結果顯示了在不同年份進行了 2次試驗的結果(分別見圖12A和圖12B)。縱向 柱形圖顯示標準偏差（反復3次），**顯示與敏感性系統存在顯著差異（P〈0.01)。 Tachiyutaka和C01是對照品種。
[0128] 實施例7利用標志物制作耐鹽性大豆系統 1. SSR標志物的利用 為了檢測qNaC13基因，制作了下述SSR標志物的引物組。
[0129] (1)在qNaC13基因的上游5.2kb處開發的微衛星（單純反復序列、SSR)標志物 (SSR25.8)的引物組：5'-TTAAGCACCAGCAAATAGTTC-3'（SEQ ID N0: 5)和5'_ CGACCAACTATTCCCATATAC-3' （SEQ ID NO: 6) (2)在qNaC13基因的下游13kb處開發的微衛星(單純反復序列、SSR)標志物(SSR55.5) 的引 物組：5 '-TTGGATAGTAATGTTGTCTTCG-3 ' ( SEQ ID NO: 7)和5'- AAGAAAAGTGATGTGACTTGA-3， (SEQ ID NO: 8)〇
[0130] 使用這2個SSR標志物，通過對根據大豆的耐鹽性和敏感性提取的DNA進行PCR而使 其擴增，確認了明確的多態性。通過使用上述引物組檢測這兩個SSR標志物中的1個或2個， 可以識別是否存在標志物耐鹽性基因qNaCl 3基因。
[0131] 2.檢測約3.8kb的插入片段的標志物的利用 根據本發明中獲得的耐鹽性和敏感性系統的qNaC13基因的核苷酸序列，在鹽敏感性系 統中，qNaC13基因在外顯子3的下游具有約3.8kb的插入片段，喪失了基因的功能（圖5)。為 了檢測是否存在該突變，設計引物組5'-CTCGCAAGTGTTCTCACGAA-3'（SEQ ID N0: 10)和 5'-ITAGCTCCACCAACCCTTTG-3'（SEQ ID NO: 11)，進行了是否存在3.81cb的插入片段的檢 測。使用該引物在3組耐鹽性擬同質系統以及親本品種FT-Abayara (耐鹽性品種）和CO 1 (敏感性品種）中進行驗證時，所有的耐鹽性系統均不具有該約3.8kb的插入片段。相對于 此，顯示出所有的敏感性系統均具有該插入片段。因此，利用這次分離的qNaC13基因的核苷 酸序列信息，可以制作出大豆耐鹽性的篩選標志物。引物組5 ' -CTCGCAAGTGTTCTCACGAA-3 ' (SEQ ID NO: 10)和5'-TTAGCTCCACCAACCCTTTG-3'（SEQ ID NO: 11)是用于識別是否存在 qNaC13基因的標志物之一例，通過使用標志物，可以制作出強耐鹽性大豆系統。
[0132] 產業實用性 本發明的來自大豆的qNaC13基因調控植物的耐鹽脅迫(耐鹽性）。通過向不具有耐鹽脅 迫的大豆品種中導入qNaC13基因，可獲得耐鹽脅迫有所提高的大豆品種，即使在鹽濃度高 的環境下也可以獲得高產量的大豆。另外，通過向大豆以外的植物中導入qNaC13基因，可獲 得耐鹽脅迫有所提高的植物。而且，根據qNaC13基因的DNA信息開發與耐鹽脅迫有關的DNA 標志物，通過DNA標志物的篩選育種，可以培育耐鹽脅迫有所提高的大豆。
[0133] 序列表自由文本 SEQ ID N0: 5~8、10~15 引物 本說明書中引用的所有出版物、專利和專利申請均直接作為參考而納入本說明書中。
【主權項】
1. 基因，該基因包含下述(a)~(f)中的任一種DNA: (a) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA; (b) 在嚴格條件下和包含與包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的DNA互補的核苷 酸序列的DNA雜交、并且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白的DNA; (c) 包含與SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列具有90%以上的序列同源性的核苷酸序 列、并且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白的DNA; (d) 包含SEQ ID NO: 1或3所示核苷酸序列的縮聚異構體的DNA; (e) 編碼包含SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列的蛋白的DNA;以及 (f) 作為包含對SEQ ID NO: 2所示氨基酸序列有1個或多個氨基酸被取代、缺失和/或 添加了的氨基酸序列的蛋白、并且編碼具有Na+/H+反向轉運蛋白活性的蛋白的DNA。2. 權利要求1所述的基因，該基因是調控植物的耐鹽脅迫、且編碼具有Na+/H+反向轉運 蛋白活性的蛋白的qNaCl 3基因。3. 植物轉化用載體，該載體含有權利要求1或2所述的基因。4. 轉化植物，其是通過權利要求3所述的植物轉化用載體進行了轉化的耐鹽脅迫有所 提高的轉化植物。5. 權利要求4所述的轉化植物，該轉化植物為雙子葉植物。6. 權利要求4所述的轉化植物，該轉化植物為大豆。7. 通過向植物中導入權利要求1或2所述的基因來提高該植物的耐鹽脅迫的方法。8. 權利要求7所述的提高植物的耐鹽脅迫的方法，其中，植物為雙子葉植物。9. 權利要求7所述的提高植物的耐鹽脅迫的方法，其中，植物為大豆。10. 培育具有耐鹽性的植物的方法，該方法包括：以位于qNaC13基因內或其附近的DNA 標志物的存在為指標，篩選具有耐鹽性的植物。11. 權利要求10所述的方法，其中，作為DNA標志物，使用作為SSR標志物的SSR25.8和/ 或SSR55.5。12. 權利要求11所述的方法，其中，使用包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的引物和包 含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列的引物的引物對來檢測SSR25.8,使用包含SEQ ID NO: 7的 核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引物的引物對來檢測SSR55.5。13. 用于檢測qNaC13基因的下述的任一種SSR標志物引物對： (i) 包含SEQ ID NO: 5的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 6的核苷酸序列的引 物的引物對;以及 (ii) 包含SEQ ID NO: 7的核苷酸序列的引物和包含SEQ ID NO: 8的核苷酸序列的引 物的引物對。14. 培育具有耐鹽性的植物的方法，其中，篩選不具有約3.8kb的插入片段的植物作為 具有耐鹽性的植物進行培育，所述插入片段包含qNaC13基因的外顯子3下游的SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列。15. 引物對，該引物對用于檢測qNaC13基因的外顯子3下游的約3.8kb的插入片段。16. 權利要求15所述的引物對，該引物對包含:包含SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列的 引物和包含SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列的引物。
【文檔編號】A01H5/00GK106029883SQ201580009062
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年2月16日
【發明人】許東河, D.D.阮, 陳華濤, 莊野真理子, 山田哲也, 佐藤雅志
【申請人】國立研究開發法人國際農林水產業研究中心