具有提高的l-蘇氨酸生產能力的微生物以及使用其生產l-蘇氨酸的方法

具有提高的l-蘇氨酸生產能力的微生物以及使用其生產l-蘇氨酸的方法
【專利摘要】本發明涉及新型變體RNA聚合酶σ因子70(σ70)多肽、編碼其的多核苷酸、含有該多肽的微生物以及使用該微生物生產L?蘇氨酸的方法。KCCM11560P20140806
【專利說明】
具有提高的L-蘇氨酸生產能力的微生物以及使用其生產L-蘇 氨酸的方法
技術領域
[0001 ]本發明涉及一種新型變體RNA聚合酶〇因子70 ()多肽、編碼其的多核苷酸、含有 該多肽的微生物、以及使用該微生物生產L-蘇氨酸的方法。
【背景技術】
[0002] 通常，有用的產物諸如氨基酸可以通過使用經由人工突變或遺傳重組開發出的微 生物菌株的發酵方法來生產。特別是，在開發用于大規模生產氨基酸的微生物菌株中，發現 直接/間接參與生產的更高級聯步驟(cascade step)的遺傳因子，并適當地利用它們來開 發能夠產生更高收率的微生物菌株將是有利的。在此方面的代表性技術可以是全局轉錄機 器工程(gTME)，其可以通過在RNA聚合酶的招募蛋白質上引起隨機突變來調控所有細胞內 基因的表達。
[0003] RNA聚合酶是由五種亞基和《組成的大分子，并且其全酶表示為a2邱'《。 同這些全酶一起，0因子一一存在于原核生物中的轉錄起始因子一一可以允許RNA聚合酶與 啟動子特異性結合，并且可以通過其分子量進行區分。例如，代表分子量為70kDa的〇因子 (Gruber TM,Gross CA,Annu Rev Microbiol.57:441-66,2003)〇
[0004] 已知大腸桿菌（Escherichia coli)具有持家〇因子〇7Q(RpoD)、氮限制〇因子〇54 (RpoN)、饑餓/穩定期。因子〇38(Rp〇S)、熱激。因子 〇32(Rp〇H)、鞭毛。因子〇28(Rp 〇F)、胞質外/ 極端熱應力〇因子〇24(Rp〇E)、檸檬酸鐵〇因子 〇19(FecI)等。已知這些不同〇因子在不同的環 境條件下被激活，并且這些特征〇因子可以與在特定環境條件下轉錄的基因的啟動子結合， 從而調控基因的轉錄。已經報道了關于通過在〇因子70上允許隨機突變來增加目標物質生 產力的研究（Metabolic Engineering 9.2007.258-267)，并且還有關于在大腸桿菌 (E.coli)中使用gTME技術增加酪氨酸生產的研究報道(美國專利第8735132號）。

【發明內容】

[0005] 技術問題
[0006] 本發明人，在努力開發能夠以提高的濃度生產L-蘇氨酸而不使宿主細胞生長阻滯 的微生物時，開發了一種新型經修飾的RNA聚合酶 〇因子70多肽，并且還發現可以通過將新 型經修飾的RNA聚合酶〇因子70多肽導入到具有L-蘇氨酸生產能力的埃希氏菌屬 (Escherichia sp.)中開發具有提高的L-蘇氨酸生產能力的細菌菌株。
[0007] 技術方案
[0008]本發明的目的是提供具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的RNA聚合酶〇因子70活性的 經修飾的多肽，其中一部分氨基酸被取代。
[0009] 本發明的另一目的是提供編碼該多肽的多核苷酸。
[0010] 本發明的另一目的是提供包括該多肽的轉化微生物。
[0011] 本發明的又一目的是提供生產L-蘇氨酸的方法，所述方法包括培養該微生物;和 從培養的微生物或者其培養基中回收L-蘇氨酸。
[0012]有利效果
[0013]本發明實現了能夠上調L-蘇氨酸生產能力的RNA聚合酶〇因子70多肽的新型變體 的確認。此外，基于其的能夠表達經修飾的多肽的微生物具有L-蘇氨酸生產的優異收率，并 且，因此從工業的角度來看，該微生物可以提供生產便利、以及生產成本的降低。
【具體實施方式】
[0014] 在上述目的方面中，本發明提供具有RNA聚合酶〇因子70活性的新型經修飾的多 肽。
[0015] 如本文所使用的，術語"RNA聚合酶〇因子70"是指蛋白質〇7()- 〇因子中的一種，并且 被稱為〇因子D (RpoD)。同RNA聚合酶一起，蛋白質充當轉錄起始因子中的一種。〇因子通過 與特定啟動子和不同轉錄因子上游上的上游DNA(UP元件）相互作用來參與轉錄的調控。具 體而言， 〇因子70(〇?)是大腸桿菌〇因子中的主要調節子，其控制著大多數持家基因和核心 基因，并且已知在大腸桿菌指數期起主導作用（Jishage M等人，J Bacteriol 178(18); 5447-51，1996)。可從已知數據庫（如NCBI GenBank)中獲得關于〇因子70蛋白質的信息，例 如，其可以是具有登錄號NP_417539的蛋白質。具體地，〇7Q蛋白質可包括SEQ ID N0:8的氨基 酸序列，但并不限于此，只要蛋白質具有與本發明的蛋白質相同的活性。
[0016] 如本文所使用的，術語"經修飾的多肽"通常是指其中多肽的部分或全部氨基酸序 列被取代的野生型多肽。在本發明中，它指代的是具有RNA聚合酶 〇因子70(〇?)活性的多肽， 其具有與野生型部分不同的氨基酸序列，通過取代野生型〇因子70( 〇7())的部分氨基酸序列 而制得，即，有助于增強L-蘇氨酸生產能力的〇因子70( 〇?)經修飾的多肽
[0017] 具體地，經修飾的多肽可以是具有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的RNA聚合酶0因子 70活性的多肽，其中在440 至450; 459; 466; 470 至479; 484; 495 至499; 509; 527; 565 至 570; 575至580; 599;和612位置（自作為第一氨基酸的初始甲硫氨酸起)處的至少一個氨基酸被 另一個氨基酸取代。即，經修飾的多肽可以是這樣的多肽:其中在45個位置(位置440至450、 459、466、470 至479、484、495 至499、509、527、565至570、575至580、599和612)的至少一個中 的氨基酸可被另一個氨基酸取代。例如，位置的個數可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更 多，但并不限于此，只要其具有RNA聚合酶 〇因子70的活性。
[0018] 更具體地，在那些處于位置440至450中的位置440、446或448處的氨基酸；在那些 處于位置470至479中的位置474或477處的氨基酸;在那些處于位置495至499中的位置496 或498處的氨基酸;在那些處于位置565至570中的位置567或569處的氨基酸；以及在那些處 于位置575至580中的位置576或579處的氨基酸可被另一個氨基酸取代，但并不限于此。 [0019]進一步更具體地，在位置440處的氨基酸可被脯氨酸取代(T440P);在位置446處的 氨基酸可被脯氨酸取代（Q446P);在位置448處的氨基酸可被絲氨酸取代(R448S);在位置 459處的氨基酸可被天冬酰胺取代（T459N);在位置466處的氨基酸可被絲氨酸取代 (I466S);在位置474處的氨基酸可被纈氨酸取代(M474V);在位置477處的氨基酸可被甘氨 酸取代(E477G);在位置484處的氨基酸可被纈氨酸取代(A484V);在位置496處的氨基酸可 被天冬酰胺取代(K496N);在位置498處的氨基酸可被精氨酸取代(L498R);在位置509處的 氨基酸可被甲硫氨酸取代(T509M);在位置527處的氨基酸可被脯氨酸取代(T527P);在位置 567處的氨基酸可被纈氨酸取代(M567V);在位置569處的氨基酸可被脯氨酸取代(T569P); 在位置576處的氨基酸可被甘氨酸取代（N576G);在位置579處的氨基酸可被精氨酸 (Q579R)、亮氨酸（Q579L)、蘇氨酸（Q579T)、異亮氨酸（Q579I)、甘氨酸（Q579G)、丙氨酸 (Q579A)、脯氨酸(Q579P)或絲氨酸(Q579S)取代;在位置599處的氨基酸可被半胱氨酸取代 (R599C);或位置612處的氨基酸可被甘氨酸(D612G)、酪氨酸(D612Y)、蘇氨酸(D612T)、天冬 酰胺(D612N)、苯丙氨酸(D612F)、賴氨酸(D612K)、絲氨酸(D612S)、精氨酸(D612R)或組氨酸 (D612H)取代，或者可以是具有終止密碼子的氨基酸缺失(D612*)，但并不限于此。當核苷酸 被終止密碼子取代時，可以沒有氨基酸。
[0020] 甚至更具體地，經修飾的多肽可以是具有SEQ ID N0S:9至37中的氨基酸序列的多 肽，但并不限于此。
[0021] 本發明的經修飾的多肽可以不僅包括SEQ ID N0S:9至37的氨基酸序列，而且還包 括與這些序列具有至少70%同源性的那些，具體地至少80%，更具體地至少90%，甚至更具 體地至少99%，而不受限制，只要相比于野生型 〇因子70(〇7())，蛋白質能夠有助于增強L-蘇 氨酸生產能力。
[0022] 作為具有此類同源性的序列，如果氨基酸序列是基本上具有經修飾的〇因子70 (〇?)的相同或相應生物活性的氨基酸序列，則明顯的是，在部分序列中經缺失、修飾、取代 或添加的氨基酸序列也應包括在本發明的范圍內。
[0023] 如本文所使用的，術語"同源性"是指在編碼蛋白質的基因的兩種不同氨基酸序列 或核苷酸序列之間的核苷酸或氨基酸殘基的同一性程度一一當對它們進行比對以在特定 區域最大配對時。當它們之間有足夠高的同源性時，對應基因的表達產物可具有相同或相 似的活性。序列之間的同源性可通過本領域已知的技術(例如，包括BLAST (NCBI)、CLCMain Workbench(CLC bio)、MegAlign(DNASTAR Inc)等的已知序列比較程序）測定。
[0024] 另一方面，本發明提供編碼經修飾的多肽的多核苷酸。
[0025] 如本文所使用的，術語"多核苷酸"是指核苷酸聚合物，其中核苷酸單體通過共價 鍵以鏈形狀(具體地DNA鏈或RNA鏈)縱向連接。更具體地，在本發明中，其可以是編碼經修飾 的多肽的多核苷酸片段。
[0026]在本發明的示例性實施方式中，編碼RNA聚合酶〇因子70的氨基酸序列的基因是 rpoD基因，并且可以具體為源自埃希氏菌屬的基因，更具體為源自大腸桿菌的基因。編碼野 生型RNA聚合酶〇因子70的多核苷酸可由SEQ ID N0:7表示，但并不限于此。此外，基于遺傳 密碼簡并性，編碼相同氨基酸序列的多核苷酸序列及其變體也應包括在本發明的范圍內。
[0027]此外，對于本發明的經修飾的多核苷酸而言，基于遺傳密碼簡并性，編碼相同氨基 酸序列的多核苷酸序列及其變體也應包括在本發明的范圍內。具體地，可以包括編碼SEQ ID N0:8的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列一一其中至少一個氨基酸被另一個上述氨基酸 取代--或其變體。具體而言，上述變異位置可以是在440至450;459 ;466;470至479;484; 495至499; 509; 527; 565至570; 575至580; 599;和612處（自作為第一氨基酸的初始甲硫氨酸 起)的氨基酸位置。
[0028]更具體地，上述變異位置可以是在位置440處的氨基酸被脯氨酸取代(T440P);在 位置446處的氨基酸被脯氨酸取代(Q446P);在位置448處的氨基酸被絲氨酸取代(R448S); 在位置459處的氨基酸被天冬酰胺取代（T459N);在位置466處的氨基酸被絲氨酸取代 (I466S);在位置474處的氨基酸被纈氨酸取代(M474V);在位置477處的氨基酸被甘氨酸取 代(E477G);在位置484處的氨基酸被纈氨酸取代(A484V);在位置496處的氨基酸被天冬酰 胺取代(K496N);在位置498處的氨基酸被精氨酸取代(L498R);在位置509處的氨基酸被甲 硫氨酸取代(T509M);在位置527處的氨基酸被脯氨酸取代(T527P);在位置567處的氨基酸 被纈氨酸取代(M567V);在位置569處的氨基酸被脯氨酸取代(T569P);在位置576處的氨基 酸被甘氨酸取代(N576G);在位置579處的氨基酸被精氨酸(Q579R)、亮氨酸(Q579L)、蘇氨酸 (Q579T)、異亮氨酸（Q579I)、甘氨酸（Q579G)、丙氨酸（Q579A)、脯氨酸（Q579P)或絲氨酸 (Q579S)取代;在位置599處的氨基酸被半胱氨酸取代(R599C);或者在位置612處的氨基酸 被甘氨酸(D612G)、酪氨酸(D612Y)、蘇氨酸(D612T)、天冬酰胺(D612N)、苯丙氨酸(D612F)、 賴氨酸(D612K)、絲氨酸(D612S)、精氨酸(D612R)或組氨酸(D612H)取代;或者核苷酸被終止 密碼子取代(D612*)，并且可包括編碼經修飾的多肽的氨基酸序列的核苷酸序列一一其中 氨基酸取代是上述34種氨基酸取代中的至少一種的組合一一或其變體。
[0029] 甚至更具體地，可包括編碼SEQ ID N0S: 9至37的氨基酸序列中的任何氨基酸序列 的核苷酸序列或其變體。
[0030] 另一方面，本發明提供包括編碼經修飾的多肽的多核苷酸的宿主細胞、用包括編 碼經修飾的多肽的多核苷酸的載體轉化的微生物、或引入有經修飾的多肽的微生物。具體 地，可以通過轉化進行引入，但并不限于此。
[0031] 具體地，相比于包括野生型〇因子70(〇?)多肽的微生物，包括〇因子70( 〇7())修飾的 多肽的微生物可具有增強的L-蘇氨酸生產能力而不對宿主細胞生長抑制，因此可以從這些 微生物中以高收率得到L-蘇氨酸。
[0032] 如本文所使用的，術語"載體"是指用于克隆和/或將核苷酸序列轉移到宿主細胞 中的任何介質。載體可以是能夠與不同DNA片段結合的復制子，其導致組合片斷的復制。如 本文所使用的，術語"復制子"是指可以通過自調節復制的任何遺傳單元(例如，質粒、噬菌 體、黏粒、染色體和病毒）。載體可包括在體內、先體外后體內（ex-vivo)或體外將核苷酸引 入到宿主細胞中的病毒性或非病毒性介質，并且也可包括小環DNA。例如，載體可包括不具 有任何細菌DNA序列的質粒(Ehrhardt，A等人?（2003)HumGene Ther 10: 215-25; Yet，N. S ? (2002)M〇I Ther 5:731-38;Chen，Z.Y?等人.（2004)Gene Ther 11:856-64)。此外，載體可 包括轉座子(Annu Rev Genet ? 2003; 37 :3-29 ?)或人工染色體。具體地，可使用pACYC177、 pACYC184、pCL1920、pECCGl 17、pUC19、pBR322、pDZ、pCClBAC 和 pMW 118 載體，但它們并不限于 此。
[0033] 如本文所使用的，術語"轉化"是指將基因引入到宿主細胞中以在宿主細胞中表 達，并且轉化的基因可不受具體限制，只要其可以在宿主細胞中表達，無論轉化的基因是否 插入到宿主細胞的染色體中或位于染色體外部。
[0034] 可以以表達盒的形式將基因引入到宿主細胞中，所述表達盒是包括所有自表達必 要元件的多核苷酸構建體。表達盒可包括以傳統方式可操作地連接至基因的啟動子、轉錄 終止信號、核糖體結合結構域和翻譯終止信號。表達盒可以是可自復制的表達載體。此外， 基因可以是作為基因自身或者以與在宿主細胞中表達所必要的序列連接的多核苷酸構建 體的形式被引入到宿主細胞中的基因，但并不限于此。
[0035] 如本文所使用的，術語"宿主細胞"或"微生物"可以是指包括編碼經修飾的多肽的 多核苷酸、或者由包括編碼經修飾的多肽的多核苷酸的載體轉化并因此可以表達經修飾的 多肽的任何細胞或微生物。
[0036]在本發明中，宿主細胞或微生物可以是能夠生產L-蘇氨酸并且包括修飾的〇因子 70(〇?)的任何細胞或微生物。微生物的實例可包括埃希氏菌屬(Escherichia sp.)、沙雷氏 菌屬（Serratia sp.)、歐文氏菌屬(Erwinia sp.)、腸桿菌屬(Enterobacteria sp.)、沙門 氏菌屬（Salmonella sp.)、鏈霉菌屬（Streptomyces sp.)、假單胞菌屬（Pseudomona sp.)、 短桿菌屬(Brevibacterium sp ?)、棒桿菌屬(Corynebacteria sp ?)等；具體地屬于埃希氏 菌屬的微生物，更具體地大腸桿菌，但其并不限于此。
[0037]另一方面，本發明提供生產L-蘇氨酸的方法，其包括在培養基中培養所述微生物， 和從培養的微生物或其培養基中回收L-蘇氨酸。
[0038] 如本文所使用的，術語"培養"是指在適當和人工調節的環境下使微生物生長。根 據本領域已知的合適的培養基和培養條件可進行培養過程。根據本領域普通技術人員的公 知常識或本領域已知的常規方法可進行具體的培養過程，并且可相應地進行適當調整。具 體地，在[Chmiel;Bioprozesstechnik 1.Einfuhrung indie Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991)和Storhas;Bioreaktoren und periphere Einrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994)]中詳細描述了培養方 法。此外，培養方法可包括分批培養、連續培養和補料分批培養，具體地，可以在補料分批或 重復補料分批過程中進行連續培養，但并不限于此。
[0039] 用于培養的培養基應當滿足每種具體菌株的需求。包含在培養基中的碳源的實例 可包括糖和碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、淀粉和纖維素；油類及脂肪 類，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如軟脂酸、硬脂酸和亞油酸;醇類，如甘油 和乙醇；以及有機酸，如醋酸。這些碳源可單獨或組合使用，但并不限于此。包含在培養基中 的氮源的實例可包括蛋白胨、酵母提取物、肉汁、麥芽提取物、玉米漿和豆粉、尿素或無機氮 源，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。這些氮源可單獨或組合使用，但并不限于 此。包含在培養基中的磷源的實例可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀以及相應的含鈉鹽，但并 不限于此。培養基可包括金屬，如硫酸鎂和硫酸鐵。此外，也可包括生長所必須的物質（如氨 基酸和維生素）。此外，也可使用適用于培養基的前體。可以以分批培養或連續培養的形式 將這些物質添加至培養物中，但并不限于此。
[0040] 此外，在培養過程中可以以適當的方式通過添加化合物諸如氫氧化銨、氫氧化鉀、 氨、磷酸和硫酸來調節培養物的pH。此外，在培養過程中可以使用消泡劑諸如脂肪酸聚乙二 醇酯預防泡沫形成。此外，為了保持培養液中的需氧條件，可以將氧氣或含氧氣體添加至培 養物;不添加空氣以保持厭氧條件或微需氧條件;或者可以注入氮氣、氫氣或二氧化碳。可 以在27 °C至37 °C下進行培養，具體在30 °C至35 °C下。可以繼續培養直到可以獲得期望數量 的有用物質的生產，具體地進行10小時至100小時。L-蘇氨酸可以被導出到培養基中或可以 保持包含在微生物中。
[0041 ]從微生物或其培養物中回收L-蘇氨酸的方法是本領域眾所周知的。例如，可使用 諸如過濾、陰離子交換色譜、結晶、HPLC等的方法，但并不限于此。
[0042]發明方式
[0043]下文中，參照下列實施例將對本發明進行更加詳細的描述。然而，這些實施例僅是 為了說明性目的，并且發明并不意在受這些實施例的限制。
[0044] 實施例1 ?重組載體pCCIBAC-rpoD的構建
[0045] 為了得到包括rpoD基因（NCBI Gene ID:947567，SEQ ID N0:7)的大小為約2.0kb 的DNA片段，利用Genomic-tip系統（Qiagen)提取大腸桿菌野生型菌株W3110的染色體DNA (gDNA)，并使用gDNA作為模板以PCR HL預混合液試劑盒(BI0NEER，Korea;在下文中使用相 同的產品）進行聚合酶鏈反應(下稱"PCR"）。
[0046] 按以下方式使用引物SEQ ID N0:1和SEQ ID勵:2進行擴增印〇0基因的？0?反應27 個循環：于95°C變性30秒、于56°C退火30秒以及于72°C延伸2分鐘。用Hindlll和EcoRI消化 PCR產物，在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并通過洗脫從中得到2.Okb DNA片段(下稱"rpoD 片段"）。
[0047] 【表1】
[0049]隨后，用氾11(1111和￡(3〇1?1消化(：(^7(3〇11杜〇1?0：18厶(：載體（￡?1〇￡町1^，1]5厶），在 0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并通過洗脫從中得到。將生成物連接至rpoD片段以構建 pCCIBAC-rpoD 質粒。
[0050] 實施例2:重組載體pCCIBAC-部分rpoD的構建
[0051] 為了得到包括從大腸桿菌W3110的rpoD基因中啟動子到BamHI限制位點的區域的、 大小為約1.5kb的DNA片段，使用實施例1中制備的gDNA作為模板進行PCR。
[0052] 按以下方式使用引物SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3進行PCR反應（同實施例1中一樣 進行27個循環）：于95°C變性30秒、于56°C退火30秒以及于72°C延伸1分鐘。用BamHI和 HindllI消化PCR產物，在0.8%瓊脂糖凝膠上進行電泳，并通過洗脫從中得到1.5kb DNA片 段。
[0053]【表2】
[0055] 隨后，用BamHI和Hindlll消化Copycontrol pCCIBAC載體，在0.8%瓊脂糖凝膠上 進行電泳，并通過洗脫得到。將生成物連接至部分rpoD片段以構建pCCIBAC-部分rpoD質粒。 [0056] 實施例3:通過易錯PCR生成rpoDm片段
[0057]為了在W3110的rpoD基因的保守區2.4、3和4中引入隨機修飾，發明人想要得到 rpoD片段的DNA池，其中從基因內的BamHI限制位點至編碼該基因的末端引入隨機修飾。 [0058]為達到此目的，根據在其使用手冊中所述的表1II中的誘變反應4(mutagenesis react ions)的條件，使用實施例1中得到的gDNA以多樣化PCR隨機誘變試劑盒（目錄編號： 630703;Clonetech)進行PCR反應。具體地，按以下方式使用SEQ ID N0:2和SEQ ID N0:4引 物進行PCR反應25個循環:于94°C變性30秒、于56°C退火30秒以及于68°C延伸30秒。
[0059]【表3】
[00611隨后，作為PCR產物得到在其中引入隨機核苷酸取代的突變的人工(mutated art) rpoD DNA池，并用BamHI和EcoRI消化PCR產物，在0.8 %瓊脂糖凝膠上進行電泳，并通過洗脫 從中得到0.5kb DNA片段(下稱"人工rpoD片段"）。
[0062] 實施例4:包括經修飾的rpoD的重組載體pCCIBAC-rpoD突變文庫的構建
[0063] 用BamHI和EcoRI處理在實施例2中構建的pCCIBAC-部分rpoD載體，隨后用堿性磷 酸酶(NEB)進行處理。
[0064] 然后，分別用BamHI和EcoRI處理實施例3中得到的人工rpoD片段，并將其連接至已 經用限制酶進行處理的pCCIBAC-部分rpoD載體、轉化到TransforMax EPI300電感受態大腸 桿菌(EPICENTRE)中、在含15yg/mL氯霉素的LB板中培養，并從中選出菌落。收集所選擇的菌 落并經歷質粒制備(plasmid prep)以構建pCCIBAC-rpoD突變文庫。
[0065] 實施例5:將pCCIBAC-rpoD突變文庫引入到蘇氨酸生產菌株中
[0066]通過轉化將在實施例4中構建的pCCIBAC-rpoD突變文庫引入到為蘇氨酸生產菌株 的KCCM10541的電感受態細胞中。
[0067] 具體而言，KCCM10541(韓國專利號10-0576342)--在該實施例中所用的大腸桿 菌菌株--是源自KFCC10718(韓國專利號10-0058286)的大腸桿菌菌株，其中galR基因失 活。
[0068]實施例6:重組微生物之間的L-蘇氨酸生產能力的比較，以及核苷酸序列的確認 [0069]在下表4中所示的效價培養基（titer medium)中培養在實施例5中構建的重組微 生物文庫，并檢測L-蘇氨酸生產的提高。
[0070]【表4】
[0072]具體地，通過鉑金環分別將在33 °C培養箱中在固體LB培養基中過夜培養大腸桿菌 KCCM10541/pCClBAC-rpoD 和大腸桿菌 KCCM10541/pCClBAC-rpoD 突變文庫接種到 25mL 效價 培養基中，并在33°C培養箱中同時以200rpm振動培養48小時。重復整個過程以評估rpoD突 變文庫，并選出具有提高收率的那些克隆。
[0073]【表5】

[0076] 上表5所示的結果表明，當培養48小時，親本菌株KCCM 10541和對照菌株 KCCM10541/pCClBAC-rpoD 產生約 30 ? 4g/L 的 L-蘇氨酸。
[0077]相反，相比于其親本菌株，引入有pCCIBAC-rpoD突變文庫的重組大腸桿菌產生從 31.9g/L至34.2g/L范圍的L-蘇氨酸，從而顯示出提高的L-蘇氨酸生產能力，即，相比于其親 本菌株，L-蘇氨酸生產能力提高4.8%至12.6%。
[0078]另外，通過測序檢測在具有提高的L-蘇氨酸生產能力的大腸桿菌的修飾rpoD基因 的每個修飾中的修飾位置和取代氨基酸，結果顯示在表5中。
[0079]同時，在轉化的大腸桿菌之中具有L-蘇氨酸生產能力最大提高的重組大腸桿菌 (命名為"KCCM10541/pCClBAC-rpoDm19"）于2014年8月6日保藏于韓國微生物保藏中心(登錄 號:KCCM11560P)。
[0080] 實施例7:引入有選擇的rpoD變體的野生型菌株和對其蘇氨酸生產有增強的生物 合成途徑的野生型菌株的構建
[0081 ]在實施例6中確認有提高的蘇氨酸生產能力的rpoD變體中的一些變異基于野生型 菌株經歷對其作用再確認。以與實施例5中相同的方式，用在實施例6中確認的rpoD變異對 野生型菌株W3110進行轉化，并且被指定為W3110/pCClBAC-rp 〇Dm。使引入有rpoD變異的菌 株引入有pACYC184-thrABC載體，以提供具有蘇氨酸生產能力的菌株。按下述構建 pACYC184-thrABC〇
[0082]使用源自大腸桿菌菌株KCCM 10718(韓國專利號10-0058286)的L-蘇氨酸生產大 腸桿菌菌株KCCM 10541 (韓國專利號10-0576342;中國專利號100379851C)的基因組DNA作 為模板同引物SEQ ID N0S:5和6(表6)-起進行PCR。從中得到的DNA片段被分離/純化、通過 用Hindlll處理，隨后進行純化而制備，從而制備出thrABC DNA片段。通過用Hindlll處理隨 后進行純化制備PACYC184載體，并將其連接從而構建pACYC184-thrABC載體。將由此制備的 載體引入到W3110/pCClBAC-rpoD m菌株中，以構建W3110/pCClBAC-rpoDm、pACYC184-thrABC 菌株。
[0083]【表6】
[0085] 實施例8:野生型菌株、具有rpoD變異的基于野生型菌株的重組微生物以及對其蘇 氨酸生產有增強的生物合成途徑的菌株之間的L-蘇氨酸生產能力的比較
[0086] 在使用蘇氨酸效價培養基的錐形燒瓶中培養實施例7中制備的重組微生物，并從 而確定其提高的L-蘇氨酸生產力。
[0087] 【表7】
[0089] 將在33°C培養箱中在固體LB培養基中過夜培養的W3110/pCClBAC-rpoDm、
[0090] W3110/pACYC184-thrABC、pCClBAC 和 株中的每一個的鉑金環接種在表7中所示的效價培養基（25mL)，并在33°C培養箱中以 200rpm的速率培養48小時。結果顯示在下表8中。
[0091] 【表8】
[0093] 如表8所示，野生型菌株W3110/pCClBAC以及其它菌株W3110/pCClBAC-rpoD、 W3110/pCClBAC-rpoD m2和W3110/pCClBAC-rpoDm19當被培養48小時不再產生L-蘇氨酸，而引 入有變體的菌株顯示出葡萄糖消耗的減少。W3110/pACYC184-thrABC、pCClBAC菌株--為 生產L-蘇氨酸而在野生型基礎上構建的重組菌株一一產生1.42g/L的L-蘇氨酸，而W3110/ pACYC184-thrABC、pCClBAC-rpoD菌株產生1 ? 43g/L的L-蘇氨酸，從而顯示出2 ? 8%的收率。
[0094] 相反，W3110/pACYC184-thrABC、pCClBAC-rpoDm2 菌株和 W3110/pACYC184-thrABC、 pCClBAC-rp〇Dm19菌株一一為引入有rpoD變異的基于野生型的重組菌株一一分別顯示出48 小時51.2g/L和51 .Og/L量的葡萄糖消耗，并且分別產生1.50g/L和1.53g/L量的蘇氨酸，從 而顯示出蘇氨酸的3.0%和3.1 %收率。即，證實了 rpoD變異的引入提高了蘇氨酸收率約7% 至10%，從而再次確認本發明中所選擇的rpoD變異是有效的變體。
[0095] 實施例9:通過組合選擇的重組rpoD變異對L-蘇氨酸生產能力的檢測
[0096] 為了通過組合包括在選擇的變異中每個不同對象中的變異來檢測蘇氨酸生產能 力的變化，為一些最常選擇的變異構建具有組合變異的載體。通過組合上述評估的rp 〇Dm2變 異和印〇01"14變異來構建印〇0 1^3(3￡0 10^):31)變異--其中組合了在440、579和612位置 處的氨基酸序列的變異。進一步地，通過組合rp 〇Dm16變異和rp〇Dm3變異來構建引入有最多變 異的rpoD m24(SEQ ID N0:32)變異。使rpoDm24變異引入有在446、448、466、527和567位置處的 氨基酸序列變異的rp 〇Dm16變異和在579和612位置處的氨基酸序列變異rp〇Dm3變異兩者。此 外，在3種區變異之中，通過組合rp 〇Dm15的位置496處的氨基酸序列變異和rp〇Dml的位置579 和612處的氨基酸序列變異來構建印〇0 1^5(3￡0 10從):33)變異。
[0097] 此外，構建存在于相互不同的變異中的氨基酸變異的組合以確認其作用。例如，將 在最常選擇的440、579和/或612位置處的氨基酸變異進行組合以構建rpoD m26(SEQ ID N0: 34)--其中組合位置440和579處的變異;和rpoDm27(SEQ ID N0:35)--其中組合位置440 和612處的變異。
[0098] 此外，構建在選擇的變異中低頻率變異的組合以確認其作用。例如，為了構建 rpoDm28(SEQ ID觀：36)，將印(^17的位置477處的變異、印(^19的位置484處的變異和 rpoD m2Q的位置509處的變異進行組合;和為了構建rpoDm29(SEQ ID N0:37)，將rpoDm18的位置 599處的變異、rp〇Dm2()的位置459處的變異和rp 〇Dm21的位置576處的變異進行組合。
[0099] 將由此制備的引入有 rp〇Dm23、rpoDm24、rpoDm25、rpoDm26、rpoD m27、rpoDm28 和 rpoDm29 變 異的載體與在實施例7中制備的pACYC184-thrABC載體一起引入到W3110中，并使用表7中所 示的培養基進行效價評估。結果顯示在下表9中。
[0100] 【表9】

[0103]基于上述，本發明所屬的本領域技術人員將能夠理解，可以以其它具體的形式體 現本發明，而不改變本發明的技術理念或本質特征。在這方面，本文公開的示例性實施方式 僅是為了說明性目的，并且不應被理解為限制本發明的范圍。相反，本發明旨在不僅涵蓋示 例性實施方式，而且涵蓋可以包括在由所附權利要求限定的本發明的精神和范圍內的各種 替換、修改、等同物和其它實施方式。
【主權項】
1. 經修飾的多肽，其具有RNA聚合酶σ因子70的活性，其中在SEQ ID N0:8的氨基酸序列 中在自作為第一氨基酸的甲硫氨酸起440至450; 459; 466; 470至479; 484; 495至499; 509; 527; 565至570; 575至580; 599;和612位置處的至少一個氨基酸被另一個氨基酸取代。2. 根據權利要求1所述的經修飾的多肽，其中在440; 446; 448; 459; 466; 474; 477; 484; 496; 498; 509; 527; 567; 569; 576; 579; 599;和612位置處的至少一個氨基酸被另一個氨基酸 取代。3. 根據權利要求1所述的經修飾的多肽，其中所述取代是選自以下的至少一種取代或 其組合:在位置440處的氨基酸被脯氨酸取代;在位置446處的氨基酸被脯氨酸取代;在位置 448處的氨基酸被絲氨酸取代;在位置459處的氨基酸被天冬酰胺取代;在位置466處的氨基 酸被絲氨酸取代;在位置474處的氨基酸被纈氨酸取代;在位置477處的氨基酸被甘氨酸取 代;在位置484處的氨基酸被纈氨酸取代;在位置496處的氨基酸被天冬酰胺取代;在位置 498處的氨基酸被精氨酸取代;在位置509處的氨基酸被甲硫氨酸取代;在位置527處的氨基 酸被脯氨酸取代;在位置567處的氨基酸被纈氨酸取代;在位置569處的氨基酸被脯氨酸取 代;在位置576處的氨基酸被甘氨酸取代;在位置579處的氨基酸被精氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、 異亮氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸取代;在位置599處的氨基酸被半胱氨酸取代； 和在位置612處的氨基酸被甘氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸、 精氨酸、組氨酸或終止密碼子取代。4. 根據權利要求1所述的經修飾的多肽，其中所述經修飾的多肽具有選自SEQ ID NOS: 9至37的氨基酸序列的氨基酸序列。5. 多核苷酸，其編碼權利要求1所述的經修飾的多肽。6. 宿主細胞，其包括權利要求5所述的多核苷酸。7. 微生物，其屬于埃希氏菌屬化8(：1161'；[(31113)，具有1^-蘇氨酸生產能力，其被修飾以包 括具有RNA聚合酶0因子70活性的經修飾的多肽，其中在SEQ ID NO:8的氨基酸序列中在自 作為第一氨基酸的甲硫氨酸起440至450; 459; 466; 470至479; 484; 495至499; 509; 527; 565 至570; 575至580; 599;和612位置處的至少一個氨基酸被另一個氨基酸取代。8. 根據權利要求7所述的微生物，其中在440 ; 446 ; 448 ; 459 ; 466 ; 474; 477 ; 484; 496 ; 498; 509; 527; 567; 569; 576; 579; 599;和612位置處的至少一個氨基酸被另一個氨基酸取 代。9. 根據權利要求7所述的微生物，其中所述取代是選自以下的至少一種取代或其組合： 在位置440處的氨基酸被脯氨酸取代;在位置446處的氨基酸被脯氨酸取代;在位置448處的 氨基酸被絲氨酸取代;在位置459處的氨基酸被天冬酰胺取代;在位置466處的氨基酸被絲 氨酸取代;在位置474處的氨基酸被纈氨酸取代;在位置477處的氨基酸被甘氨酸取代;在位 置484處的氨基酸被纈氨酸取代;在位置496處的氨基酸被天冬酰胺取代;在位置498處的氨 基酸被精氨酸取代;在位置509處的氨基酸被甲硫氨酸取代;在位置527處的氨基酸被脯氨 酸取代;在位置567處的氨基酸被繳氨酸取代;在位置569處的氨基酸被脯氨酸取代;在位置 576處的氨基酸被甘氨酸取代;在位置579處的氨基酸被精氨酸、亮氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、 甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸或絲氨酸取代;在位置599處的氨基酸被半胱氨酸取代；以及在位置 612處的氨基酸被甘氨酸、酪氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、賴氨酸、絲氨酸、精氨酸、組 氨酸或終止密碼子取代。10. 根據權利要求7所述的微生物，其中所述微生物是大腸桿菌(Escherichia coli)。11. 生產L-蘇氨酸的方法，其包括在培養基中培養權利要求7至10中任一項所述的微生 物;和從所培養的微生物或其培養基中回收L-蘇氨酸。
【文檔編號】C12P13/08GK106029879SQ201580006567
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年9月4日
【發明人】李知宣, 李光鎬, 金孝珍, 李根喆, 黃榮彬
【申請人】Cj第制糖株式會社, Cj第一制糖株式會社