漿細胞樣樹突狀細胞的耗竭的制作方法

漿細胞樣樹突狀細胞的耗竭的制作方法
【專利摘要】本發明涉及耗竭漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)的靶向BDCA2的抗體和使用所述抗體治療與pDC有關的病癥的方法。
【專利說明】漿細胞樣樹突狀細胞的耗竭
[0001] 相關申請 本申請要求2013年12月16日提交的美國臨時申請號61/916,322的權益。本申請的全部 內容通過引用完全結合到本文中。
[0002] 聯邦支持聲明 本發明在政府的支持下，按照國家衛生研究院授予的資助號AI077454下進行。政府具 有對本發明的一定權益。 發明領域
[0003] 本發明涉及耗竭漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)的靶向BDCA2的抗體和使用所述抗體 治療與PDC有關的病癥的方法。
[0004] 發明背景 漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)是生產有效的I型干擾素（IFN-I)的細胞(Siegal et aL， ?Scie/jce 2財:1835 (1999))并參與控制各種病毒性感染（Cervantes-Barragan et a_/.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109\?>Q12 (2012); Takagi et al.. Immunity J5:958 (2011); Liu, Annu. Rev. Immunol. 23\ 275 (2005); Swiecki et al., Immunity 33: 955 (2010))。然而，pDC在人免疫缺陷病毒-1 (HIV-1)感染和發病機制中的影響仍然是有 爭議的。在一方面，pDC已顯示通過IFN-I生產抑制HIV-1復制（Yonezawa et a_/.，上 Virol. 77:3777 (2003); Fong et al., J. Virol. 7^:11033 (2002)；Gurney et al., J717269 (2004))。此外，HIV-1感染患者中pDC的數目和功能下降與獨立于 0)4+ T-細胞計數的機會性感染相關（Siegal et a^.，XC/ifl.Zorest. 7(9:115 (1986); Feldman et al., Cl in. Immunol. 101:201 (2001)；Lichtner et al., Curr. HIV Res. A 19 (2008))。另一方面，pDC可能促成HIV的免疫發病機制。在HIV-1感染患者中持續的pDC 激活和IFN-I生產與病毒控制無關，但是為疾病進展的預兆(Buimovici-Klein et a入， Lancet J?:344 (1983) ；Buimovici-Klein et al., AIDS Res. J?:99-108 (1986)；Meier et a_/.，TVature ifec/icioe 25:955 (2009))。另外，pDC在致病的亞洲猴(恒河猴和食蟹猴） 和非-致病的非洲猴(烏白眉猴(Sooty mangabeys)和非洲綠猴)二者中的猴免疫缺陷病毒 (SIV)感染急性期期間被激活。然而，pDC激活在非致病的SIV感染中被迅速地控制，而其激 活和IFN-I生產在亞洲猴的致病性感染期間持續（Lederer et a_/.，PZoS'PatAogefls 5: e100 0296 (2009)；Bosinger et al., J. Clin. Invest. 775:3556 (2009)；Jacquelin et al., J. Clin. Invest. 119:354：4： (2009) ；Harris et al., J. Virol. 84:7886 (2010);Campill〇-Gimenez etaL，上 KiroL 財：1838 (2010))。因此，在HIV和pDC之間 的相互作用是不清楚的。
[0005] 本發明通過提供在受試者中耗竭pDC并治療與pDC有關的病癥的抗體解決本領域 以前的缺點。
[0006] 發明簡述 本發明部分基于抗體的鑒定，當將該抗體給予受試者時，其特異性地結合于m)CA2 (血 液樹突狀細胞抗原-2)并耗竭pDC (如，減少pDC的數量）。本發明還基于這些抗體在受試者 中耗竭pDC和在受試者中治療與pDC有關的病癥中的用途。
[0007] 因此，在一方面，本發明涉及在受試者中耗竭pDC的方法，其包括遞送給受試者特 異性地結合BDCA2并耗竭pDC的抗體或其片段，從而耗竭pDC。
[0008] 在另一方面，本發明涉及在受試者中治療與pDC有關的病癥的方法，其包括遞送給 受試者特異性地結合BDCA2并耗竭pDC的抗體或其片段，從而治療所述病癥。
[0009] 在一個另外的方面，本發明涉及特異性地結合BDCA2并耗竭pDC的抗體或其片段在 制備用于治療與PDC有關的病癥的藥物中的用途。
[0010] 在另一個實施方案中，本發明涉及特異性地結合BDCA2并耗竭pDC的抗體或其片段 治療與pDC有關的病癥的用途。
[0011] 在進一步的方面，本發明涉及抗體或其片段，當將所述抗體或其片段給予受試者 時，其特異性地結合于BDCA2并耗竭pDC。
[0012] 在本發明以下的描述中更詳細地闡述本發明的這些和其它方面。
[0013] 附圖簡述 圖la-lf顯示在用致病的HIV-R3A分離株感染的人源化小鼠中的HIV-1感染和免疫-發 病機制。（a)在得自用lng p24/小鼠的R3A接種小鼠（/3 =10)的血漿中的病毒RNA基因組拷 貝數。（b)在外周血和脾中經FACS測定的HLA-DR+⑶38+⑶8 T細胞(⑶3+⑶4-⑶8+)的百分 比的匯總數據。（c)在總⑶3+ T細胞中的相對⑶4+ T細胞(CD3+⑶8-⑶4+)的匯總數據。（d) 在來自未感染的對照小鼠=3)和R3A-感染的小鼠（/3 =10)的脾中絕對CD4 T-細胞、CD8 T-細胞和hu⑶45+細胞數的比較。（e)通過luminex測定的、自未感染的(n=3)和感染的(n= 3) DK〇-hu小鼠的血漿中的IFN-a2生產。（f)在脾(/3 =3)的huCD45+細胞中的Mxl和TR頂22 基因表達的相對水平。點圖中的所有條表示中值。誤差條（Error bars)表示標準偏差 (SD)。*和林分別表示p〈0 ? 05和p〈0 ? 01。
[0014]圖2顯示在通過定量實時PCR (/3 =10)測定的、個體CCR5-向性的JR-CSF-感染的 DK〇-hu小鼠中的病毒血癥的動力學。
[0015] 圖3a-3c顯示在DK〇-hu小鼠的急性R3A感染和慢性JR-CSF感染中的CD8 T細胞激 活。（a)在R3A-感染的小鼠感染后3周的外周血和脾中HLA-DR+⑶38+⑶8 T細胞的百分比 的代表性FACS圖。（b)在JR-CSF-感染的小鼠感染后18周的外周血和脾中HLA-DR+CD38+ ⑶8 T細胞的百分比的代表性FACS圖。（c)對補充圖2b的匯總數據。模擬物n=4; JR-CSF n= 1 〇。點圖中的所有條表示中值。**表示P〈〇. 〇 1。
[0016] 圖4a-4c顯示在DK〇-hu小鼠的急性R3A感染和慢性JR-CSF感染中的CD4 T細胞耗 竭。（a)在R3A-感染的小鼠感染后3周的外周血和脾中的CD4 T細胞(CD8-CD4+)的百分比的 代表性FACS圖。（b)在R3A-感染的小鼠感染后18周的外周血和脾中的⑶4 T細胞(CD8-CD4 + )的百分比的代表性FACS圖。（c)對于補充圖3b的匯總數據。模擬物n=4; JR-CSF n=10。點 圖中的所有條表示中值。**表示P〈〇. 〇 1。
[0017 ]圖5a-5 C顯示在R5-向性的JR-CSF-感染的人源化小鼠感染后3周終結的I型IFN應 答和HIV發病機制。（a)自未感染的對照小鼠（/3 =4)和JR-CSF-感染的小鼠（/3 =10)的脾中 絕對⑶4 T-細胞，CD8 T-細胞和人⑶45+細胞數的比較。（b)在通過luminex測定的、自未感 染的（n=3)和感染的（n=3)人源化小鼠的血漿中IFN-a2的生產。（c)從脾中分離的人CD45+ 細胞的Mxl和TR頂22基因表達的相對水平。點圖中的所有條表示中值。誤差條表示標準偏差 (SD)。*和林分別表示p〈0 ? 05和p〈0 ? 01。
[0018] 圖6a-6b顯示在DK〇-hu小鼠中由15B介導的pDC的耗竭。（a-b)人源化小鼠用15B或 者同種型對照（同種)抗體處理，總人白細胞(CD45+)的pDC (CD4+CD123+)百分比經FACS分 析。（a)代表性的FACS圖和匯總數據顯示在抗體處理前后外周血(n=7)中的相對pDC頻度。 (b)代表性FACS圖和匯總數據顯示在腸系膜淋巴結(mLN，同種型n=4;15B n=5)和脾(SP，同 種型n=4;15B n=5)中通過15B導致的pDC耗竭。點圖中的所有條表示中值。誤差條表示標準 偏差（SD)。*和林分別表示p〈0 ? 05和p〈0 ? 01。
[0019] 圖7a-7c顯示在DK〇-hu小鼠的不同淋巴器官中由15B誘導的特異性pDC耗竭。（a) 代表性FACS圖顯示在hu⑶45+細胞中⑶3+⑶19-細胞和⑶3-⑶19+細胞的百分比。（b-c)對 圖7a的匯總數據。點圖中的所有條表示中值。
[0020] 圖8a-8b顯示在DK〇-hu小鼠的不同淋巴器官中由15B誘導的特異性pDC耗竭。（a) 代表性FACS圖顯示在hu⑶45+細胞中⑶3-⑶14+細胞的百分比。（b)對于圖8a的匯總數據。 [0021] 圖9a-9b顯示在DK〇-hu小鼠的不同淋巴器官中由15B誘導的特異性pDC耗竭。（a) 代表性FACS圖顯示在hu⑶45+細胞中⑶3-⑶llc+細胞的百分比。（b)對于圖9a的匯總數據。 點圖中的所有條表示中值。
[0022] 圖10a-10d顯示pDC的耗竭在DK〇-hu小鼠的急性HIV-1感染期間消除IFN-I誘導。用 15B或同種型對照（同種)抗體處理人源化小鼠。在pDC耗竭后，用HIV-R3A感染人源化小鼠并 在感染后8天(dpi)終止以供分析。（a)經FACS分析的在總人白細胞(⑶45+)中的pDC (⑶4+ CD123+)百分比的匯總數據。模擬物，=6;同種型+R3A，/3 =9;15B+R3A，=12。（13)模擬 物、HIV-1感染的和15B處理的小鼠的血漿IFNa2通過Luminex分析定量。模擬物，=3;同種 型+R3A，/3 =5;15B+R3A，/2 =5。（(：-(1)在得自小鼠脾的純化人細胞(CD45+)中的IFN-I和干擾 素刺激的基因的mRNA水平通過實時PCR測定。模擬物，=3;同種型+R3A，/3 =5;15B+R3A，/2 = 5。點圖中的所有條表示中值。誤差條表示標準偏差(SD)。*和**分別表示p〈0.05和p〈0.01。 [0023] 圖1 la-l le顯不pDC的預先-耗竭促進HIV-1復制。人源化小鼠在pDC耗竭后3天用 HIV-1感染并在8dpi (R3A，a-b)或感染后3周(JR-CSF，c-e)終止。（a)血漿HIV-1 RNA水平 (基因組拷貝# x logl0/ml)通過實時PCR分析。同種型+R3A，/3 =9;15B+R3A，/2 =12。（13)對 脾中p24陽性細胞的免疫組織化學染色。（c)在感染后3周，通過實時PCR分析血漿JR-CSF HIV-1 RNA水平(基因組拷貝# x logl0/ml)。同種型+JR-CSF，/3 =12;15B+JR-CSF，/3 =12。 (d)在感染后3周對脾中p24陽性⑶4 T細胞的代表性FACS圖。（e)相對p24+ T細胞的匯總 數據。同種型+JR-CSF，/3 =7;15B+JR-CSF，/3 =7。點圖中的條表示中值。*表示p〈0.05。
[0024] 圖12a-12d顯示在具有升高的HIV-1感染的pDC-耗竭小鼠中的升高的CD38+DR+CD8 T細胞。（a)代表性FACS圖顯示在8 dpi，在外周血和脾中，CD38和HLA-DR在由R3A感染誘導 的⑶8 T細胞中的表達。（b)對圖4a的匯總數據。（c)代表性FACS圖顯示在感染后3周由JR-CSF感染誘導的⑶8 T細胞激活。（d)對圖4c的匯總數據。模擬物，=6;同種型+R3A，/3 =9; 15B+R3A，=12。點圖中的所有條表示中值。*和林分別表示p〈0.05和p〈0.01。
[0025]圖13a_13b顯示⑶8 T細胞在脾中的激活和病毒載量之間的相關性。相關性用斯皮 爾曼非參數檢驗（Spearman nonparametric test)分析。同種型+R3A，/? =9; 15B+R3A，/?= 12。二乘相關系數(r)和P值被示出。
[0026] 圖14a_14e顯示pDC的預先-耗竭減少HIV-1免疫發病機制。人源化小鼠在pDC耗竭 后3天用HIV-R3A感染并在8 dpi終止。（a-c)在外周血和脾中的人T細胞或總白細胞的細胞 計數。（a) CD4 T細胞(CD3+CD8-)計數。（b) CD8 T細胞(CD3+CD4-CD8+)計數。（c)總人CD45 +白細胞計數。（d-e)代表性直方圖和匯總數據顯示在脾中死亡的CD4 T細胞、CD8 T細胞和 人CD45+細胞的百分比。模擬物，=6;同種型+R3A，/3 =9;15B+R3A，/2 =12。點圖中的所有條 表示中值。*和**分別表示P〈〇 ? 05和p〈0 ? 01。
[0027] 圖15a_15c顯示pDC的預先-耗竭減弱HIV-1發病機制。人源化小鼠在pDC耗竭后3天 用HIV-1感染并在感染后3周終止。（a-c)在外周血和脾中的人T細胞或總白細胞的細胞計 數。（a) CD4 T細胞（CD3+CD8-)計數。（b) CD8 T細胞(CD3+CD4-CD8+)計數。（c) huCD45+白 細胞計數。模擬物，=4;同種型+JR-CSF，/3 =8;15B+JR-CSF，/3 =7。點圖中的所有條表示中 值。*表示p〈〇.〇5。
[0028] 圖16a_16g顯示pDC的耗竭增加HIV-1復制，但減弱在慢性HIV-1感染期間HIV-1免 疫發病機制。HIV-1感染的人源化小鼠在感染后11周用15B處理并在感染后21周終止(模擬 物，=6;JR-CSF+PBS，/3 zlOdR-CSF+lSBir^^da)在每一時間點的血漿HIV-1 RNA水平 (基因組拷貝# x loglO/ml)通過實時PCR分析。（b)匯總數據顯示在脾中HIV p24陽性⑶4 T細胞(CD3+CD8-)的百分比。（c-e)在外周血和脾中的人T細胞或總CD45白細胞的細胞計 數。（c) CD4 T細胞（CD3+CD8-)計數。（d) CD8 T細胞（CD3+CD4-CD8+)計數。（e)人CD45+白 細胞計數。（f)對脾中人CD45+細胞的免疫組織化學染色。（g)匯總數據顯示脾中死亡的 ⑶4 T細胞、⑶8 T細胞和人⑶45+細胞的百分比（JR-CSF感染在21 wpi終止）。點圖中的條表 示中值。*和**分別表示P〈〇 ? 05和p〈0 ? 01。
[0029] 圖17a-17f顯示pDC的耗竭增加 HIV-1復制，但在慢性感染中減少I型IFN應答。HIV-1感染的人源化小鼠在感染后11周用15B開始處理并在感染后21周終止。（a)對于圖6b的代 表性FACS直方圖。（b)通過Luminex測定的、從模擬物(/3 =4)、JR-CSF+PBS (/3 =5)和JR-CSF + 15B (/3 =5)在感染后11周（前)或者在感染后21周（后）的血漿中生產IFN-aSjc-d)在得 自小鼠脾的純化人細胞(CD45+)中的IFN-I和干擾素刺激基因的mRNA水平通過實時PCR ( =5)測量。（e-f)終止時來自脾的純化人CD45+細胞(e)和CD8 T細胞(CD3+CD4-CD8+) (f)中 的相對ISG基因表達。點圖中的所有條表示中值。誤差條表示標準偏差(SD)。*和**分別表示 口〈0.05和？〈0.01。
[0030] 圖18顯示15B的重鏈的核苷酸序列（SEQ ID N0:1)和氨基酸序列（SEQ ID N0:2)。 [0031] 圖19顯示15B的輕鏈的核苷酸序列（SEQ ID N0:3)和氨基酸序列（SEQ ID N0:4)。 [0032] 圖20顯示在DKO-hu小鼠中由12B(也稱為125)介導的pDC的耗竭。
[0033] 圖21顯示12B的重鏈的核苷酸序列（SEQ ID N0:5)和氨基酸序列（SEQ ID N0:6)。 [0034] 圖22顯示12B的輕鏈的核苷酸序列（SEQ ID N0:7)和氨基酸序列（SEQ ID N0:8)。 [0035] 發明詳述 本發明現在將參照附圖更詳細地加以描述，其中示出本發明的優選的實施方案。然而， 本發明可以不同的形式體現且不應視為限于本文提出的實施方案。更確切的說，提供這些 實施方案以使本公開內容將是充分的和完整的，并將本發明的范圍完全地傳達至本領域技 術人員。
[0036]除非本文另外表示，可特別打算將在此描述的本發明的各個特征以任何組合使 用。此外，本發明還認為，在本發明的一些實施方案中，在此提出的任何特征或特征的組合 可被排除在外或省略。為舉例說明，如果本說明書陳述:一種復合物包含組分A、B和C，它具 體地是指A、B或C的任何一個，或其組合，可被省略和單獨或以任何組合的方式放棄。
[0037] 除非另外限定，本文所用的全部技術和科學術語具有本發明所屬領域技術人員通 常理解的相同意義。用于本發明的說明書的術語僅僅是為了描述具體實施方案的目的并不 打算限制本發明。
[0038] 核苷酸序列在此僅以單鏈，從左至右以5'至3'方向呈現，除非另外地特別指明。核 苷酸和氨基酸在此通過IUPAC-IUB生化命名委員會推薦的方式，或(對于氨基酸）用一個字 母的代碼，或者三個字母代碼來表示，二者均按照37 C.F.R. §1.822和已建立的用法。
[0039] 除了如另有說明外，本領域技術人員已知的標準方法可用于克隆基因、擴增和檢 測核酸等。這樣的技術是本領域技術人員已知的。見例如，Sambrook et a入，Molecular Cloning: A Laboratory Manual 第2版.(Cold Spring Harbor, NY, 1989)；Ausubel et al. Current Protocols in Molecular Biology (Green Publishing Associates, Inc. 和John Wiley & Sons, Inc.， New York)。
[0040] 對于參考文獻中提供的句子和/或段落有關的教導，本文引用的所有出版物、專利 申請、專利、專利出版物和其它參考文獻通過引用以其全文結合到本文中。
[0041 ] I ?定義 如本發bM說明書和所附權利要求書所用的，單數形式"一"、"一個"和"該"意欲還包 括復數形式，除非文中另外清楚地指明。
[0042] 同樣如本文所用的，"和/或"指和涵蓋一個或多個有關的所列項目的任何和所有 可能的組合，以及當以可供選擇的方式（"或"）解釋時則缺乏組合。
[0043] 如本文所用的術語"約"，當涉及到一個可測量的值如多肽、劑量、時間、溫度、酶促 活性或其它生物學活性等的量時，意欲涵蓋特定量的± 20%、± 10%、± 5%、± 1%、土 0.5%，或甚至± 0.1%的變化。
[0044] 連接詞"基本上由...組成"意指要求保護的范圍應被解釋為包括在權項中敘述的 特定材料或步驟，以及對本發明要求保護的"基本和新穎的特征沒有實質影響的那些材料 或步驟'見在re "erz, 537 F.2d 549，551-52，190 USPQ 461，463 (CCPA 1976)(在 原文中的重點）；也見MPEP § 2111.03。
[0045] 術語"基本上由...組成"（及語法變體），當應用于本發明的多核苷酸或多肽序列 時，意指由所列序列（如，SEQ ID N0)和在所列序列的5'和/或3'或N-末端和/或C-末端上的 總共10個或更少的（如，1、2、3、4、5、6、7、8、9,或10)個另外的核苷酸或氨基酸二者組成的多 核苷酸或多肽，以致多核苷酸或多肽的功能實質上沒有改變。總共10個或更少的另外的核 苷酸或氨基酸包括兩端上另外的核苷酸或氨基酸加在一起的總數。術語"實質上改變"，當 應用于本發明的多核苷酸時，指如與由所列序列組成的多核苷酸的表達水平比較，表達編 碼的多肽的能力增加或下降至少約50%或更多。術語"實質上改變"，當應用于本發明的多肽 時，指如與由所列序列組成的多肽活性比較，表位結合活性提高或下降至少約50%或更多。
[0046] 如本文所用的"有效的"量是提供所需效果的量。
[0047]如本文所用的"治療有效的"量是提供給受試者一些改善或益處的量。或者說，"治 療有效的"量是提供受試者的至少一種臨床癥狀的一些緩解、減輕或減少(如，在HIV感染的 情況下，病毒載量減少或免疫細胞增加)的量。本領域技術人員將意識到治療效果不必是完 全或治愈的，只要有一些益處提供給受試者。
[0048]所謂術語"治療"、"醫療"或"處理"，意指受試者的病癥的嚴重性減少或至少部分 地改善或改進和實現至少一種臨床癥狀的一些緩解、減輕或減少。
[0049]如本文所用的涉及pDC的術語"耗竭"，指在受試者或樣品中的pDC的數量的可測量 的減少。所述減少可以是至少約10%，如至少約20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、 96%、97%、98%、99%，或更多。在某些實施方案中，該術語指受試者或樣品中的pDC的數量下降 至低于可檢出限度的量。
[0050] 如本文所用的短語"與pDC有關的病癥"，指其中pDC在疾病、病癥或病況的病因、副 作用、癥狀或其它方面起作用的任何疾病、病癥或病況。這樣的病癥的實例包括(不限于)感 染性疾病、自身免疫性病癥和癌癥。
[0051] 如本文所用的術語"感染性疾病"，指任何與感染性病原體感染有關的疾病。感染 性病原體的實例包括(不限于)病毒和微生物。病毒包括(不限于)肝脫氧核糖核酸病毒科， 包括肝炎4、13、0、0、￡、？、6等;黃病毒科，包括人丙型肝炎病毒(11(^)、黃熱病病毒和登革熱病 毒;逆轉錄病毒科，包括人免疫缺陷病毒(HIV)和人嗜T淋巴細胞性病毒(HTLV1和HTLV2);皰 疹病毒科，包括單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)、愛潑斯坦巴爾病毒(Epstein Barr virus) (EBV)、巨細胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒(VZV)、人類皰疹病毒6 (HHV-6)、人類皰疹病毒8 (冊7_8)，和13皰疹病毒;乳多空病毒科(？3卩0￥3￥；[1^(136)，包括人乳頭瘤病毒;彈狀病毒科， 包括狂犬病毒;副粘病毒科，包括呼吸道合胞病毒;呼腸孤病毒科(Reoviridae)，包括輪狀 病毒;布尼亞病毒科(Bunyaviridae)，包括漢坦病毒;纖絲病毒科(Filoviridae)，包括埃博 拉病毒;腺病毒科;細小病毒科，包括細小病毒B -19;沙粒病毒科(Arenaviridae)，包括拉沙 病毒;正粘病毒科，包括流感病毒;痘病毒科(卩(《￥；[1^(136)，包括羊痘病毒(0奸￥；[1'118)、傳 染性軟疏病毒（molluscum contageosum virus)、天花病毒和猴痘病毒；披膜病毒科 (Togaviridae)，包括委內瑞拉馬腦炎病毒;冠狀病毒科(Coronaviridae)，括冠狀病毒如嚴 重急性呼吸綜合征(SARS)病毒;和小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)，包括脊髓灰質炎 病毒;鼻病毒;環狀病毒(orbiviruses);極小DNA病毒(Picodnavirusess);腦心肌炎病毒 (EMV);副流感病毒、腺病毒、柯薩奇病毒、埃可病毒、麻疹病毒、風疹病毒、人乳頭瘤病毒、犬 痕熱病毒（Canine distemper virus)、犬傳染性肝炎病毒、貓萼狀病毒（Feline calicivirus)、貓鼻氣管炎病毒(Feline rhinotracheitis virus)、TGE病毒(豬）、口蹄疫 病毒、猿猴病毒5、人副流感病毒2型、人metapneuomovirus、腸病毒，和任何其它現在已知的 或后來鑒定的致病病毒(見，如，Kiroiogy, Fields et al.，Eds?，第3版， Lippincott-Raven, New York, 1996,其對致病病毒的講述的全部內容通過引用結合到本 文中）。
[0052]致病的微生物包括，但不限于，立克次氏體、衣原體、分枝桿菌、梭菌屬、棒狀桿菌、 支原體、脲原體、軍團菌、志賀氏菌、沙門氏菌、致病性大腸桿菌(i?scAericAia co^i)菌株、 博德特氏菌(Bordate 1 la )、奈瑟氏菌、密螺旋體、桿菌屬、嗜血桿菌屬、莫拉氏菌、弧菌屬、葡 萄球菌（Staphylococcus spp.)、鏈球菌（Streptococcus spp.)、彎曲菌（Campylobacter spp ?)、伯氏疏螺旋體（Borrelia spp ?)、鉤端螺旋體（Leptospira spp ?)、埃里希體 (Erlichia spp.)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella spp.)、假單抱菌(Pseudomonas spp.)、螺桿 菌(Helicobacter spp.)，和任何其它現在已知的或后來鑒定的致病性微生物（見，例如 Microbiology, Davis et al, Eds?，第4版，Lippincott, New York, 1990,其對致病性 微生物的講述的全部內容通過引用結合到本文中）。微生物的具體實例包括，但不限于，幽 門螺桿菌j〇7_/ori)、肺炎衣原體（GWaffjc/ia jOflet/zmoiae)、沙眼衣原體 (tis)、解脈脈原體（￡/_reaj〇_/as_ffla 、肺炎支原體 (#7。0/7_/35細/7/36腫0/3〗36)、金黃色葡萄球菌（5'(3/^7_/〇。0(^^/5 3^/1'6^/5)、化胺性鏈球菌 {Streptococcus pyogenes) ( Streptococcus pneumoniae) |Sf (5rt_reJotococct/s ri_ric/a/3s)、奠腸球菌（i?/3 te_rococct/s faeca^/is)、腦膜炎奈瑟氏菌 (7Veisse_ria tic/is)、奈瑟氏淋球菌（7Veisse_ria go/3〇_rrAoeae)、梅毒螺旋體 (Treponema pallidum)、炭'皰jff 舊（Bacillus anthracis)、傷寒妙 \飛氏Jff 舊（Salmonella tjpAi)、霍亂弧菌（Ki/?rio cAo_/era)、鼠疫巴氏桿菌(Pastet/reDa jOestis)(鼠疫耶爾森 氏菌（Fei-siflia j〇es tis))、銅綠假單胞菌（Pset/c/offoflas ae_rt/《i/3〇sa)、空腸彎曲菌 (Cafflp7_/o/?acte_r JejYmi)、艱難梭狀芽抱桿菌（C7ost_ric/i? c/i/fici_/e)、肉毒梭狀芽抱梭 菌（C7ostric/i? 、結核分枝桿菌(ifyco/?acteri? tt//?erct/_/osis)、伯氏疏螺旋 體（i?o_rre_/ia /7t/_rgc/o_rfe_ri)、杜氏嗜血桿菌（//aafflOjoAi^/t/s c/t/creji)、白喉棒狀桿菌 (Coiy/3e/7acte_ri? c/ijoA tAe_ria)、百日咳博德特氏菌（j9o_rc/ete_/_/a j〇e_rtt/ssis)、副百日咳 博德特氏菌（5o_rc/e j〇a_raj〇e_rtt/ssis)、氣管敗血性博德特氏菌（5o_rc/e /7_ro/3cAisej〇 tica)、流感嗜血桿菌（//ae_ffl〇j〇Ai_/t/s ifl/7t/e/3za)和腸毒素大腸桿菌 (enterotoxic Escherichia coif)。
[0053] 如本文所用的術語"自身免疫性病癥"，指與自身免疫性反應有關的任何病癥。實 例包括(不限于）多發性硬化、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、狼瘡，炎癥性腸綜合征和腸易激 綜合征。
[0054] 如本文所用的術語"癌癥"，指細胞的任何良性或惡性異常生長。實例包括（不限 于)乳腺癌、前列腺癌、淋巴瘤、皮膚癌、胰腺癌、結腸癌、黑素瘤、惡性黑素瘤、卵巢癌、腦癌、 原發性腦癌、頭-頸癌、神經膠質瘤、膠質母細胞瘤、肝癌、膀胱癌、非-小細胞肺癌、頭或頸 癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、小細胞肺癌、維爾姆斯瘤、宮頸癌、睪丸癌、膀胱癌、胰腺癌、胃癌、 結腸癌、前列腺癌、泌尿生殖系統癌、甲狀腺癌、食管癌、骨髓瘤、多發性骨髓瘤、腎上腺癌， 腎細胞癌、子宮內膜癌、腎上腺皮質癌、惡性胰島細胞瘤、惡性類癌瘤、絨毛膜癌、蕈樣肉芽 月中、惡性高鈣血癥、頸椎增生、白血病、急性淋巴細胞性白血病、慢性淋巴細胞性白血病、急 性髓細胞性白血病、慢性髓細胞性白血病、慢性粒細胞性白血病、急性粒細胞性白血病、毛 細胞白血病、神經母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、卡波濟氏肉瘤、真性紅細胞增多癥(polycythemia vera)、原發性血小板增多癥(essential thrombocytosis)、何杰金氏病、非-何杰金氏淋巴 瘤、軟-組織肉瘤、骨原性肉瘤、原發性巨球蛋白血癥和視網膜母細胞瘤。在一些實施方案 中，癌癥選自腫瘤形成的癌癥。
[0055]如本文所用的，"核酸"、"核苷酸序列"和"多核苷酸〃可互換使用并涵蓋RNA和DNA 二者，包括cDNA、基因組DNA、mRNA、合成（如，化學合成）DNA或RNA和RNA和DNA的嵌合體。術 語多核苷酸、核苷酸序列，或核酸指核苷酸鏈而不考慮鏈的長度。
[0056]術語"分離的"可指基本上不含細胞材料、病毒材料和/或培養基（當通過重組DNA 技術生產時），或化學前體或其它化學物質（當化學合成時）的核酸、核苷酸序列或多肽。此 外，"分離的片段"是核酸、核苷酸序列或多肽的片段，其作為片段不是天然存在的且將不以 自然狀態被發現。"分離的"并不意味著制劑是技術純的（均質的），但它足夠純到可以其中 用于預定目的的形式提供多肽或核酸。
[0057]術語"片段"，當應用于多核苷酸時，將被理解為意指相對于參照核酸或核苷酸序 列減少了長度的核苷酸序列并包含與參照核酸或核苷酸序列相同或幾乎相同（如，90%、 92%、95%、98%、99%相同）的連續核苷酸的核苷酸序列，基本上由它們組成，和/或由它們組 成。在適當時，根據本發明的這樣的核酸片段可被包括在其為一個組成部分的較大多核苷 酸中。在一些實施方案中，這樣的片段可包含寡核苷酸，基本由寡核苷酸組成，和/或由寡核 苷酸組成，所述寡核苷酸具有根據本發明的核酸或核苷酸序列的至少約8、10、12、15、20、 25、30、35、40、45、50、75、100、150、200，或更多個連續的核苷酸的長度。
[0058]術語"片段〃，當應用于多肽時，將被理解為意指相對于參照多肽或氨基酸序列減 少了長度的氨基酸序列并包含與參照多肽或氨基酸序列相同或幾乎相同（如，90%、92%、 95%、98%、99%相同）的連續的氨基酸的氨基酸序列，基本上由它們組成，和/或由它們組成。 在適當時，根據本發明的這樣的多肽片段可被包括在其為一個組成部分的較大多肽中。在 一些實施方案中，這樣的片段可包含肽，基本由肽組成，和/或由肽組成，所述肽具有根據本 發明的多肽或氨基酸序列的至少約4、6、8、10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、150、 200,或更多個連續的氨基酸的長度。
[0059] 如本文所用的，術語"蛋白"和"多肽"可互換使用并涵蓋肽和蛋白二者，除非另外 指明。
[0060] "融合蛋白"是當編碼兩個(或更多個)在自然界未發現融合在一起的不同多肽的 兩個異源核苷酸序列或其片段，在正確的翻譯閱讀框內融合在一起所產生的多肽。示例性 的融合多肽包括本發明的多肽(或其片段)與谷胱甘肽-s-轉移酶、麥芽糖-結合蛋白或報道 基因蛋白（如，綠熒光蛋白、葡萄糖醛酸酶、半乳糖苷酶、熒光素酶等）、血凝素、c-my C、 FLAG表位等的全部或部分的融合物。
[0061] 如本文所用的，"功能"多肽或"功能片段"是基本上保留通常地與該多肽有關的至 少一種生物學活性（如，靶蛋白結合）的多肽或片段。在特定的實施方案中，"功能"多肽或 "功能片段"基本上保留未修飾肽具有的所有活性。所謂"基本上保留"生物學活性，其意是 指該多肽保留天然多肽的至少約 20%、30%、40%、50%、60%、75%、85%、90%、95%、97%、98%、99%， 或更高的生物學活性(并可甚至具有比天然多肽更高水平的活性）。"非-功能"多肽是顯示 出很少或基本上沒有可檢測的通常與該多肽有關(如，最多只有一個微不足道的數量，例如 少于約10%或甚至5%)的生物學活性的多肽。生物學活性例如蛋白結合可使用本領域熟知的 和如本文描述的分析來測定。
[0062] II.抗體和組合物 本發明人已鑒定和表征特異性地結合于m)CA2并耗竭pDC的抗體。這樣的抗體可有利地 用來在受試者中耗竭PDC，例如研究或治療目的。這樣的抗體可被用來治療與pDC有關的病 癥。因此，本發明的一個方面涉及當給予受試者時特異性地結合于BDCA2并耗竭pDC的抗體 或其片段。
[0063]如本文所用的術語"抗體(antibody)"或"抗體(antibodies)"指所有類型的免疫 球蛋白，包括186、1811、184、18〇和以￡。抗體可以是單克隆或多克隆的并可具有任何物種來 源，包括（例如）小鼠、大鼠、兔、馬、山羊、綿羊、駱駝，或人，或可以是嵌合抗體。見例如， Walker et al., Molec. Immunol. 26:4：03 (1989)。所述抗體可以是根據在美國專利號4， 474,893或美國專利號4,816,567中公開的方法產生的重組單克隆抗體。所述抗體也可根據 在美國專利號4，676，980中公開的方法經化學構成。
[0064]包括在本發明范圍內的抗體片段包括，例如，Fab、Fab '、F(ab '）2，和Fv片段;域抗 體、雙抗體;vaccibodies、線性抗體;單鏈抗體分子;和從抗體片段形成的多特異性抗體。這 樣的片段可通過已知技術生產。例如，F(ab〇 2片段可通過抗體分子的胃蛋白酶消化生產， 和Fab片段可通過還原F(al〇2片段的二硫鍵生成。或者，可構建Fab表達庫以允許快速和容 易地鑒定具有所需特異性的單克隆Fab片段(Huse eta人，(1989))。
[0065] 本發明的抗體可被改變或進行突變以與其中產生抗體的物種不同的物種相容。例 如，抗體可被人源化或駱駝化。非-人(如，鼠科動物)抗體的人源化形式是嵌合免疫球蛋白、 免疫球蛋白鏈或其片段(如?？{ &13、？&13'、？(&13'）2或抗體的其它抗原-結合子序列），其含有 源自非-人免疫球蛋白的最小序列。人源化抗體包括人免疫球蛋白（受體抗體），其中來自受 體的互補決定區（CDR)的殘基被來自非-人物種(供體抗體)如小鼠、大鼠或兔的CDR的具有 所需的特異性、親和力和能力的殘基替代。在一些情況下，人免疫球蛋白的Fv構架殘基被相 應的非-人殘基替代。人源化抗體也可包含既未在受體抗體中也未在輸入CDR或構架序列中 發現的殘基。一般來說，人源化抗體將基本都包含至少一個，且典型地兩個可變域，其中所 有或基本上所有的CDR區對應于非-人免疫球蛋白的那些和所有或基本上所有的構架(FR) 區（即，CDR區之間的序列）是人免疫球蛋白共有序列的那些。人源化抗體任選地還包含至少 一部分的免疫球蛋白恒定區(Fc)，典型地人免疫球蛋白的恒定區（Jones eta^.，jVature (1986);Riechmann et a_/.，7Vatt/_re,幻J?:323 (1988);和Presta, Ct/_rr. Qo. Struct. Biol. 2:593 (1992))〇
[0066] 用于人源化非-人抗體的方法是本領域熟知的。一般來說，人源化抗體具有從非-人來源引入其中的一個或多個氨基酸殘基。這些非-人氨基酸殘基通常被稱為"輸入"殘基， 其典型地取自"輸入"可變域。人源化可基本上按照Winter及其同事的方法(Jones et a入， Nature 321:522 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)；Verhoeyen et aL，^5A1534 (1988))，通過用嚙齒動物⑶Rs或⑶R序列取代人抗體的相應的序 列進行。因此，這樣的"人源化"抗體是嵌合抗體(美國專利號4,816,567)，其中基本上少于 完整的人可變域已被來自非-人物種的相應序列取代。在實踐中，人源化抗體典型地為人抗 體，其中一些CDR殘基(如，CDRs全部或其部分)和可能的一些FR殘基被來自嚙齒動物抗體的 類似部位的殘基取代。
[0067]人抗體也可使用本領域已知的各種技術，包括噬菌體展示庫制備（Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol. 227\?>Sl (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol. 222\hSl (1991))。0〇16等和13〇61'1161'等的技術也可用來制備人單克隆抗體（(]〇16 6(32.， Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)和Boerner eta入，iM臟〇入#7:86 (1991))。類似地，人抗體可通過將人免疫球蛋白基因座引 入轉基因動物，如小鼠中來制備，其中內源性免疫球蛋白基因已被部分地或完全失活。在攻 擊時，觀察到人抗體生產，這在所有方面，包括基因重排、裝配和抗體所有組成成分，都與在 人類中見到的都非常相似。這種方法例如，在美國專利號5，545，807 ; 5，545，806; 5，569， 825;5,625,126;5,633,425;5,661,016中，和在以下科學出版物中有描述:Marks et a入， Bio/Technology 10:779 (1992)；Lonberg et al., Nature 368:856 (1994)；Morrison, Nature 368:812 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnol. 74:845 (1996)； Neuberger, Nature Biotechnol. 14:826 (1996);Lonberg和Huszar， Intern? Rev. Immunol. 65 (1995)。
[0068] 用來進行本發明的多克隆抗體可按照已知程序，通過用靶標的單克隆抗體結合的 抗原免疫合適的動物(如，兔、山羊等），收集來自動物的免疫血清，并從免疫血清分離多克 隆抗體來生產。BDCA2的多核苷酸序列和多肽序列是本領域已知的并可在序列數據庫如 GenBank中發現。序列的實例包括人BDCA2多肽序列（索取號Q8WTT0)和多核苷酸序列（索取 號AF293615)，通過引用以其全文結合到本文中。
[0069] 用來進行本發明的單克隆抗體可根據Kohler和Mi 1 stein，TVa 495 (1975)的技術，在雜交瘤細胞系中生產。例如，可將含有適當的抗原的溶液注射到小鼠中， 并在足夠的時間后，殺死小鼠并獲得脾細胞。然后典型地在聚乙二醇的存在下，脾細胞通過 使它們與骨髓瘤細胞或與淋巴瘤細胞融合而永生化，以產生雜交瘤細胞。然后使雜交瘤細 胞在合適的培養基中生長并對上清液篩選具有所需特異性的單克隆抗體。單克隆Fab片段 可通過本領域技術人員已知的重組技術，在大腸桿菌（i?. CcJi)中生產。見，例如Huse， Science246\l21^ (1989)〇
[0070] 對靶多肽特異性的抗體也可通過本領域已知的噬菌體展示技術獲得。
[0071] 各種免疫分析可用來篩選以鑒定對BDCA2具有所需特異性的抗體。使用具有確立 的特異性的多克隆抗體或者單克隆抗體的競爭性結合或免疫放射分析的許多方案是本領 域熟知的。這樣的免疫測定典型地涉及在抗原及其特異性抗體之間的復合物形成(例如，抗 原/抗體復合物形成）的測量。可使用利用對本發明的多肽或肽上的兩個非-干擾性表位有 反應的單克隆抗體的雙-位點、基于單克隆的免疫分析以及競爭性結合分析。
[0072]按照已知技術，抗體可被結合到固體載體（如，從材料如乳膠或聚苯乙烯形成的 珠、板、片或孔）。按照已知技術，抗體也可結合到可檢測的基團如放射性標記物（如，35s、 1251、 1311)、酶標記物(如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶），和熒光標記物(如，熒光素）。以本 發明的方法形成抗體/抗原復合物的測定可通過檢測，例如沉淀、凝集、絮凝、放射性、色彩 顯影或變化、熒光、發光等，如為本領域熟知的。
[0073]在一個實施方案中，抗體是特異性地結合BDCA2的抗體或其片段（如，單克隆抗 體）。抗體可結合于BDCA2上的特異性表位。
[0074] 在一個實施方案中，抗體是由雜交瘤細胞系15B (ATCC保藏號_________________________________)生產 的單克隆抗體。在進一步的實施方案中，抗體是競爭結合于由雜交瘤細胞系15B生產的單克 隆抗體特異性地結合的相同表位的單克隆抗體或其片段。在另一個實施方案中，所述抗體 是特異性地結合由雜交瘤細胞系15B生產的單克隆抗體特異性地結合的相同表位的單克隆 抗體或其片段。由雜交瘤細胞系1 5 B生產的抗體結合的表位包含氨基酸序列 IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR (SEQ ID N0:9)或其至少5個連續氨基酸，如至少5、6、7、8、9、10、 11、12、13、14,或15或更多個連續的氨基酸的片段，基本上由它們組成，或由它們組成。
[0075] 在某些實施方案中，單克隆抗體或其片段是嵌合抗體或人源化抗體。在另外的實 施方案中，嵌合或人源化抗體包含至少一部分由雜交瘤細胞系15B生產的單克隆抗體的 CDRs。如本文所用的，CDR的"部分"被定義為來自組成CDRs (如，從1至6個CDRs)的每一個輕 鏈和重鏈的3個環（loops)中的一個或多個或包含至少3個連續的氨基酸，基本上由它們組 成，或由它們組成的環的一個或多個部分。例如，嵌合或人源化抗體可包含1、2、3、4、5或6個 ⑶R環，1、2、3、4、5或6個⑶R環的部分，或其按任何組合的混合物。
[0076]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0: 2的氨基酸序列或與 其至少90%相同，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的重鏈可變區。在另一個實施 方案中，所述抗體或其片段包含含有由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列或與其至少90%相同的序 列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼的氨基酸序列的重鏈可變區。在一些 實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0: 2的氨基酸序列的至少50個連續的氨 基酸或與其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200個或更多個連續的氨基酸的重鏈 可變區。
[0077]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與 其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的輕鏈可變區。在另一 個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有由SEQ ID N0:3的核苷酸序列或與其至少90%相 同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼的氨基酸序列的輕鏈可變區。 在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:4的氨基酸序列的至少50個連 續的氨基酸或與其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多個連續的氨基酸的 輕鏈可變區。
[0078]在一個實施方案中，抗體或其片段包含含有SEQ ID N0: 2的氨基酸序列或與其至 少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由SEQ ID N0:1的核苷 酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼的重 鏈可變區，和含有SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、 96、97、98或99%相同的序列，或由SEQ ID N0:3的核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例 如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼的輕鏈可變區。在一些實施方案中，抗體或 其片段包含包含SEQ ID N0: 2的氨基酸序列的至少50個連續的氨基酸或與其至少90%相同 的序列，例如至少100、150或200或更多個連續的氨基酸的重鏈可變區，和包含SEQ ID N0:4 的氨基酸序列的至少50個連續的氨基酸或與其至少90%相同的序列，例如至少100、150或 200或更多個連續的氨基酸的輕鏈可變區。
[0079]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有來自SEQ ID N0: 2的氨基酸序列 或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一個^尺 (如1、2或3個)或其部分的重鏈可變區。在另一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有 來自由SEQ ID N0:1的核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98 或99%相同的序列編碼的氨基酸序列的至少一個CDR (如1、2或3個)或其部分的重鏈可變 區。本領域技術人員理解，CDRs在結合特異性方面起著重要的作用且序列取代(如，用于小 鼠抗體的人源化)優選地在CDRs外部進行，而最小改變在CDRs內部進行。因此，在一些實施 方案中，與公開的序列至少90%相同的序列不包含對CDRs的變化或僅有最小數目的改變。 [0080]在一個實施方案中，抗體或其片段包含含有來自SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與 其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一個⑶R (如， 1、2或3個)或其部分的輕鏈可變區。在另一個實施方案中，抗體或其片段包含含有由來自 SEQ ID勵:3的核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相 同的序列編碼的氨基酸序列的至少一個CDR (如，1、2或3個)或其部分的輕鏈可變區。
[00811在一個實施方案中，抗體或其片段包含含有來自SEQ ID N0: 2的氨基酸序列或與 其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由SEQ ID N0:1的 核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼 的至少一個⑶R (如，1、2或3個)的重鏈可變區，和含有來自SEQ ID N0:4的氨基酸序列或與 其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡010勵:3的 核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼 的至少一個⑶R (例如1、2、或3個)的輕鏈可變區。
[0082]在一個實施方案中，所述抗體是由雜交瘤細胞系12B (先前稱為125) (ATCC保藏 號 ________________________________J生產的單克隆抗體。在進一步的實施方案中，抗體是單克隆抗體或其片 段，其競爭性結合于由雜交瘤細胞系12B生產的單克隆抗體特異性地結合的相同表位。在另 一個實施方案中，抗體是單克隆抗體或其片段，其特異性地結合于由雜交瘤細胞系12B生產 的單克隆抗體特異性地結合的相同表位。在某些實施方案中，單克隆抗體或其片段是嵌合 抗體或人源化抗體。在另外的實施方案中，嵌合或人源化抗體包含至少一部分由雜交瘤細 胞系12B生產的單克隆抗體的CDRs。
[0083]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與 其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的重鏈可變區。在另一 個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有由SEQ ID N0:5的核苷酸序列或與其至少90%相 同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼的氨基酸序列的重鏈可變區。 在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列的至少50個連 續的氨基酸或與其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多個連續的氨基酸的 重鏈可變區。
[0084]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與 其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的輕鏈可變區。在另一 個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有由SEQ ID N0:7的核苷酸序列或與其至少90%相 同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼的氨基酸序列的輕鏈可變區。 在一些實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的至少50個連 續的氨基酸或與其至少90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多個連續的氨基酸的 輕鏈可變區。
[0085]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基酸序列或與 其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵:5的 核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼 的重鏈可變區，和含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至 少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵:7的核苷酸序列或與其至少90%相同的序 列，例如其至少95、96、97、98或99%相同的序列編碼的輕鏈可變區。在一些實施方案中，所述 抗體或其片段包含含有SEQ ID N0: 6的氨基酸序列的至少50個連續的氨基酸或與其至少 90%相同的序列，例如至少100、150或200或更多連續的氨基酸的重鏈可變區，和含有SEQ ID N0:8的氨基酸序列的至少50個連續的氨基酸或與其至少90%相同的序列，例如至少100、150 或200或更多個連續的氨基酸的輕鏈可變區。
[0086]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有來自SEQ ID N0:6的氨基酸序列 或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一個^尺 (例如，1、2或3個)或其部分的重鏈可變區。在另一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含 有來自由SEQ ID N0:5的核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、 98或99%相同的序列編碼的氨基酸序列的至少一個⑶R (例如，1、2或3個)或其部分的重鏈 可變區。本領域技術人員理解，CDRs在結合特異性方面起著重要的作用，并且序列取代(例 如，用于小鼠抗體的人源化)優選地在CDRs外部進行，而最小改變在CDRs內部進行。因此，在 一些實施方案中，與公開的序列至少90%相同的序列不包含對CDRs的變化或僅有最小數目 的改變。
[0087]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有來自SEQ ID N0:8的氨基酸序列 或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列的至少一個^尺 (例如，1、2或3個)或其部分的輕鏈可變區。在另一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含 有來自由SEQ ID N0:7的核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、 98或99%相同的序列編碼的氨基酸序列的至少一個CDR (例如，1、2或3個)或其部分的輕鏈 可變區。
[0088]在一個實施方案中，所述抗體或其片段包含含有來自SEQ ID N0:6的氨基酸序列 或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵： 5的核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編 碼的至少一個⑶R (例如，1、2或3個）的重鏈可變區，和含有來自SEQ ID N0:8的氨基酸序列 或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列，或由3￡〇10勵： 7的核苷酸序列或與其至少90%相同的序列，例如與其至少95、96、97、98或99%相同的序列編 碼的至少一個⑶R (例如，1、2或3個)的輕鏈可變區。
[0089] 作為進一步的方面，本發明提供包含本發明的所述抗體或其片段的組合物。在一 些實施方案中，所述組合物是包含在藥學上可接受的載體中的本發明抗體的藥物制劑。
[0090] 所謂"藥學上可接受的"，其意指在生物學上或其它方面并非不合需要的物質，即， 所述物質可給予受試者而不引起任何不合需要的生物學作用如毒性。
[0091 ]本發明的制劑可任選地包含藥物、藥劑、載體、輔助劑、分散劑、稀釋劑等。
[0092]本發明的化合物可按照已知技術，以藥用載體配制給予。見例如，Remington，藥物 科學和實踐（5fcie/3ce a/3c/ Practice o/PAaiwacj)(第9版.1995)。在根據本發明的藥物 制劑的生產中，化合物(包括其生理學可接受的鹽)典型地與特別是可接受的載體混合。載 體可以是固體或液體，或二者，并優選地用所述化合物配制為單位劑量制劑，例如，片劑，其 可含有從〇. 01或〇. 5%至95%或99%重量的化合物。一種或多種化合物可摻入本發明的制劑 中，所述制劑可通過任何熟知的配藥技術制備。
[0093]本發明的制劑包括適合于口服、直腸、局部、含服(如，舌下）、陰道、胃腸外（如，皮 下、肌內包括骨骼肌、心肌、膈肌和平滑肌、皮內、靜脈內、腹膜內）、局部（即，皮膚和粘膜表 面二者，包括氣道表面）、鼻內、經皮、關節內、鞘內，和吸入給藥，經肝門內遞送給藥至肝，以 及直接器官注射(如，進入肝，進入腦供遞送至中樞神經系統，進入胰，或進入腫瘤或腫瘤周 圍組織）的那些制劑。最合適的途徑在任何給定的情況下將取決于待治療的病癥的性質和 嚴重性以及取決于所用具體化合物的性質。
[0094] 對于注射，載體將典型地是一種液體，如無菌無熱原水、無熱原磷酸鹽-緩沖鹽水 溶液、抑菌水，或CremophorEL[R] (BASF, Parsippany, N.J.)。對于其它給藥方法，載體 可以是固體或者液體。
[0095] 對于口服給藥，所述化合物可以固體劑型，如膠囊、片劑，和散劑，或以液體劑型， 如酏劑、糖漿劑，和混懸劑給予。化合物可與無活性的成分和粉末狀載體，如葡萄糖、乳糖、 蔗糖、甘露醇、淀粉、纖維素或纖維素衍生物、硬脂酸鎂、硬脂酸、糖精鈉、滑石、碳酸鎂等一 起封裝在明膠膠囊中。可加入以提供所需顏色、味道、穩定性、緩沖能力、分散或其它已知所 需特征的另外的無活性成分的實例是氧化鐵紅、硅膠、十二烷基硫酸鈉、二氧化鈦、食用白 墨水等。類似的稀釋劑可被用來制備壓制片劑。片劑和膠囊二者可被制備為緩釋產品，以提 供藥物在數小時的時間段內的連續釋放。壓制片劑可以是糖包衣或薄膜包衣的，以掩蔽任 何不愉快的味道并保護片劑以隔絕大氣，或腸溶包衣以在胃腸道中選擇性崩解。用于口服 給藥的液體劑型可含有著色劑和矯味劑以增加患者的接受度。
[0096] 適合于含服(舌下)給藥的制劑包括含有在矯味基質，通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃 蓍膠中的化合物的糖錠劑(lozenges);和含有在惰性基質如明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯膠 中的化合物的含片(pastilles)。
[0097]適合于胃腸外給藥的制劑包含所述化合物的無菌水性和非-水性注射溶液，其制 劑優選地與計劃的接受者的血等滲。這些制劑可含有抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑和使制劑與 計劃的接受者的血等滲的溶質。水性和非-水性無菌懸浮液可包含助懸劑和增稠劑。所述制 劑可以單位\劑量或多-劑量容器，例如密封的安瓿和小瓶存在，并可在冷凍干燥(凍干)條 件下貯存，僅僅需要在臨用前即刻加入無菌液體載體，例如，鹽水或注射用水。
[0098] 即用注射溶液和懸浮液可從前述種類的無菌粉末、顆粒和片劑制備。例如，在本發 明的一方面，提供一種可注射的、穩定的、無菌組合物，其包含在密封的容器中的單位劑型 的本發明的化合物。所述化合物或鹽以一種凍干物的形式提供，其能夠用合適的藥學上可 接受的載體重新構成，以形成其適合于注射給受試者的液體組合物。單位劑型典型地包含 從約10 mg至約10克的化合物或鹽。當化合物或鹽基本上為水不溶性時，可以足夠的量使用 足量的為藥學上可接受的乳化劑，以在水性載體中乳化化合物或鹽。一種這樣的有用的乳 化劑是磷脂酰膽堿。
[0099] 適合于直腸給藥的制劑優選地作為單位劑量栓劑存在。這些可通過使所述化合物 與一種或多種常規固體載體，例如，可可酯混合，然后使產生的混合物成型來制備。
[0100]適合于局部應用于皮膚的制劑優選地采用軟膏劑、霜劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧 劑、氣溶膠或油劑的形式。可使用的載體包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、醇、透皮促進劑及 其兩種或更多種的組合。
[0101]適合于透皮給藥的制劑可作為適合于與接受者的表皮保持密切接觸一段延長的 時間的離散貼片存在。適合于透皮給藥的制劑也可通過離子電滲療法遞送(見，例如，Tyle， PAarffi. Ttes. 1318 (1986))并典型地采取化合物的任選的緩沖水性溶液的形式。合適的制 劑包含檸檬酸鹽或bis/tris緩沖液(pH 6)或乙醇/水并含有從0.1至0.2M的化合物。
[0102]備選地，所述化合物可配制為鼻腔給藥，或者以其它方式，通過任何合適的手段給 予受試者的肺，例如通過受試者吸入含有化合物的可吸入顆粒的氣溶膠懸浮液給予。可吸 入顆粒可以是液體或固體。術語"氣溶膠"包括任何氣載懸浮相，其能夠被吸入到細支氣管 或鼻道中。特異性地，氣溶膠包括液滴的氣載懸浮液，如可在計量劑量吸入器或霧化器，或 在液霧噴霧器中產生的。氣溶膠也包括懸浮于空氣或其它載氣中的干粉組合物，例如，其可 通過從吸入器裝置吹入遞送。見Ganderton & Jones,遞送至呼吸道的藥物（Drug Delivery to the Respiratory Tract) Ellis Horwood (1987) ;Gonda (1990)治療藥物 載體系統中的重要評論（Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems) 6: 273-313;和Raeburn et a_/.，J. Pharmacol. Toxicol. Meth. 27:143 (1992)。含有化合 物的液體顆粒的氣溶膠可通過任何合適的手段，如用壓力驅動氣溶膠霧化器或超聲波霧化 器生產，如本領域技術人員已知的。見例如美國專利號4,501，729。含有所述化合物的固體 顆粒的氣溶膠同樣可通過制藥領域已知的技術，用任何固體顆粒藥物氣溶膠發生器產生。
[0103] 或者，人們可以局部方式，而非系統方式，例如，以貯庫或緩釋制劑給予化合物。
[0104] 本發明的進一步的方面涉及用于本發明的方法的藥劑盒。所述藥劑盒可以適合于 給予受試者或以適合于配制成制劑的形式包含本發明的抗體。所述藥劑盒還可包含其它組 分，如治療劑、載體、緩沖劑、容器、給藥裝置等。所述藥劑盒可被設計為治療應用、診斷應 用，和/或研究應用，且另外的組分可以是適合于預定應用的那些。所述藥劑盒還可包含標 簽和/或使用說明書，例如用于病癥的治療。這樣的標簽和/或使用說明書可包括，例如，有 關抗體給藥的量、頻率和方法的信息。
[0105] III ?方法 作為一個方面，本發明提供在受試者中耗竭PDC的方法，其包括遞送給受試者有效量的 特異性地結合BDCA2并耗竭pDC的抗體或其片段，從而耗竭pDC。在一些實施方案中，相對于 沒有接收抗體或其片段的受試者，pDC被耗竭至少約50%，例如至少60%、70%、80%、90%、95%、 96%、97%、98%，或99%或更多。在其它實施方案中，本發明提供在離體或體內樣品，例如混合 的細胞群中減少PDC的數量和/或耗竭pDC的方法，其包括遞送給樣品有效量的特異性地結 合BDCA2并且減少pDC的數量和/或耗竭pDC的抗體或其片段，從而減少pDC的數量和/或耗竭 pDC〇
[0106] 在進一步的方面，本發明提供在受試者中治療與pDC有關的病癥的方法，其包括遞 送給受試者治療有效的特異性地結合BDCA2并且減少pDC的數量和/或耗竭pDC的抗體或其 片段，從而治療所述病癥。
[0107] 在一些實施方案中，受試者是研究受試者，例如實驗動物。在其它實施方案中，受 試者是已被診斷為患有與pDC有關的病癥的受試者。在另一個實施方案中，受試者可以是處 于發生與pDC有關的病癥（例如，由于遺傳因素，暴露于病原，異常免疫細胞計數等易于患 病）的風險中的受試者。與pDC有關的病癥包括(不限于)感染性疾病或持續性病毒感染(如 HIV感染）、自身免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡），和癌癥(如pDC來源的白血病），和與pDC的 組織蓄積有關的病癥。
[0108] 本發明的抗體可任選地與其它治療劑聯合遞送。另外的治療劑可與本發明的抗體 同時地遞送。如本文所用的，單詞〃同時地〃意指在時間上足夠接近以產生合并作用（即，同 時地可以是同時發生的，或可在彼此前后的一個短的時間段內發生的兩個或更多個事件）。
[0109] 在一個實施方案中，本發明的抗體與以下抗癌藥聯合給予，例如1)長春花生物堿 (如，長春堿、長春新堿）；2)表鬼臼毒素(如，依托泊苷和替尼泊苷）；3)抗生素(如，更生霉 素(放線菌素D)、柔紅霉素(道諾霉素;紅比霉素）、阿霉素、博萊霉素、普卡霉素(光輝霉素）， 和絲裂霉素(絲裂霉素C));4)酶(如，L-門冬酰胺酶）；5)生物反應調節劑(如，干擾素-a); 6)鉑配位復合物(如，順鉑和卡鉑）；7)蒽醌類(如，米托蒽醌）；8)取代的脲(如，羥基脲）； 9)甲基肼衍生物（如，甲基芐肼(N-甲基肼;MIH));10)腎上腺皮質抑制劑（如，米托坦(〇， p'-DDD)和氨魯米特）；11)腎上腺皮質甾類(如，強的松）；12)孕激素(如，己酸羥孕酮、醋 酸甲羥孕酮，和醋酸甲地孕酮）；13)雌激素（如，乙烯雌酚和炔雌醇）；14)抗雌激素藥物 (如，他莫昔芬）；15)雄激素（如，丙酸睪酮和氟甲睪酮）；16)抗雄激素藥物(如，氟他胺）； 和17)促性腺激素-釋放激素類似物(如，亮丙立德）。在另一個實施方案中，本發明的化合 物與以下抗血管生成藥物聯合使用，例如對VEGF的抗體(如，貝伐單抗(AVASTIN)、蘭尼單抗 (LUCENTIS))和其它血管生成促進劑(如，bFGF、促血管生成素-1)、對a-v/0-3血管整聯蛋白 的抗體(如，VITAXIN)、血管抑素、內皮抑素、達肝素、ABT-510、CNGRC肽TNFa共輒物、環磷酰 胺、考布他汀A4磷酸鹽、乙酸二甲基咕噸酮、多西他賽、來那度胺、恩扎妥林(enzastaurin)、 紫杉醇、紫杉醇白蛋白穩定化納米粒子制劑(Abraxane)、大豆異黃酮(染料木黃酮）、梓檬酸 他莫昔芬、沙利度胺、ADH-1 (EXHERIN)、AG-013736、AMG-706、AZD2171、甲苯磺酸索拉非尼、 BMS-582664、CHIR-265、帕唑帕尼、PI-88、伐他拉尼、依維莫司、蘇拉明、蘋果酸舒尼替尼、 父1184、206474^11161、(^161^8^(16，和塞來考昔。
[0110] 在一個實施方案中，本發明的抗體與以下抗病毒劑聯合給予:包括、例如，病毒-滅 活劑如非離子型、陰離子型和陽離子型表面活性劑，和C31 G (氧化胺和烷基甜菜堿）、聚雙 胍類（polybiguanides )、二十二醇、酰基肉堿類似物、辛基甘油，和抗菌肽如馬蓋寧 (magainins)、短桿菌肽（gramicidins)、protegrins和retrocyclins。溫和的表面活性劑， 如，失水山梨醇單月桂酸酯、可有利地在本文描述的組合物中用作抗病毒劑。可有利地用于 本文描述的組合物中的其它抗病毒劑包括核苷酸或核苷類似物，如替諾福韋、阿昔洛韋，金 剛烷胺、去羥肌苷、膦甲酸、更昔洛韋、利巴韋林、阿糖腺苷、扎西他賓，和齊多夫定。可使用 的其它的抗病毒劑包括非-核苷逆轉錄酶抑制劑，如UC-78 1 (硫代甲酰苯胺 (thiocarboxanilide))、吡啶酮、TIB0、奈韋拉平(nevaripine)、地拉韋啶、calanolide A、 卡普韋林和依法韋侖。從這些逆轉錄酶抑制劑，已顯示差的口服生物利用度的藥物及其類 似物基本上適合于與本發明的抗體和組合物聯合給予粘膜組織，以預防HIV的性傳播。可使 用的其它抗病毒劑為在HIV進入阻斷劑分類中的那些，如cyanovirin-N、環糊精、角叉菜膠、 硫酸化或磺化聚合物、扁桃酸縮合聚合物、單克隆抗體、趨化因子受體拮抗劑如TAK-779、 SCH-C/D，和AMD-3100，和融合抑制劑如T-20和1249。
[0111] 在一個實施方案中，本發明的抗體與以下免疫抑制劑聯合給予:包括，例如，環孢 菌素A、雷帕霉素、糖皮質激素、硫唑嘌呤、咪唑立賓，阿司匹林衍生物、羥氯喹、甲氨蝶呤、環 磷酰胺和FK506 (他克莫司）。
[0112]在特定的實施方案中，抗體以治療有效的量(如上文定義的術語)給予受試者。藥 用活性化合物的劑量可通過本領域已知的方法確定，見例如價《1〇以〇/3's 5fcie/3ces (Maack Publishing Co.，Easton, Pa)。抗體的治療有效劑量將隨著患者與患 者的不同而稍有變化，并將取決于患者的病癥和遞送的途徑。作為一般的建議，從約0.1至 約50 mg/kg的劑量將具有治療效果。與較高水平有關的毒性可限制靜脈內劑量至較低水平 如至多約10 mg/kg。從約10 mg/kg至約50 mg/kg的劑量可用于口服給藥。典型地，從約0.5 mg/kg至5 mg/kg的劑量可用于肌內注射。
[0113] 在本發明的特定實施方案中，可在各種時間間隔（如，每小時、每日、每周、每月等） 采用超過一次的給藥(如，兩次、三次、四次，或更多次給藥)以獲得治療作用。
[0114] 本發明發現在獸醫和醫學應用以及研究應用中的用途。如本文所用的，術語"受試 者"指人和其它動物。合適的受試者包括哺乳動物如人，以及由于瀕危動物而具重要性的那 些哺乳動物，如西伯利亞虎;具有經濟重要性的動物，如在農場飼養的動物;對人有社交重 要性的動物，如作為寵物或在動物園內保持的動物;和研究動物，如小鼠、兔、豚鼠、雪貂、 狗、貓、猴，和猿。這樣的動物的實例包括但不限于食肉動物如貓和狗;豬，包括小豬、肉豬， 和野豬;反芻動物和/或有蹄類動物如牛、公牛、綿羊、長頸鹿、鹿、山羊、野牛，和駱駝;馬;和 家禽。
[0115] 本發明在以下僅僅打算作為示例性說明的實施例中更具體地加以描述，因為其中 的大量修飾和變化對本領域技術人員而言將是顯而易見的。
[0116] 實施例1 實驗方法 人源化小鼠的構建:從北卡羅來那大學的機構動物護理和使用委員會(IACUC)獲得對 動物工作的批準。發明人如先前報告的5(3，類似地構建Balb/C rag2- y C (DK0)突變體DK0-hu HSC或Nod-ragl-yC (NRG) NRG-hu HSC小鼠。簡言之，人CD34+細胞從 16-至20-周齡胎 鼠肝組織中分離。組織用肝消化培養基（Invi trogen、Freder i ck、MD)消化。懸浮液通過70M1 細胞濾器(BD Falcon, Lincoln Park, NJ)過濾并以150g離心5分鐘，以通過Ficoll分離單 核細胞。在用⑶34+磁-活化細胞分選(MACS)試劑盒選擇后，將⑶34+ HSCs (0.5 x 1〇6)注 射每只2-至6-天齡DK0或NRG小鼠的肝中，所述小鼠先前已用300 rad輻照。超過95%的人源 化小鼠用血中的人白細胞穩定地重建(在12-14周為10%-90%)。各組(從相同的人供體胎肝 組織重建的人源化小鼠）具有類似的植入水平。所有小鼠被飼養在北卡羅來那大學教堂山 分校。
[0117] HIV-1病毒儲備液和人源化小鼠的感染：HIV-R3A，通過將高度致病的雙向性被膜 克隆進NL4-3主鏈生成24,25,51，被用于急性感染實驗。111￥-1的1?5向性株，貝-03?，被用于急性 和慢性兩種感染。所有病毒由293T細胞的轉染生成。具有穩定的人白細胞重建的人源化小 鼠用HIV-R3A或JR-CSF，以1 Ong p24/小鼠的劑量，通過靜脈內注射（i. 感染。用293T模擬 上清液感染的人源化小鼠被用作對照組。
[0118] 人源化小鼠中人漿細胞樣樹突狀細胞（pDC)的耗竭：對血液樹突狀細胞抗原-2 (BDCA2)特異性的單克隆抗體，15B，通過腹膜內注射（i.p.，4 mg/kg)，被用來治療人源化 小鼠。對于急性HIV-1感染，用15B在感染前_5、_3和-1天注射人源化小鼠3次。對于慢性HIV-1感染，在感染后11周(wpi )，經每周注射兩次，將15B應用于小鼠，持續10周。
[0119] HIV-1病毒載量檢測：在血漿中的病毒基因組RNA根據生產商的指示，使用QIAamp ? Viral RNA Mini Kit (QIAGEN, cat#52904)提取。HIV-1 復制（基因組拷貝/ml血漿)通 過實時PCR測量(ABI Applied Biosystem)。
[0120] 動物終止和組織處理：對于急性HIV-1感染，小鼠在1 wpi (NL4-R3A)或3 wpi (JR-CSF)時終止。對于慢性JR-CSF感染，小鼠在21 wp i終止。在終止時，如前所述5()，52，從小 鼠淋巴器官分離總白細胞。收獲淋巴組織，包括外周血(PBL)、腸系膜淋巴結(mLN)、脾(SP) 和骨髓(BM)以供分析。用ACK緩沖劑溶解紅細胞，對剩余的細胞染色并在FACS分析前用1% (wt/vol)甲醛固定。總細胞數量用帶有Guava表達軟件的Guava Easycytes (Guava)定量。
[0121] 流式細胞術:對HIV-1 gag p24染色，細胞首先用表面抗體染色，然后用cytofix/ cytoperm緩沖劑（BD Bioscience，cat#554714)滲透，接著經細胞內染色。通過CyAn FACS 機器（Dako)，對人白細胞（mCD45-huCD45+)分析人CD3、CD4、CD8、CD123、HLA-DI^PCD38。 FITC-綴合的抗-人HLA-DR (克隆：L243，cat#307604)、PE-綴合的抗-人CD38 (克隆：HIT2， cat#303506)、PE/Cy5-綴合的抗-人CD4 (克隆：RP4-T4，cat#300510)、PE/Cy7-綴合的抗-人CD3 (克隆：HIT3a，cat#300316)、太平洋藍-綴合的抗-人CD3 (克隆：UCHT1，cat# 300431)、PE/Cy7-綴合的抗-人CD8 (克隆：HIT8a，cat#300914)、APC-綴合的人CD123 (克 隆：6H6, cat#306012)和APC/Cy7-綴合的抗-人CD45 (克隆：H130, cat#304014)購自 81〇168611(1;?￡-綴合的抗-人半胱天冬酶-3(克隆：092-605，〇3七#51-68655乂）購自80 Bioscience。太平洋橙-綴合的抗-小鼠CD45 (克隆:HI30，cat#MHCD4530)、PE/得克薩斯 紅-綴合的抗-人CD4 (克隆：S3.5, cat撕HCD0417)或CD8 (克隆：3B5, cat撕HCD0817)，和 LIVE/DEAD? Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit (cat#L34957)購自 InvitrogeruFITC-綴合的抗-HIV p24 (克隆：FH190-1-1, cat#6604665)購自Beckman Coulter。細胞在CyAn ADP (Dako)上分析。
[0122] 人細胞因子luminex分析:小鼠血衆中的細胞因子用Milliplex ? MAP uman細胞因 子/趨化因子磁珠面板免疫分析（Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel Immunoassay) (Millipore)定量。收集血衆樣品并在分析前于-80°C|G存。測定在北卡羅來 那大學教堂山分校的臨床蛋白組學實驗室進行。
[0123] 免疫組織化學：來自人源化小鼠的石蠟-包埋的脾切片用小鼠抗-人hu⑶45抗體 (Dako, cat#N1514)染色，在PBS中洗滌，然后用Mouse-&-Rabbit_on-Rodent Double Stain Polymer (BIOCARE MEDICAL, cat#RDS513H)和底物DAB (BIOCARE MEDICAL, cat#BDB2004 H, L, MM)培養。使用Qlmaging Micropublisher 3.3 CCD數碼相機和QCapture軟件版本 3.0 (Qimaging, Surrey, BC)獲取圖像。
[0124] 通過FACS分選純化細胞:合并來自模擬組或處理組小鼠的脾細胞。對于人⑶45+細 胞分選，總m脾用人CD45、小鼠CD45和7-氨基放線素D (Aminoactinomycin D) (7-AAD)染 色。對于人⑶8+ T細胞分選，將⑶3和⑶8抗體加入到抗體混合物中。細胞分選用UNC Flow Cytometry Core進行。
[0125] Agilent微陣列分析:RNA純化根據生產商的指示，使用RNeasy ? Plus Mini Kit (QIAGEN, cat#74134)進行。將無DNase-RNase (QIAGEN)的處理加入到柱中，以在RNA制備 期間排除任何可能的DNA污染。通過毛細管電泳，檢查總RNA的數量、純度和完整性。在分開 的反應中用Cy3-和Cy5-標記的CTP擴增RNA，以生產差異地標記的樣品和參照c-DNAsdOO-400ng的總RNA被用作起始原料以制備cDNA。使用SurePrint G3人基因表達8x60K微陣列試 劑盒（SurePrint G3 Human Gene Expression 8x60K Microarray Kit) (Agilent)，將兩 者雜交至相同的微陣列（UNC Genomic and Bioinformatics Core) aAgilent特征提取 (Agilent Feature Extraction) vl8軟件被用來分析所有圖像。基因表達值通過紅色通道 強度(均值)對比綠色通道強度(均值)的l〇g2比值量化，接著經L0WESS歸一化以消除強度依 賴性染料偏倚 53。
[0126] 細胞mRNA水平檢測:檢測了干擾素a-1/13 (IFNal/13)、干擾素a-2 (IFNa2)、干擾 素KIF婦）54、干擾素 y(IFNy) 55和腫瘤壞死因子a (TNFa)56。檢測了 I型干擾素刺激基因 MxA 57和TRIM22 58,以證實對I型IFN生產的pDC耗竭作用。進行實時PCR分析(ABI Applied Biosystem)。所有的樣品使用人GAPDH基因59,按一式三份測試，用于數據歸一化。
[0127] 統計學分析：數據使用GraphPad Prism軟件版本5.0 (GraphPad軟件，San Diego, CA，USA)分析。用來分析微陣列數據的方法在上文已描述。來自不同組的小鼠的數 據使用雙尾Mann-Whitney U檢驗比較。對于基因表達，均值-A CT被計算為每組樣品內所有 ACT值的平均數（土 SD)并使用雙向AN0VA方法。相關性用斯皮爾曼檢驗估算。當p〈0.05 時，所有的結果被認為是有顯著意義的。
[0128] 實施例2 在人源化小鼠中的HIV-1感染 其他人和發明人已報道，功能性人PDC在人源化小鼠模型的淋巴組織中發生(Traggiai et al., Science 304:104： (2004)；Zhang et al., Blood 777:6184 (2011 )；Tanaka et a入(2012))。人pDC被HIV-1感染快速地激活，并且pDC激活的水平與CD4+ T-細胞數呈負相關（Zhang et a入，仞ooc/ 6184 (2011))，其與從HIV-1感染的患者 (Buimovici-Klein et al., Lancet 2\ 344 (1983)；Buimovici-Klein et al., AIDS 299-108 (1986);Meier et a2.，7Vature#ec/ici/3e 75:955 (2009))和SIV感染的 猴（Harris et a_/.，上 Ki_ro_/.財:7886 (2010);Campillo_Gimenez et a_/.，上 Ki_ro_/. 財：1838 (2010))觀察到的結果一致。在該研究中，已顯示持續的HIV感染在用雙向性R3A 株(圖la)或者CCR5-向性的JR-CSF株(圖2)感染的人源化小鼠中有效地建立。在急性和慢性 HIV-1感染二者中，觀察到HLA-DR+CD38+ CD8 T細胞的增加（圖lb、圖3a-3c)，伴有在CD3+ T 細胞中的CD4 T細胞百分比的下降（圖1 c、圖4a-4c)。如同在HIV-1患者中，白細胞減少，或總 人⑶45+白細胞包括⑶8 T細胞的耗竭，也發生于血和脾中（圖ld、圖5a)。類似于在HIV患者 中，在R3A或者JR-CSF感染的小鼠的血漿中有顯著誘導的I型干擾素產生（圖1 e、圖5b)，伴有 I型干擾素特異性ISG基因在來自脾的白細胞中表達的增加（圖If、圖5c)。因此，人源化小鼠 提供相關體內模型，用于研究HIV-1和宿主免疫效應子在HIV-1免疫發病機制中的作用 (Zhang et al., Blood 777:6184 (2011)；Zhang et al., Cell. Mol. Immunol. 9:237 (2012))。
[0129] 實施例3 在人源化小鼠中漿細胞樣樹突狀細胞的耗竭 為了描述人PDC在體內HIV-1感染和發病機制中的作用，生產抗-BDCA2 (CD303)單克隆 抗體（15B)，其可特異性地耗竭人源化小鼠的淋巴器官中的人pDC。在15B注射后，在外周血 (圖6a)和淋巴器官（圖6b)二者的⑶45+白細胞中的人pDC大大減少。作為對照，人T、B、單核 細胞/巨噬細胞和骨髓樹突狀細胞不受15B注射的干擾(圖7-9)。
[0130] 實施例4 在急性HIV-1感染中漿細胞樣樹突狀細胞的作用 為測試在早期原發性HIV-1感染期間pDC的作用，將15B和同種型對照抗體在感染前-5、-3和-1天注射到人源化小鼠中，和小鼠用R3A，一種高度致病的、CCR5-和CXCR4-雙向性的 HIV-1 株感染（Meissner et a_/.，Ki_ro_/ogy 74 (2004); Sivaraman et a_/.，, Kiro人皮?: 11715 (2009))。感染的小鼠用15B或對照抗體在感染后3和6天注射。已發現，當 在感染后8天終結時，pDC在感染的小鼠的血和淋巴器官中保持耗竭（圖10a)。有趣地，血漿 IFN-I水平被在HIV-1感染的小鼠中的pDC耗竭而顯著地降低（圖10b)。不同亞型的人IFN-I 的誘導也通過實時PCR在RNA水平上消除（圖10c)。此外，ISGs如Mxl、TR頂22的上調也被阻斷 (圖10d)。這些數據證實，在人源化小鼠的早期HIV-1感染期間，pDCs是主要的（如果不是唯 一的）、體內生產IFN-I的細胞。
[0131] 與IFN-I的抗病毒活性一致，pDC耗竭導致體內升高的HIV-1復制。與對照抗體處理 的小鼠比較，平均血漿病毒血癥增加約10-倍(p〈〇. 01)(圖1 la)。用較低致病性的、CCR5向 性的HIV-l JR-CSF重復實驗。類似于R3A感染，JR-CSF復制在pDC-耗竭的小鼠中也增加約5-倍（圖11c)。病毒復制的增加在來自脾的人細胞中對HIV p24蛋白陽性細胞通過免疫組織化 學(圖lib)或流式細胞術(圖lld，e)進一步證實。
[0132] HIV-1感染誘導全身性免疫激活（Lane et aL，見辦3卯:453 (1983);Ascher eta2.，C/i/3.辦p. 73:165 (1988))，已提出其促成HIV-1 疾 病進展（Lane et a_/.，TV. 453 (1983) ;Ascher et a_/.，C7i/3. j&p. Immunol. 73:165 (1988);Grossman et al., Clin? Immunol. Immunopathol. 69:123 (1993) ；Giorgi et al., J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 6:904： (1993) ；Bosinger et al., Curr. Opin. HIV AIDS 6:4：ll (2011)；Moir et al., Annu. Rev. Pathol. 6: 223 (2011))<JFN-I和pDC激活的誘導已被假定對在HIV-感染的患者和在SIV-感染的獼猴 二者中的免疫激活有貢獻(Buimovici-Klein et a_/.，Za/jcet J?:344 (1983);Buimovici_ Klein et al., AIDS Res. J?:99-108 (1986)；Meier et al., Nature Medicine 75:955 (2009)；Harris et al., J. Virol. 84:7886 (2010)；Campill〇-Gimenez et al., J. Virol. 54:1838 (2010) ；Bosinger etal., Curr. Opin. HIV AIDS 6-All (2011)；Kwa et al., Blood 118:2763 (2011)；Manches et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109: 14122 (2012);Manches eta 入，C/i/3. H 及 3431 (2008))。然而，代替降低 的T細胞激活，在用R3A (圖12a，b)或者JR-CSF (圖12c，d)感染的pDC-耗竭的小鼠的血和淋 巴器官二者中觀察到T細胞激活的進一步增加 (CD38+DR+)。有趣地，已發現⑶8 T細胞激活 水平與pDC-耗竭的小鼠的病毒載量有關（圖13)。因此，在INF-I的不存在下，HIV-1也可直接 地導致T-細胞激活。
[0133] 然而，不管增加的HIV-R3A病毒復制，人CD4+ T細胞在血和脾中的絕對數是可與對 照抗體處理的小鼠的那些相當的（圖14a)。更令人吃驚的是，pDC耗竭的小鼠的CD8+細胞與 對照抗體處理的動物比較有顯著地增加（圖14b)。總人⑶45+白細胞也保持在血和脾中（圖 14c )，并且這與總⑶45+或⑶8 T細胞的細胞死亡下降有關（圖14d，e)。類似的結果在JR-CSF 感染的小鼠中觀察到，雖然只有低水平的人CD4+、CD8+ T細胞和總人白細胞和耗竭在感染后 3周時發生（圖15)。
[0134] 實施例5 在慢性HIV-1感染中漿細胞樣樹突狀細胞的作用 pDC耗竭在人源化小鼠中，用建立的持續的HIV-1感染進行。用JR-CSF感染人源化小鼠 11周;然后應用15B以耗竭pDCs。與得自預-感染pDC耗竭的數據一致，觀察到病毒血癥增加 持續10周直至終止（圖16a) AIV感染的細胞(HIV-1 p24陽性)的百分比也有增加（圖16b、圖 17a)。血漿IFN-a2的誘導在pDC-耗竭的小鼠中顯著下降(Fig. 17b)。在人脾白細胞中，在RNA 水平上不同IFN-1亞型（圖17c)和ISGs (圖17d)的減少的誘導也被實時PCR分析和cDNA陣列 證實（圖17e、f)。這些數據提示，pDC在HIV-1慢性感染期間，仍然是主要的體內生產INF-I的 細胞。
[0135] 不管在pDC耗竭的這10周期間的持續的較高病毒血癥，脾中的人CD4+ T-細胞數與 對照組比較有顯著的增加（圖16c，p〈0.05)。此外，人⑶8 T細胞和⑶45+白細胞數也有增加 (圖16d、e，p〈0.01)。有興趣的是，人⑶4、⑶8 T細胞和總⑶45+白細胞在血中沒有顯著補救 (圖16c-e)。人⑶45+細胞的增加也被脾切片的⑶45免疫組織化學染色證實（圖16f)。因此， pDC耗竭顯著地減少在脾中的T細胞和總人CD45+細胞中的死亡/垂死細胞的百分比（圖 16g)。因此，在慢性HIV-1感染期間，pDC在抑制病毒復制和促進HIV-誘導的免疫發病機制兩 方面仍然起作用。
[0136] 由于在人類患者或在SIV-感染的猴中進行的相關研究，pDC在慢性病毒感染如 HIV-1 中的作用仍然是有爭議的（Cervantes-Barragan et a_/.，Pi-oc. dcac/. 5fci. USA 109\?,Q12 (2012)；Riviere et al., J. Exp. Med. 152:633 (1980)；ffang et al., CeD從H:631 (2012))。已有報道，通過在HIV-1感染之前或期間，用新的抗 體特異性地耗竭pDC，pDC是在HIV感染期間主要的體內產生IFN-I的細胞。已報道pDC在HI V-1感染期間和發病機制方面起著雙重作用：它們生產IFN-I以抑制HIV-1復制，但通過促進人 白細胞包括人CD4和CD8 T細胞的死亡提高HIV-1發病機制。在持續的HIV-1感染期間，在15B mAb處理后，剩余的IFN-I表達可能是由于骨髓中存在剩余的pDC，雖然其它細胞類型的貢獻 也不能排除（Lepelley et a_/.，7:e100 1284 (2011))。
[0137] 有報道pDC可有助于HIV誘導的免疫激活和隨后的免疫發病機制。抗-瘧疾藥氯喹 通過pDC在體外抑制IFN-I生產（Beignon eta^.，C/i/3. H5:3265 (2005)) 并似乎補救與減少的免疫激活有關的HIV-1感染患者的人T細胞(Murray et aL. KiroL 財：12082 (2010);Piconi et a2.，仞ooc/』從:3263 (2011))。有趣的是，HIV-激 活的pDCs通過吲噪胺2，3-雙加氧酶（ID0)-依賴機制，還誘導調節性T細胞（Tregs ) (Manches et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 109\IA122 (2012)；Manches et al., C/i/3. H及3431 (2008))。在該報告中，觀察到通過pDC耗竭增加的T-細胞激 活，這可能是由于經由PDC/IFN-I獨立的機制增加了病毒復制。一份最近的報告顯示，可抑 制從獼猴分離的pDC激活的TLR7和TLR9拮抗劑沒有顯著地改變血漿IFN-1水平和ISG在SIV 感染的猴中的表達，可能是由于其在體內不完全地抑制pDC或是由于mDC和巨噬細胞的高水 平激活(Kader et aL，P:e100 3530 (2013))。因此，pDC和HIV-1 復制，以 及其它免疫細胞，在免疫激活中的相對作用需要被進一步研究。
[0138] 重復給予小鼠TLR7配體誘導AIDS-樣淋巴細胞減少，伴有減少的⑶4+ T細胞、CD8+ T細胞和B細胞(Baenziger et a入，扮ooc/ H1377 (2009))。有報道IFN-1觸發對T細胞的 促凋亡和抗增殖的作用（Tanabe eta^.，上iMmmo人274:609 (2005))，和由TCR信號傳 導激活的Stat4可克服其STAT1-依賴的抑制T細胞增殖的作用(Gil et a丄，仞ooc/ 7洲： 3718 (2012))。類似地，TLR7和TLR9拮抗劑DV056-治療的恒河猴顯示血中記憶CD4+和CD8+ T 細胞增殖的顯著增加（Kader et a^.，凡oSPatAogefls S?:e100 3530 (2013))。一致地，已 發現pDC耗竭不僅補救⑶4+ T細胞，而且還補救總⑶45+白細胞和⑶8 T細胞。已提出pDC通過 誘導異常免疫激活和通過促進人免疫細胞的耗竭，可有助于HIV免疫發病機制。
[0139] 最近的報告也顯示，在LCMV持續感染期間，阻斷IFN-I信號傳導可改善抗病毒T細 胞反應并經由IL-10-依賴性機制加速慢性LCMV感染的消除(Wilson et a^.，Science 貨 6?:202 (2013);Teijaro et a入，3你:207 (2013))。類似的結果見于發明人 的HIV-1感染模型中，因為升高水平的⑶8 T細胞和IFN y與pDC耗竭和IFN-I誘導的阻斷相 關。然而，PDC-耗竭似乎不影響人源化小鼠中的IL-10表達，可能是由于HIV-1復制水平的升 高。在HAART-治療的HIV患者中，顯著數量的部分不能顯示減少的免疫激活和有效的免疫重 建，甚至伴有有效病毒學反應(Aiuti et aL，diaSTfer.及88 (2006);Gaardbo et a2.， C/i/3. Per. iff皿洲M:670957 (2012);Zhang et a2.，dic/s 27:1283 (2013))。持 續的pDC激活和IFN-I誘導可在這樣的免疫無應答患者中起作用。已提出pDC的抑制或耗竭 在HAART期間，在HIV-1慢性感染中可提供有效的治療，以保持HIV-1感染患者中的人免疫細 胞。
[0140] 實施例6 人源化小鼠中漿細胞樣樹突狀細胞的耗竭 抗-BDCA2 (⑶303)單克隆抗體的進一步的篩選鑒定特異性地耗竭人源化小鼠的淋巴 器官中的人pDC的另一種抗體（12B)。在12B注射后，在CD45+白細胞中的人pDC在脾中大大減 少（圖20)。作為對照，人T和骨髓樹突狀細胞不受12B注射的干擾(圖20)。
[0141] 前述是本發明的示例性說明，且不視為對其的限制。本發明通過以下權利要求書， 以及包括在其中的權利要求的等價物來定義。
【主權項】
1. 一種在受試者中耗竭漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)的方法，其包括遞送給受試者有效 量的特異性地結合血液樹突狀細胞抗原-2 (BDCA2)并耗竭pDC的抗體或其片段，從而耗竭 pDC〇2. -種在有需要的受試者中治療與pDC有關的病癥的方法，其包括遞送給受試者治療 有效量的特異性地結合BDCA2并耗竭pDC的抗體或其片段，從而治療所述病癥。3. 權利要求2的方法，其中所述病癥是持續的病毒感染。4. 權利要求2的方法，其中所述病癥是人免疫缺陷病毒感染。5. 權利要求2的方法，其中所述病癥是感染性疾病。6. 權利要求2的方法，其中所述病癥是自身免疫性疾病。7. 權利要求2的方法，其中所述病癥是癌癥。8. 權利要求2的方法，其中所述病癥是pDC-來源的白血病。9. 權利要求2的方法，其中所述病癥是與pDC的組織蓄積有關的病癥。10. 權利要求1-9的任一項的方法，其中K)CA2是人K)CA2。11. 權利要求1-10的任一項的方法，其中所述抗體或其片段是單克隆抗體或其片段或 衍生物。12. 權利要求11的方法，其中所述單克隆抗體或其片段特異性地結合表位 IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR (SEQ ID N0:9)或其至少5個連續氨基酸的片段。13. 權利要求11的方法，其中所述單克隆抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:2的氨基 酸序列或與其至少90%相同的序列的重鏈可變區。14. 權利要求11的方法，其中所述單克隆抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:4的氨基 酸序列或與其至少90%相同的序列的輕鏈可變區。15. 權利要求11的方法，其中所述單克隆抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:6的氨基 酸序列或與其至少90%相同的序列的重鏈可變區。16. 權利要求11的方法，其中所述單克隆抗體或其片段包含含有SEQ ID N0:8的氨基 酸序列或與其至少90%相同的序列的輕鏈可變區。17. 權利要求11-16的任一項的方法，其中所述單克隆抗體或其片段是嵌合抗體或其片 段。18. 權利要求11-16的任一項的方法，其中所述單克隆抗體或其片段是人源化抗體或其 片段。19. 一種在混合的細胞群中耗竭pDC的方法，其包括遞送給混合的細胞群有效量的特異 性地結合BDCA2并耗竭pDC的抗體或其片段，從而耗竭混合的細胞群中的pDC。20. -種抗體或其片段，其當給予受試者時，特異性地結合K)CA2并耗竭pDC。21. 權利要求20的抗體或其片段，其是單克隆抗體或其片段或衍生物。22. 權利要求21的抗體或其片段，其特異性地結合表位IQNLKRNSSYFLGLSDPGGR (SEQ ID NO:9)或其至少5個連續氨基酸的片段。23. -種單克隆抗體或其片段，其包含含有SEQ ID NO: 2的氨基酸序列或與其至少90% 相同的序列的重鏈可變區。24. -種單克隆抗體或其片段，其包含含有SEQ ID NO:4的氨基酸序列或與其至少90% 相同的序列的輕鏈可變區。25. -種單克隆抗體或其片段，其包含含有SEQ ID NO:6的氨基酸序列或與其至少90% 相同的序列的重鏈可變區。26. -種單克隆抗體或其片段，其包含含有SEQ ID NO:8的氨基酸序列或與其至少90% 相同的序列的輕鏈可變區。27. 權利要求23-26的任一項的單克隆抗體或其片段，其是嵌合抗體或其片段。28. 權利要求23-26的任一項的單克隆抗體或其片段，其是人源化抗體或其片段。29. -種藥用組合物，其含有權利要求23-28的任一項的單克隆抗體或其片段和藥學上 可接受的載體。30. -種藥劑盒，其含有權利要求23-28的任一項的單克隆抗體或其片段和使用說明 書。
【文檔編號】A61P37/00GK106029874SQ201480075635
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2014年12月16日
【發明人】蘇立山
【申請人】北卡羅來納-查佩爾山大學