離體的抗體生產的制作方法

離體的抗體生產的制作方法【專利摘要】本發明涉及用于生產倍增時間短的改進的離體B細胞培養物的手段和方法。【專利說明】離體的抗體生產
技術領域：
[0001]本發明涉及醫藥、分子生物學和免疫學的領域。【
背景技術：
】[0002]離體的B細胞培養物是生產抗體，優選單克隆抗體的重要工具。單克隆抗體(mAb)代表一種抗體分子的多個相同拷貝，這些拷貝以相同的親和性結合抗原，并且促進相同的效應子功能。在mAb的益處之中，是它們對抗原上的同一表位的特異性。與其它常規治療相比，該特異性賦予mAb特定的臨床優點，同時賦予患者通常具有低副作用的有效且耐受良好的治療選擇。此外，mAb可用于生物和醫學研究。[0003]獲得mAb的常規途徑是雜交瘤技術，其中B細胞與骨髓瘤細胞融合，以形成產生雜交抗體的細胞系（雜交瘤）。但是，使用人B細胞的雜交瘤技術不是很成功，因為得到的雜交瘤是不穩定的。同時，已經開發了改進的技術，其中生產具有延長的復制壽命的離體B細胞培養物(W02007/067046)。該技術涉及人的離體培養物，其中在B細胞中表達Bcl-6以及Blimp-1和/或抗凋亡的核酸。這改善了這些B細胞的復制壽命。典型地，培養人的B細胞，以獲得人mAb。對于人類中的治療應用來說，人mAb是優選的，因為與其它物種的抗體相比，人mAb具有較低的免疫原性。使用W02007/067046的技術，獲得了平均倍增時間約為25~36小時的離體的人B細胞培養物。[0004]為了工業生產感興趣的mAb，諸如治療mAb，有利地使用B細胞培養物，其中的B細胞具有較短的倍增時間。在如癌癥治療的治療途徑中，例如當使用患者的癌細胞對非人的哺乳動物進行免疫，隨后從動物中收獲癌癥特異性B細胞并且用于離體的抗體生產時，較短的倍增時間也是非常重要的。因為這樣的抗體是對個體患者的定制型藥物，應當盡快生產這些抗體，以便患者能夠盡快開始他/或她的Ab治療。對個體腫瘤具有特異性的上述抗體是不能提前生產的。【
發明內容】[0005]本發明的目標之一是提供用于生產具有較短倍增時間的改進的離體B細胞培養物的手段和方法。[0006]本發明發現當使用兔B細胞時，獲得了與W02007/067046中公開的B細胞培養物相比，具有更短倍增時間的B細胞培養物。然后，普遍使用的B細胞，諸如人的B細胞、鼠的B細胞和美洲駝的B細胞一般具有25~36小時的倍增時間，本發明人驚奇地發現可獲得具有20小時或更短的倍增時間的兔B細胞培養物。這一發現允許顯著更快地生產感興趣的抗體，在給定時間范圍內得到更高的產量，這對于抗體的工業生產和治療應用是特別有價值的。[0007]相應地，本發明提供了兔B細胞在獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細胞培養物中的應用。一般通過在兔B細胞中表達Bcl-6或其兔同源物，和抗凋亡的核酸分子，來獲得根據本發明的離體兔B細胞培養物。因此，進一步提供了一種獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細胞培養物的方法，所述方法包括：[0008]-在B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達；以及[0009]-在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持抗凋亡的核酸分子的表達，[0010]其特征在于，所述B細胞是兔B細胞。[0011]優選地，生產具有小于20小時的平均倍增時間的離體兔B細胞培養物。更優選地，上述平均倍增時間小于19小時或甚至小于18小時。較短的倍增時間允許較快和較高的抗體生產，這改善了測試和篩選期望抗體的時間和效率，并且改善了感興趣抗體的分離和/或鑒定。此外，如果需要開發針對個體患者的mAb，則兔B細胞的較短的倍增時間允許更快地開始患者的特異性mAb治療。[0012]因此，根據本發明的方法使用兔B細胞提供了以下優點：與目前已知的人、鼠或美洲駝的B細胞培養物相比，可在更短的時間范圍內離體獲得、測試、鑒定、分離和/或生產抗體。[0013]本發明提供具有短倍增時間的B細胞培養物這一事實提供了以下優點：與現有方法相比，可在更短的時間段內獲得足量的抗體。例如，在W02007/067046公開的方法中，使用Bcl-6和抗凋亡的核酸(或增加這樣的核酸表達的化合物)穩定從人類個體中獲得的B細胞集合，隨后進行培養。這樣得到能夠增殖且生產抗體的穩定的人的B細胞。在培養過程中，穩定的B細胞生產抗體，該抗體被分泌到培養基中。隨后，優選測試這些抗體的期望的特異性(和/或親和性）。對于目前的測試程序，一般需要抗體濃度至少為l〇〇ng/ml培養基。在穩定的人的B細胞培養15~20天之后，獲得這樣的最小抗體濃度。因此，使用人的B細胞培養物，抗體在開始培養之后至少15~20天，一般大約在第20天進行收獲。美洲駝的B細胞具有與人的B細胞類似的生長速率，因此如果使用美洲駝的B細胞培養物，則一般也在開始培養之后至少15~20天時收獲抗體。鼠的B細胞具有更長的倍增時間，一般在超過20天之后獲得100ng/ml最小濃度的抗體。[0014]在測試抗體之后，常常選擇并且分離出感興趣的對應的B細胞，以備進一步的使用。鑒于抗體測試正常耗費約三天，則一般從開始B細胞培養18~23天之后選擇并且分離出感興趣的人或美洲駝的B細胞，而一般在超過23天之后選擇并且分離出感興趣的鼠的B細胞。然后，對分離出的B細胞進行進一步培養。因此，一般從開始B細胞培養約三周之后，獲得具有感興趣的人、美洲駝或鼠的B細胞的B細胞培養物。然而，使用根據本發明的方法，在11~12天之后已經獲得了至少100ng/ml的抗體濃度。因此，現在能夠在開始B細胞培養之后11~12天時收獲抗體，而之前，在收獲抗體之前必須使人(或美洲駝)的B細胞培養物維持至少15~20天。如果測試程序耗費三天，則從開始B細胞培養14~15天內選擇并且分離出感興趣的兔B細胞，這顯著快于培養人或鼠的B細胞的情況。總之，獲得生產足夠濃度的抗體的人、美洲駝或鼠的B細胞培養物一般耗費約三周，而本發明的發現，在兩周之后就獲得了具有生產足夠Ab濃度的兔B細胞的B細胞培養物。這是與現有方法相比的主要優點。因此，本發明的一個方面提供了獲得抗體的方法，優選用于需要最小抗體濃度至少為l〇〇ng/ml的一種或多種測試檢驗中，該方法包括：[0015]-在兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6的表達；[0016]-在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持抗凋亡的核酸分子的表達；[0017]-離體培養所述B細胞；以及[0018]-在10~14天內，優選在11~12天內，收獲由所述B細胞生產的抗體。優選使用需要最小抗體濃度至少為lOOng/ml的一種或多種檢驗，來測試收獲的上述抗體。[0019]如上所述，獲得的抗體一般用于測試期望的特異性和/或親和性。目前的測試方法常常需要l〇〇ng/ml的最小抗體濃度，但是如果使用更敏感的檢測方法，則能提前收獲抗體。無論測試方法的敏感性如何，由于兔B細胞的倍增時間顯著更快，因此根據本發明的方法使用兔B細胞，能比使用目前已知的人、美洲駝或鼠的B細胞更早地得到所需的最小抗體濃度。例如，如果僅需要30ng/ml的最小抗體濃度，則使用人的B細胞通常從在開始B細胞培養13~18天之后達到該濃度，而兔B細胞培養僅需9~10天就會到該最小抗體濃度。因此，同樣地可更早地進行抗體測試和感興趣的B細胞的分離。在實踐中，本發明人從開始B細胞培養7~14天內，得到并且測試了兔的抗體。在本發明之前，不能獲得與離體的人類B細胞培養物相比，能夠在顯著更早的階段進行抗體測試的離體的B細胞培養物。因此，進一步提供了獲得抗體的方法，該方法包括：[0020]-在兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達；[0021]-在所述兔B細胞中，誘導、增強和/或維持抗凋亡的核酸分子的表達；[0022]_離體培養所述B細胞；以及[0023]-在7~14天內，優選在9~12天或9~10天內，收獲由所述B細胞生產的抗體。優選使用需要最小抗體濃度約為30ng/ml的一種或多種檢驗，來測試收獲的所述抗體。[0024]如本文所使用的，術語"兔B細胞"指已經從兔獲得的B細胞，或者來源于兔B細胞的B細胞。來源于兔B細胞的B細胞的實例是兔B細胞在一次或多次細胞分裂周期之后形成的后代。這樣的后代例如包括兔B細胞的離體培養物。[0025]離體兔B細胞培養物是包含兔B細胞和/或其后代的培養物。其它類型的細胞也可存在于培養物中。例如，諸如CD40陽性L細胞和/或EL4B5細胞的B細胞刺激細胞通常也存在于根據本發明的B細胞培養物中。此外，也存在于含B細胞樣品中的其它類型的細胞仍然可存在于B細胞培養物中。當在B細胞培養條件下存在時，這些非B細胞的增殖能力通常比B細胞弱，這樣的污染細胞的數目通常會隨時間逐漸降低。優選地，兔B細胞培養物的至少70%的細胞是兔B細胞。更優選地，上述兔B細胞培養物的至少75%、80%、85%、90%或95%的細胞是兔B細胞。在特別優選的實施方式中，兔B細胞和諸如CD40陽性L細胞和/或EL4B5細胞的B細胞刺激細胞基本是在兔B細胞培養物中存在的僅有的細胞類型。[0026]優選地，根據本發明的兔B細胞培養物的B細胞是一個原始的兔B細胞的后代，這樣通過所述B細胞培養物來生產單克隆抗體。[0027]術語"平均倍增時間"在本文中被限定為，從具有一定初始量的B細胞的培養物開始，至獲得具有該初始B細胞量的兩倍數量的B細胞的培養物，所需的平均時間。因為不是每一個B細胞都會以完全相同的速率進行增殖，因此平均值通常用于作為一個整體的B細胞培養物。[0028]Bcl-6編碼正常B細胞和T細胞的發育和成熟，以及形成生發中心所需的轉錄阻抑因子。Bcl-6在生發中心的B細胞中高表達，而幾乎不在漿細胞中表達。Bcl-6抑制活化的B細胞分化成漿細胞。在根據本發明的方法中，Bcl-6的表達產物，或其兔同源物的表達產物，依然存在于離體培養物的兔B細胞中。Be1-6或其兔同源物的存在，與抗凋亡的核酸的存在一起，延長了B細胞的復制壽命。優選通過向用于培養的兔B細胞給予促Bcl-6表達的化合物或促Bcl-6的兔同源物的表達的化合物，或通過在上述化合物的存在下培養兔B細胞，誘導、增強或維持Bcl-6或其兔同源物的表達。[0029]因此，進一步提供了根據本發明的方法，該方法包括：[0030]-向所述兔B細胞提供能直接或間接增強Bcl-6的表達或Bcl-6的兔同源物的表達的化合物;和/或[0031]-在能直接或間接增強Bcl-6的表達或Bcl-6的兔同源物的表達的化合物的存在下，培養所述兔B細胞。[0032]能直接或間接增強Bcl-6的表達或Bcl-6的兔同源物的表達的各種化合物在本領域中是已知的。這樣的化合物例如包括信號轉導和轉錄活化因子5(STAT5)蛋白，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物，和/或編碼STAT5的核酸序列。STAT5是能增強Bcl-6表達的信號轉導因子。STAT5存在兩種已知的形式，STAT5a和STAT5b，這是由兩個不同的串聯連接的基因編碼的。給予和/或活化STAT5或其兔同源物使Bcl-6水平增強，或使Bcl-6的兔同源物水平增強。因此，STAT5或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物能夠直接增加Bcl-6的表達或Bcl-6的兔同源物的表達。因此，提供了根據本發明的方法，該方法包括：向所述兔B細胞提供STAT5，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物;或者，向所述兔B細胞提供編碼STAT5,或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子;或者，在STAT5的存在下，或在其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的存在下，培養所述兔B細胞。[0033]STAT5或其兔同源物的存在直接增加Bcl-6的量或Bcl-6的兔同源物的量。還可以間接增加Bcl-6的表達或Bcl-6的兔同源物的表達。這例如通過調節特定化合物的量來完成，該特定化合物反過來能夠直接或間接活化STAT5或其兔同源物，和/或增加STAT5的表達或其兔同源物的表達。因此，在一個實施方式中，增加了內源性和/或外源性STAT5的表達和/或活性，或其兔同源物的表達。例如，通過在白介素（IL)2和/或IL4的存在下培養兔B細胞，可以間接增強Bcl-6的表達或其兔同源物的表達，其中IL2和/或IL4能夠活化STAT5或活化STAT5的兔同源物，該STAT5或其兔的同源物反過來增加Bcl-6的表達或Bcl-6的兔同源物的表達。[0034]如本文所使用的，術語Bcl-6或STAT5的"兔同源物"例如指對應于Bcl-6或STAT5的兔的蛋白，這意味著與人B細胞中的Bcl-6或STAT5的功能相比，Bcl-6或STAT5的"兔同源物"在兔B細胞中具有對應的類似的功能。[0035]但是，優選提供兔B細胞，該兔B細胞具有編碼Be1-6或編碼其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。通過這種方式，可以直接調節所述兔B細胞中的Be1-6的濃度或其兔同源物的濃度。因此，還提供了根據本發明的方法，該方法包括:向所述兔B細胞提供編碼Bcl-6或編碼Bcl-6的兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。在一個實施方式中，所述核酸分子是組成性活化的，這意味著Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物是不依賴于調節因子的存在而持續表達。在另一實施方式中，所述核酸分子是可誘導的，這意味著該核酸分子的表達受至少一種誘導因子和/或阻抑因子的調節。通過這種方式，所述核酸分子的表達可隨意進行調節。例如，Tet-On和Tet-Off表達系統（例如Tet-On?和Tet-Q.iK|).AdvancedInducibleGeneExpressionSystems，Clontech)可用于感興趣的核酸序列的誘導性表達。在這些系統中，轉錄活化因子(tTA)的表達受到四環素(TC)或衍生物如強力霉素(dox)的存在(Tet-On)或不存在(Tet-Off)的調節。原則上來講，tTA由大腸桿菌(Escherichiacoli)Tet阻抑因子蛋白（TetR)和單純皰疹(Herpessimplex)病毒反式激活結構域VP16構成。tTA在四環素反應元件(TRE)的控制下調節感興趣的核酸序列的轉錄，該四環素反應元件(TRE)包括Tet操縱子(TetO)DNA序列和啟動子序列，例如人類巨細胞病毒(hCMV)啟動子序列。可將編碼例如Bcl6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列放置在該啟動子的下游。[0036]在Tet-off系統中，tTA在沒有TC或dox的情況下結合TRE并且活化感興趣的核酸序列的轉錄，而在TC或dox的存在下，tTA不能結合TRE并且抑制感興趣的核酸序列的表達。與此相反，Tet-on系統使用反式tTA(rtTA)，該反式tTA(rtTA)僅在dox存在下結合TRE。感興趣的核酸序列的轉錄在沒有dox的情況下被抑制，而在存在dox的情況下被活化。[0037]在另一實施方式中，使用激素誘導的基因表達系統，諸如蛻皮激素誘導的基因表達系統（例如RheoSvvitcldNewEnglandBiolabs)(Christopherson，K.S.etal.PNAS89，6314-8(1992))，來執行誘導性表達。銳皮激素是來自例如果繩（Drosophilamelanogaster)的昆蟲類固醇激素。在轉染有蛻皮激素受體的細胞中，在蛻皮激素激動劑的存在下，形成由蛻皮激素受體(Ecr)和類視黃醇X受體(RXR)組成的異二聚體，其中蛻皮激素激動劑選自蛻皮激素，它的一種類似物(諸如幕黎留酮(muristeroneM和百日青蛻皮酮(ponasterone)A)，和非類固醇銳皮激素激動劑。在激動劑的存在下，Ecr和RXR相互作用并且結合存在于表達盒上的蛻皮激素反應元件。因此，通過將兔B細胞暴露于蛻皮激素激動劑，誘導位于蛻皮激素反應元件下游的表達盒中的感興趣的核酸序列的表達。[0038]在本發明的又一實施方式中，使用阿拉伯糖誘導性基因表達系統(例如pBAD/glll試劑盒，Invitrogen)(Guzman，L.M.etal.Bacteriol177，4121_4130(1995))，執行誘導性表達。阿拉伯糖是含五個碳原子的單糖。在轉染有阿拉伯糖誘導性啟動子PBAD的細胞中，可在阿拉伯糖的存在下，誘導位于PBAD下游的感興趣的核酸序列的表達。[0039]還可以使用Bcl-6蛋白，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物（編碼它們的核酸分子），其中所述Bcl-6蛋白或兔同源物或功能部分或功能衍生物受到至少一種誘導因子和/或阻抑因子的調節。非限制性實例是一融合蛋白，其中調節元件與編碼Bcl-6或其兔同源物的至少一部分的序列融合。例如，雌激素受體(ER)與Bcl-6融合，產生融合蛋白ER-Bcl-6。該融合蛋白是沒有活性的，因為它與細胞質中的熱休克蛋白形成復合體。當給予外源性誘導因子4羥基三苯氧胺(4HT)時，融合蛋白ER-Bcl-6與熱休克蛋白解離，以便融合蛋白的Bcl-6部分變成有活性的。[0040]如本文所使用的，術語"抗凋亡的核酸分子"指能夠延遲和/或阻止兔B細胞中的凋亡的核酸分子。優選地，所述抗凋亡的核酸分子能夠延遲和/或阻止能增殖并且產生抗體的漿母細胞樣兔B細胞的凋亡。優選地，所使用的抗凋亡的核酸分子包括外源性核酸分子。這意味著，所使用的核酸序列不是在兔B細胞中天然表達的，或者使用天然存在的核酸序列的額外拷貝，這樣與天然的兔B細胞相比，增強在得到的兔B細胞中的表達。各種抗凋亡的核酸分子在本領域中是已知的，這樣可獲得各種實施方式。優選地，所使用的抗凋亡的核酸分子是Bcl-2家族的抗凋亡成員，因為抗凋亡的Bcl-2蛋白是B細胞中優秀的凋亡抑制因子。受到Bcl-2家族(該家族包括促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白）控制的很多過程都與凋亡的線粒體途徑相關。使用抗凋亡的Bcl-2家族成員此1-2、8〇1-認、8〇1-?、8(31-2相關蛋白41(也被稱為Bcl2-Al或Al)、Bcl-2樣10(Bcl2L10)和Mcl-1，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物是優選的，因為此1-2、8〇111^、8(：1-￥^1、8(312110和11-1通常與線粒體外膜整合。它們直接結合且抑制屬于Bcl-2家族的促凋亡蛋白，以保護線粒體膜的完整性。[0041]因此，優選實施方式提供了根據本發明的方法，其中，所述抗凋亡的核酸分子包括Bcl2家族的抗凋亡基因，優選Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10,或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物。[0042]在一個實施方式中，通過向兔B細胞給予能夠促進這些抗凋亡基因的表達的至少一種化合物，或在這樣的化合物的存在下培養兔B細胞，來誘導、增強或維持Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10,或其兔同源物的表達。因此，進一步提供了根據本發明的方法，該方法包括：[0043]-向所述兔B細胞提供能夠直接或間接增強Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bel2L10，或其兔同源物的表達的化合物;和/或[0044]-在能夠直接或間接增強Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10,或其兔同源物的表達的化合物的存在下，培養所述兔B細胞。[0045]但是，優選向兔B細胞提供編碼Bcl2家族的抗凋亡基因的至少一種核酸分子，該Bcl2家族的抗凋亡基因優選選自由Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w、Bcl2L10,及其兔同源物，及其功能部分和功能衍生物所組成的組。通過這種方式，可以直接增強在所述兔B細胞中的表達產物的量。因此，還提供了根據本發明的方法，該方法包括：向所述兔B細胞提供編碼Bcl2家族的抗凋亡基因的至少一種核酸分子，該Bcl2家族的抗凋亡基因優選選自由此1_xL、Mcl-l、BCl-2、Al、Bcl-W、BC12L10,及它們的兔同源物，及它們功能部分和功能衍生物所組成的組。在一個實施方式中，所述核酸分子是組成性活化的，這意味著所述核酸分子被持續表達。在另一實施方式中，所述核酸分子是誘導性的，這意味著它的表達受到至少一種誘導因子和/或阻抑因子的調節。前文中描述了本領域已知的誘導性核酸表達系統的非限制性實例。[0046]在特別優選的實施方式中，所述抗凋亡的核酸分子編碼Bcl-xL或Mcl-1，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物。根據本發明，Bel-6和Bcl-xL的組合能特別好地增加兔B細胞的復制壽命，從而形成得到的漿母細胞樣B細胞的長期培養物。這同樣也適用于Bel-6和Mcl-1的組合。最優選地，所述抗凋亡的核酸編碼Bcl-xL，或其功能部分或功能衍生物。[0047]與天然的此1-6、8(3111、]\^1-1、8(31-2、六1、8(311或此12110或其兔同源物相比，8〇1-6、8(3111、1^1-1、8(31-2^1、8(31-?或此12110或其兔同源物的功能部分是蛋白質類分子，分別具有在性質上，而不一定在量上，增加兔B細胞的復制壽命的相同的能力。這樣的功能部分例如缺乏那些不參與或僅非常少地參與該能力的氨基酸。[0048]例如，在本文中，8(3111^、1(：1-1、8(31-2^1、8(311和此12110，或其兔同源物的功能部分分別被定義為此1-^〇1-1、8〇1-2)1、8(31-?和此12110，或其兔同源物的片段，所述片段分別保留了與全長此111^1^1-1、8〇1-2^1、8〇1-?和此12110，或其兔同源物(在性質上，而不一定在量上)相同性質的抗凋亡特性。Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-wSBcl2L10，或其兔同源物的功能部分通常分別是此111^1(：1-1、8(31-2)1、8(31-?或此12110，或其兔同源物的較短片段，所述較短片段能夠延遲和/或阻止兔B細胞中的凋亡。這樣的功能部分例如沒有不顯著有助于Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w和Bcl2L10的抗凋亡活性的序列。Bcl-6或其兔同源物的功能部分通常是Bcl-6或其兔同源物的較短片段，這些較短片段能夠增加兔B細胞的復制壽命。[0049]8(31-6、8(3111、1^1-1、8(：1-2^1、8(311或此12110，或其兔同源物的功能衍生物分別被定義為:8(31-6、8(：131、]\^1-1、8(31-2^1、8(311或此12110蛋白或其兔同源物，其已經被改變但仍然具有(在性質上，而不一定在量上)增加兔B細胞的復制壽命的能力。以很多方式，例如通過保守氨基酸置換來提供功能衍生物，在該保守氨基酸置換中，一個氨基酸被另一個通常具有類似性質(大小、疏水性等)的氨基酸置換，這樣整體的功能不被嚴重影響。或者，功能衍生物例如包括融合蛋白，該融合蛋白具有可檢測的標記或具有誘導性化合物。[0050]本發明的另一方面解決了以下問題:將感興趣的核酸分子有效地引入到兔B細胞中。常規使用的雙嗜性(ampho)逆轉錄病毒載體適用于感染嚙齒類細胞(諸如鼠科細胞），因此預期該雙嗜性逆轉錄病毒載體也能轉導兔B細胞，但與預期相反，發明人發現了雙嗜性逆轉錄病毒載體顯示出不能有效地轉導兔B細胞;在兔B細胞中，雙嗜性載體在轉導后4天的轉導效率顯示低于1%。因此，本發明人不得不尋找其它的基因遞送工具。令人驚奇地是，發明人發現包括長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結構域的基因遞送工具，能夠高效率地轉導兔B細胞，在轉導后3~5天的轉導效率通常為80%~90%。這一性質是相當出乎意料的，因為長臂猿白血病病毒天然不感染兔。因此，并沒有預期兔細胞含有GALV包膜蛋白的受體；目前的發現僅是巧合。值得注意的是，盡管人類B細胞是靈長類細胞，含GALV包膜蛋白的胞外結構域的載體對人類B細胞的轉導效率，在轉導后4天通常為60%~70%，這常常低于該載體對兔B細胞的轉導效率。這是令人驚訝的，因為猿也是靈長類，因此與兔的細胞相比，預期含GALV類包膜蛋白的載體能更好地感染靈長類細胞。值得注意的是，使用包括GALV包膜蛋白的胞外結構域的載體確實不能有效轉導鼠科的B細胞，這與長臂猿白血病病毒不感染小鼠的事實一致。[0051]現在，本發明的發現提供了可以使用GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分來有效轉導兔B細胞，并且轉導效率甚至高于人類B細胞的轉導效率，從而可以提供新的應用。現在，可以將感興趣的核酸分子高效率地引入到兔B細胞中，這對于產生根據本發明的離體兔B細胞培養物是特別有利的。因此，本發明的優選實施方式提供了增加兔B的細胞的復制壽命的方法，該方法包括：[0052]-在兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達；以及[0053]-在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持至少一種抗凋亡的核酸的表達，[0054]其特征在于，經由基因遞送工具的轉導，向所述兔B細胞提供編碼Bcl-6的核酸分子，或編碼其兔同源物的核酸分子，或編碼其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或提供至少一種抗凋亡的核酸分子;所述基因遞送工具包括:長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結構域，或所述胞外結構域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結構域具有至少70%序列同一性的蛋白，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白。在一個優選實施方式中，所述胞外結構域是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白的胞外結構域。所述胞外結構域優選包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL。優選地，所述序列同一性是至少75%、更優選至少80%、更優選至少81%、更優選至少82%、更優選至少83%、更優選至少84%、更優選至少85%、更優選至少86%、更優選至少86%、更優選至少87%、更優選至少88%、更優選至少89%、更優選至少90%、更優選至少91%、更優選至少92%、更優選至少93%、更優選至少94%、更優選至少95%、更優選至少96%、更優選至少97%、更優選至少98%、更優選至少99%、更優選100%。[0055]如本領域技術人員應理解的，所述胞外結構域優選也位于基因遞送工具的表面(包膜)處，用于轉導兔B細胞，其中胞外結構域位于野生型長臂猿白血病病毒的表面(包膜）處以便可結合宿主細胞。在一個特別優選的實施方式中，所使用的載體或其它基因遞送工具包括包膜蛋白，該包膜蛋白含胞外結構域和GALV包膜蛋白的跨膜結構域，或其功能部分，該跨膜結構域與雙嗜性包膜蛋白的胞質結構域融合。如在實施例中所示，這樣允許對兔B細胞進行特別有效的轉導。[0056]如本文所使用的，"GALV包膜蛋白的胞外結構域的功能部分"指所示胞外結構域中仍然能夠結合兔B細胞，從而介導兔B細胞的感染和/或轉導的部分。這樣的功能部分可能缺少一個或多個氨基酸殘基，所述氨基酸殘基對于兔B細胞的結合、感染和/或轉導不是必需的。[0057]當然，由于提供本發明的發現，因此可使用GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分，向兔B細胞轉導任意感興趣的核酸分子。因此，進一步提供了與GALV包膜蛋白的胞外結構域結合的分離或重組的兔B細胞，或與所述胞外結構域的至少一個功能部分結合的分離或重組的兔B細胞，或與GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白結合的分離或重組的兔B細胞。本文還提供了如下的分離或重組的兔B細胞，該分離或重組的兔B細胞經由GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分，或經由與GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白，與基因遞送工具結合。在一個優選的實施方式中，所述胞外結構域是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白的胞外結構域。所述胞外結構域優選包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL。再次，所述序列同一性優選是至少75%、更優選至少80%、更優選至少81%、更優選至少82%、更優選至少83%、更優選至少84%、更優選至少85%、更優選至少86%、更優選至少86%、更優選至少87%、更優選至少88%、更優選至少89%、更優選至少90%、更優選至少91%、更優選至少92%、更優選至少93%、更優選至少94%、更優選至少95%、更優選至少96%、更優選至少97%、更優選至少98%、更優選至少99%、更優選100%。所述基因遞送工具優選包括感興趣的核酸分子，優選編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和/或抗凋亡的核酸序列。使用這樣的基因遞送工具，可產生根據本發明的穩定的兔B細胞培養物。所述抗凋亡的核酸序列優選是Bcl2家族的抗凋亡基因，最優選選自由Bcl-xL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w、Bcl2L10,及其兔同源物，及其功能部分和功能衍生物所組成的組。[0058]本文還提供了GALV包膜蛋白的胞外結構域，或其能結合兔B細胞的至少一個功能部分在將感興趣的核酸分子引入到兔B細胞中的應用，以及與GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分有至少7〇%序列同一性的蛋白在將將感興趣的核酸分子引入到兔B細胞中的應用。進一步提供了包括GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分的基因遞送工具，或包括與GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白的基因遞送工具在增加兔B細胞的復制壽命中的應用，所述基因遞送工具進一步包括編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和至少一種抗凋亡的核酸序列。在一個優選實施方式中，所述胞外結構域是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白的胞外結構域。所述胞外結構域優選包括序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPffFTTLLo[0059]圖9中示出了在實施例中也使用的優選的嵌合包膜蛋白。該嵌合包膜蛋白含有GALV包膜蛋白非胞外結構域（具有序列MVLLPGSMLLTSNLHHLRHQMSPGSWKRLIILLSCVFGGGGTSLQNKNPHQPMTLTffQVLSQTGDVVffDTKAVQPPffTffffPTLKPDVCALAASLESWDIPGTDVSSSKRVRPPDSDYTAAYKQITWGAIGCSYPRARTRMASSTFYVCPRDGRTLSEARRCGGLESLYCKEWDCETTGTGYffLSKSSKDLITVKffDQNSEffTQKFQQCHQTGffCNPLKIDFTDKGKLSKDffITGKTWGLRFYVSGHPGVQFTIRLKITNMPAVAVGPDLVLVEQGPPRTSLALPPPLPPREAPPPSLPDSNSTALATSAQTPTVRKTIVTLNTPPPTTCDRLFDLVQGAFLTLNATNPGATESCWLCLAMGPPYYEAIASSGEVAYSTDLDRCRWGTQGKLTLTEVSGHGLCIGKVPFTHQHLCNQTLSINSSGDHQYLLPSNHSffffACSTGLTPCLSTSVFNQTRDFCIQVQLIPRIYYYPEEVLLQAYDNSHPRTKREAVSLTLAVLLGLGITAGIGTGSTALIKGPIDLQQGLTSLQIAIDADLRALQDSVSKLEDSLTSLSEVVLQNRRGLDLLFLKEGGLCAALKEECCFYIDHSGAVRDSMKKLKEKLDKRQLERQKSQNWYEGWFNNSPWFTTLL，在圖9中以粗體所示）和GALV包膜蛋白的跨膜結構域（具有序列STIAGPLLLLLLLLILGPCII，在圖9中以下劃線所示），與雙嗜性包膜蛋白的胞質結構域(具有序列NRLVQFVKDRISVVQALVLTQQYHQLKPIEYEP，在圖9中以斜體和點下劃線所示)融合。包括該優選的嵌合包膜蛋白的載體或其它基因遞送工具能特別有效地將感興趣的核酸分子引入到兔B細胞中。[0060]因此，進一步提供了一種分離或重組的兔B細胞，該分離或重組的兔B細胞與圖9所示的嵌合包膜蛋白結合，或與包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白結合，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白結合。本文還提供了一種分離或重組的兔B細胞，該分離或重組的兔B細胞經由圖9所示的嵌合包膜蛋白，或經由包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或經由與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白與載體或其它基因遞送工具結合。[0061]這樣的載體或其它基因遞送工具特別適用于使用感興趣的核酸分子轉導兔B細胞。因此，進一步提供了圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白，在將感興趣的核酸分子引入到兔B細胞中的應用。[0062]這樣的載體或其它基因遞送工具特別適用于增加兔B細胞的復制壽命。因此，進一步提供了一種增加兔B細胞的復制壽命的方法，該方法包括：[0063]-在兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達;以及[0064]-在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持至少一種抗凋亡的核酸的表達，[0065]其特征在于，經由載體或其它基因遞送工具的轉導，向所述兔B細胞提供編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或至少一種抗凋亡的核酸分子;所述載體或其它基因遞送工具包括圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白。[0066]還提供了基因遞送工具在增加兔B細胞的復制壽命中的應用，所述基因遞送工具包括圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白，所述基因遞送工具進一步包括編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，以及至少一種抗凋亡的核酸分子。[0067]要強調的是，盡管基于GALV的基因遞送工具非常適于使用一種或多種感興趣的核酸分子，諸如Bcl-6和抗凋亡的核酸分子，來有效轉導兔B細胞，但是基于GALV的基因遞送工具對于獲得具有20小時或更短的短倍增時間的兔B細胞并不是強制性的。也可使用其它基因遞送工具將Bcl-6和抗凋亡的核酸分子引入到兔B細胞中（盡管效率常常較低），以產生具有小于20小時或更短的倍增時間的兔B細胞。只要Bcl-6和抗凋亡的核酸分子被引入到兔B細胞中，就可獲得快速生長的B細胞培養物，但較低量的初始轉導的兔B細胞長起來可能花費較長時間。使用能有效轉導兔B細胞的基因遞送工具(諸如本文所述的基于GALV的基因遞送工具）的優點在于，會轉導較高比例的初始分離的B細胞，這樣由此獲得的B細胞存在于得到的B細胞培養物中。與其中使用轉導效率較低的基因遞送工具的情況相比，使用能有效轉導兔B細胞的基因遞送工具在B細胞培養物內得到B細胞的更高的多樣性，因為在使用轉導效率較低的基因遞送工具的情況中，轉導了較低比例的初始B細胞。在得到的B細胞培養物內存在B細胞的更高的多樣性，改進了分離出具有期望性質的一個或多個B細胞的可能性。因此，原則上講，基因遞送工具的轉導效率越高，得到的B細胞培養物內的B細胞的多樣性就越尚。[0068]為了誘導兔B細胞中的表達，感興趣的核酸分子優選與啟動子可操作地連接。非限制性實例包括CMV啟動子和CAG啟動子。在一個方面，這樣的啟動子是誘導性的，這意味著它的活性受到至少一種化合物的影響，諸如轉錄因子。[0069]如本文所使用的，術語"基因遞送工具"指能夠將核酸分子轉移到宿主細胞中的任意化合物。基因遞送工具的非限制性實例包括(病毒)載體和質粒。術語"包括GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分的基因遞送工具"指包括GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一部分的基因遞送工具，其中，所述胞外結構域或其一部分能夠結合兔B細胞，以便核酸可被引入到所述兔B細胞中。如前文所述，所述胞外結構域或其一部分優選位于基因遞送工具的表面，以便它可結合兔B細胞上的受體。同樣，如果根據本發明的基因遞送工具包括與GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分有至少70%序列同一性的蛋白，則所述蛋白優選位于所述基因遞送工具的表面，以便它可結合兔B細胞上的受體。[0070]氨基酸或核酸序列的同一性的百分比，或術語"％序列同一性"在本文中被定義為:在比對兩條序列并且引入空位(如果需要）以實現最大的同一性百分比之后，在候選氨基酸或核酸序列中與參照序列中的殘基相同的殘基的百分比。用于進行比對的方法和計算機程序在本領域中是公知的，例如"Align2"。[0071]GALV包膜蛋白是在長臂猿白血病病毒的病毒包膜中天然存在的并且參與宿主細胞感染的蛋白。靶點特異性通常由包膜蛋白來確定。在一個實施方式中，所述包膜蛋白是GALV毒株SEAT0的包膜蛋白。含GALV包膜蛋白的逆轉錄病毒載體在本領域中是已知的，并且可使用分子生物學領域中常用的程序來產生，例如參見Lametal.、1996。[0072]術語"與啟動子可操作地連接"指感興趣的核酸序列與啟動子足夠接近，以便啟動子可影響感興趣的核酸序列的表達。通常，這樣的啟動子誘導或增加所述感興趣的核酸的表達。術語"表達活性"指上述表達的誘導或增強。[0073]如前文所提到的，本發明提供了如下發現:可獲得平均倍增時間比目前已知的人類或鼠科B細胞培養物短的離體兔B細胞培養物。這是更令人吃驚的，因為在本發明的實施例中使用了非兔化合物，諸如人類Bcl-6核酸序列、鼠科IL21和人類CD40L。如實施例中所不，本發明人使用含人類Bcl-6核酸序列和人類Bcl-xL或Mcl-1序列的核酸分子，轉導了兔B細胞。即使使用人類序列，并且在鼠科IL21和人類CD40L的存在下培養兔細胞，兔B細胞令人吃驚地表現出比人類或鼠科的B細胞更塊的增殖，并且生產出更多的抗體。[0074]因此，根據本發明，使用人類和鼠科的化合物，兔B細胞增殖非常好。在這些反應條件下，兔B細胞的增殖甚至比人類和鼠科的B細胞還好。除其它事項外，這具有以下優點：不必對目前使用的用于人類B細胞的反應條件進行調整，以使其適用于兔B細胞。無需獲得兔IL21、兔CD40,或兔的編碼Bcl-6的核酸序列或抗凋亡基因。而是可使用目前可獲得的人類或鼠科的化合物。因此，本發明的一個方面提供了一種增加兔B細胞的復制壽命的方法，該方法包括：[0075]-在兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達;以及[0076]-在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持抗凋亡的核酸的表達，[0077]其特征在于，向所述兔B細胞提供選自由以下分子組成的組中的至少一種核酸分子：[0078]*編碼非兔的Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸分子;和[0079]*非兔的抗凋亡的核酸分子。[0080]優選地，所述非兔的核酸分子是人類核酸分子，因為人類Bcl-6和人類抗凋亡序列似乎在兔B細胞中提供了特別好的結果。在特別優選的實施方式中，向兔B細胞提供編碼人類Bcl-6的核酸分子以及人類抗凋亡的核酸分子，優選人類Bcl-xL或人類Mcl-1或人類Bcl-2或人類A1或人類Bcl-w或人類Bcl2L10。[0081]進一步地，提供了根據本發明的方法，該方法進一步包括向所述兔B細胞提供IL21和⑶40L。優選地，使用非兔IL21和/或非兔⑶40L。優選地，所述IL21是鼠科或人類IL21，最優選鼠科IL21。在另一優選的實施方式中，所述CD40L是鼠科或人類CD40L，最優選人類CD40L。[0082]除了增加Bcl-6的表達和抗凋亡的核酸分子的表達之外，還有利地誘導、增強和/或維持兔B細胞中的Blimp-1或其兔同源物的表達。這增強了所述B細胞的抗體生產。因此，一個方面提供了根據本發明的方法，其中，該方法進一步包括在所述兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Blimp-1或其兔同源物的表達。[0083]通過多種方式，調節兔B細胞中的Blimp-1或其兔同源物的表達程度。在一個實施方式中，向兔B細胞提供能直接或間接增加Blimp-1表達或其兔同源物表達的化合物。此外，或可替代的，在能直接或間接增加Blimp-1表達或其兔同源物表達的化合物的存在下，培養兔B細胞。因此，進一步提供了根據本發明的方法，該方法進一步包括：[0084]-向所述兔B細胞提供能直接或間接增加Blimp-1表達或其兔同源物表達的化合物;和/或[0085]-在能直接或間接增加Blimp-1表達或其兔同源物表達的化合物的存在下，培養兔B細胞。[0086]能增加Blimp-1的表達或其兔同源物的表達的所述化合物最優選包括IL21。因此，在本發明的一個優選實施方式中，至少在部分培養時間的過程中，在IL21的存在下，培養兔B細胞。[0087]在另一實施方式中，能增加Blimp-1表達的所述化合物包括信號轉導和轉錄活化因子3(STAT3)蛋白或其功能部分或功能衍生物，和/或編碼STAT3蛋白或其功能部分或功能衍生物的核酸分子。STAT3是信號轉導因子，參與B細胞的發育和分化。STAT3能夠上調Blimp-1的表達。在一個優選的實施方式中，向兔B細胞提供編碼STAT3或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，其中，所述核酸分子的表達受到阻抑因子的外源性誘導因子的調節，以便對STAT3的表達程度進行隨意調節。例如，使用之前提到的誘導性表達系統中的一種。在一個實施方式中，使用包括STAT3或其功能部分或功能衍生物與ER的融合產物。例如，向兔B細胞提供編碼雌激素受體(ER)和STAT3作為融合蛋白ER-STAT3的核酸分子。該融合蛋白是沒有活性的，因為它與細胞質中的熱休克蛋白形成復合體。這樣，STAT3不能到達細胞核，因此不增強Blimp-1的表達。當給予外源性誘導因子4羥基三苯氧胺（4HT)時，融合蛋白ER-STAT3與熱休克蛋白解離，以便STAT3能進入細胞核并且活化Blimp-1的表達。[0088]如本文所使用的，STAT3的功能部分被定義為與天然STAT3相比，在性質上，而不一定在量上，具有相同的增加Blimp-1或其兔同源物表達能力的STAT3片段。這樣的功能部分例如沒有不參與或僅非常少地參與所述能力的氨基酸。[0089]STAT3的功能衍生物被定義為STAT3蛋白，該STAT3蛋白已經被改變了，但仍然維持了它（在性質上，而不一定在量上)增加Blimp-1或其兔同源物表達的能力。以很多方式，例如通過保守氨基酸置換來提供功能衍生物，在該保守氨基酸置換中，一個氨基酸被另一個通常具有類似性質（大小、疏水性等）的氨基酸置換，這樣不嚴重影響整體的功能。或者，功能衍生物例如包括融合蛋白，該融合蛋白具有可檢測的標記或具有誘導性化合物。[0090]因為STAT3能夠增加B1imp-1的表達，或增加它的兔同源物的表達，因此還可以通過給予能增加STAT3的活性和/或表達的化合物，來間接增加Blimp-1或其兔同源物的表達。在一個實施方式中，向兔B細胞提供能增強STAT3活性的化合物，以便間接增強Blimp-1或其兔同源物的表達。[0091]以很多方式來活化STAT3。優選地，通過向兔B細胞提供細胞因子，來活化STAT3。天然參與B細胞分化的細胞因子在調節STAT蛋白中是非常有效的。STAT3的非常有效的活化因子是IL21和IL6,但是還已知112、117、1110、1115和1127活化31413。此外，參與天然免疫的Toll樣受體(TLR)也能活化STAT3。因此，一個實施方式提供了根據本發明的方法，其中，在1121、112、116、117、1110、1115和/或1127的存在下，培養所述兔8細胞。最優選使用1121，因為IL21特別適用于增強根據本發明的兔B細胞培養物的抗體生產。甚至當BCL6阻礙Blimp-1表達時，IL21也能上調Blimp-1的表達。[0092]進一步地，或可替代地，使用突變的Janus激酶(JAK)或JAK的突變的兔同源物，來活化STAT3。在JAK自身被至少一種細胞因子活化之后，JAK天然能使STAT3磷酸化。能不依賴于細胞因子的存在而活化STAT3的突變的Janus激酶或JAK的突變的兔同源物，特別適用于根據本發明的方法中。[0093]在又一實施方式中，通過向兔B細胞提供細胞因子信號傳導抑制因子(S0CS)蛋白或其兔同源物，和/或通過活化所述細胞內的S0CS蛋白或其兔同源物，來增加Blimp-1或其兔同源物的表達。可替代地，或進一步地，使用E蛋白E47、E12、E2-2和HEB中的至少一種，來增加Blimp-1或其兔同源物的表達。E47是屬于螺旋-環-螺旋蛋白家族的轉錄因子，被命名為E蛋白。有四種E蛋白，E12、E47、E2-2和HEB，參與淋巴細胞發育。E12和E47由一個基因（被命名為E2A)編碼，該基因進行不同的剪接。E蛋白已經被描述為腫瘤抑制因子。E47的特異性靶點之一是Socsl和Socs3基因。[0094]因此，一個方面提供了根據本發明的方法，該方法通過向兔B細胞提供能直接或間接增加Blimp-1或其兔同源物表達的化合物，和/或在能直接或間接增加Blimp-1或其兔同源物表達的化合物存在下培養所述B細胞，來進一步增加兔B細胞中的Blimp-1或其兔同源物的表達，其中所述化合物包括：[0095]-STAT3，或其功能部分或功能衍生物，和/或[0096]_能活化STAT3的化合物，和/或[0097]_能增強STAT3表達的化合物，和/或[0098]-比21、112、116、117、1110、1115、1127、50〇5蛋白、￡蛋白￡47、￡12、￡2-2或冊8之一、突變的Janus激酶、和/或編碼STAT3或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的核酸序列。[0099]最優選地，所述化合物是IL21。[0100]本發明進一步提供了根據本發明的方法可獲得的分離或重組的兔B細胞。上述分離或重組的兔B細胞優選包括外源性抗凋亡的核酸序列，以及編碼Bcl-6或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列。因此，進一步提供了分離或重組的兔B細胞，該分離或重組的兔B細胞包括編碼Bcl-6或其兔同源物或功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列，以及外源性抗凋亡的核酸序列。如之前所述，所述外源性核酸分子含有在兔B細胞中不是天然出現的核酸序列，或者含有天然兔B細胞核酸序列的額外的拷貝。Bcl-XL、Mcl-l、8(31-2^1、8〇1-?和此121^10，及其兔同源物是優選的抗凋亡的核酸分子。因此，一個優選方面提供了分離或重組的兔B細胞，該分離或重組的兔B細胞包括:編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列;和，編碼Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10,或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的外源性核酸序列。[0101]所述編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和所述外源性抗凋亡的核酸序列可存在于一個核酸分子上。或者，這些序列存在于至少兩個不同的核酸分子上。[0102]如之前所述，優選使用非兔的序列。因此，優選實施方式提供了分離或重組的兔B細胞，該分離或重組的兔B細胞包括:非兔的抗凋亡的核酸序列，和編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的非兔的核酸序列。所述非兔的核酸序列優選含有人類序列。[0103]在特別優選的實施方式中，提供了分離或重組的兔B細胞，該分離或重組的兔B細胞包括：[0104]-編碼人類Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和[0105]-人類抗凋亡的核酸序列，該人類抗凋亡的核酸序列優選編碼人類Bcl-xL或人類Mcl-1或人類Bcl-2或人類A1或人類Bcl-w或人類Bcl2L10,或其功能部分或功能衍生物。再次，所述編碼Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和所述抗凋亡的核酸序列可存在于一個核酸分子上，或可替代的，這些序列可存在于至少兩個不同的核酸分子上。[0106]本發明還提供了通過本發明的方法可獲得的離體兔B細胞培養物。重要的優點在于以下事實:現在獲得的離體B細胞培養物具有短的平均倍增時間。因此提供了具有20小時或更短的平均倍增時間的離體兔B細胞培養物。進一步優選的實施方式提供了離體兔B細胞培養物，該離體兔B細胞培養物包括根據本發明的兔B細胞。所述兔B細胞優選包括:編碼人類Bcl-6或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和抗凋亡的核酸序列。還提供了離體兔B細胞培養物，該離體兔B細胞培養物包括在非兔IL21和/或非兔CD40L的存在下的兔B細胞。優選地，所述IL21是鼠科或人類IL21，最優選是鼠科IL21。在另一優選實施方式中，所述⑶40L是鼠科或人類⑶40L，最優選是人類⑶40L。[0107]還提供了通過本發明的方法獲得的抗體，以及由根據本發明的兔B細胞生產的抗體，或由根據本發明的離體兔B細胞培養物生產的抗體。上述抗體尤其可用于治療或診斷應用。優選地，所述抗體是單克隆抗體。[0108]在下面的實施例中，對本發明進行了進一步的解釋。這些實施例并不限制本發明的范圍，僅用于闡明本發明。【具體實施方式】[0109]實施例[0110]實施例1[0111]B細胞的轉導[0112]通過傳統方法，如磷酸鈣沉淀、脂質體形成或電穿孔，將基因轉移到淋巴細胞中是效率低的，但更重要的是，常常缺少穩定的基因整合。然而，如果選擇了適當的病毒包膜，病毒轉導直接導致基因穩定地整合到靶細胞的基因組中，并且效率非常高。逆轉錄病毒和慢病毒轉導都適用于有效的基因轉移。雖然逆轉錄病毒整合依賴于細胞分裂，慢病毒轉導也可用于不分裂的細胞，如血漿B細胞。重組的逆轉錄病毒的大規模制備可以很容易地通過使用穩定的生產細胞系，諸如Phoenix表達平臺（KinsellaandNolan,1996)來實現。高滴度的慢病毒的生產傾向于更加繁瑣，這主要是因為表達的病毒蛋白和包膜的毒性。[0113]對于本實施例，我們使用了基于莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)的平臺，該平臺使用雙嗜性或表達長臂猿白血病病毒(GALV)包膜的生產細胞(Wilsonetal.，1995)。在我們的基于GALV的載體中，GALV毒株SEAT0包膜蛋白的跨膜結構域與兩性包膜蛋白的胞質結構域融合(圖9)。[0114]建立轉移載體，以便Bcl-6、Bcl-XL和綠色熒光蛋白（GFP)標記物蛋白從同一病毒RNA同時翻譯出來（圖8)。通過使"自剪切的"2A肽序列（Szymczaketal.,2004)位于BCL-6和BCL-xL編碼區之間，并且使內部核糖體進入序列（IRES)位于GFP報告基因上游，來實現該多順反子途徑。病毒轉導效率是高且無偏向性的。[0115]永生化兔B細胞的生成[0116]使用如Kwakkenbosetal.,2010和專利申請W02007/067046所述的BCL-6/Bcl-xL技術，使人類記憶B細胞永生化。簡單來講，使用聚蔗糖(fico11)密度梯度從兔血液中分離出PBMC，并且使用識別Ig(IgGH+L:IgG重鏈和k和A輕鏈）的抗體，有時與IgM特異性抗體組合，對Ig表達進行染色。使用FACS分選儀分離出（Ig陽性，或Ig陽性+IgM陰性)B細胞，并且在穩定表達⑶40L(⑶40L-L細胞，105細胞/ml)的y輻照(50Gy)的小鼠L細胞成纖維細胞上，與重組的小鼠白介素（IU-21-起刺激36~48小時。收獲細胞，并且使用沒有FCS的培養基進行沖洗，然后將細胞轉移至Retronectin?(Takara，Shiga，日本)包被的組織培養板，在該組織培養板上，使用含BCL-6、Bcl-xL和作為報告蛋白的GFP的逆轉錄病毒載體轉導這些細胞。可替代地，使用含BCL-6、Mcl-l和GFP的逆轉錄病毒載體轉導細胞。使用表達⑶40配體的L細胞和IL-21，維持轉導的B細胞的培養。在圖1中，對比了在轉導后4天時，GALV和雙嗜型逆轉錄病毒的轉導效率。與GALV型逆轉錄病毒轉導后80%的細胞被轉導相比，使用雙嗜型逆轉錄病毒僅0.8%的細胞被轉導了。很明顯，對于轉導兔B細胞，GALV型逆轉錄病毒比雙嗜型逆轉錄病毒優秀。[0117]實施例2[0118]細胞培養[0119]我們將B細胞(2X105細胞/ml)維持在含8%FBS和青霉素-鏈霉素(Roche)，且補充有重組的小鼠白介素21(IL-21)(50ng/ml)的伊氏改良的杜氏培養基（Iscove'smodifiedDulbecco'smedium，Gibco)中，并且將它們培養在穩定表達⑶40L的y福照（50Gy)的小鼠L細胞成纖維細胞(CD40L-L細胞，105細胞/ml)上。為了確定細胞的倍增時間，將細胞以50~100.000細胞/孔的密度，與⑶40L-L細胞和IL-21-起培養在24孔板中。每3~4天對細胞進行計數，并且將50~100.000個細胞轉移至新的孔。圖2中，示出了來自兩位人類供體(89和93)的B細胞、一個美洲鴕B細胞樣品（美洲鴕)和一個轉導有GALV型逆轉錄病毒的兔B細胞樣品（Rb6XL)的生長曲線，該GALV型逆轉錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Bcl-xL的核酸分子。另外，示出了一個轉導有GALV型逆轉錄病毒的兔樣品（Rb6M)的生長曲線，該GALV型逆轉錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Mcl-1的核酸分子。轉導的兔B細胞具有19小時的平均倍增時間，因此生長的比人類或美洲鴕的B細胞快，其中人類或美洲鴕的B細胞的倍增時間在26小時至32小時之間。通過確定B細胞在數個3~4天的時間間隔中的增加，并且將獲得的結果進行平均，來初始計算這些平均倍增時間。隨后，計算在整個培養期的過程中的總平均倍增時間。這樣得到轉導的兔B細胞的平均倍增時間為18小時，轉導的人類B細胞的平均倍增時間為25~29小時，以及轉導的美洲鴕B細胞的平均倍增時間為27小時。這樣證明了我們的觀察，即我們的方法產生具有20小時或更短的平均倍增時間的兔B細胞培養物，而人類、鼠科和美洲鴕的B細胞通常具有在25小時至36小時之間的倍增時間。[0120]實施例3[0121]B細胞受體的表達和抗原特異性染色[0122]永生化的人類B細胞表達B細胞受體。該特性使得能夠對B細胞進行抗原特異性染色和分選。為了確定B細胞受體是否也在轉導的兔B細胞上表達，使用與兔IgG、兔IgM或兔IgA特異性反應的熒光標記的抗體，對B細胞克隆進行染色。將B細胞在冷(4°C)的細胞培養基中進行沖洗，并且在冰上、黑暗中與含免疫熒光標記的抗體孵育，該含免疫熒光標記的抗體對兔的IgG、IgM、IgA或標記的抗原具有特異性。之后，沖洗掉多余的標記的抗體或抗原，并且在FACS分析儀(Guavaeasycyte(Mi11ipore)或FACSAria3(BD))上，分析B細胞受體的表達。[0123]圖3中，使用特異性識別兔抗體同種型IgG、IgA或IgM的熒光標記的抗體，對不同同種型的三種不同B細胞克隆進行染色。很明顯，對于不同的兔抗體同種型，可對B細胞受體進行有效染色。因此，我們總結出，永生化的兔B細胞也表達B細胞受體。[0124]此外，還使用熒光標記的流感蛋白，對來自已用人類流感疫苗免疫的兔或未經處理的對照兔的流感特異性的B細胞進行染色（圖4)。使用熒光標記的H1、H3或流感B對兔B細胞進行染色，并且使用FACS分選儀以每孔1個細胞進行分選。[0125]實施例4[0126]-個細胞來源的克隆性兔B細胞培養物的發育。[0127]使用FACS分選儀以每孔一個細胞分選轉導的B細胞，并且在穩定表達CD40L(CD40L-L細胞，105細胞/ml)的y輻照（50Gy)的小鼠L細胞成纖維細胞與重組的小鼠白介素(IL)-21的存在下進行培養。每3~4天，添加新鮮的CD40L-L細胞和IL-21。在接種細胞(每孔一個細胞)后9天開始，在ELISA中分析上清液的兔免疫球蛋白G(IgG)的產生。為了進行對比，還平行分析了在人類B細胞克隆的上清液中的人類IgG。[0128]圖7中，描繪了從起始一個細胞培養后的9天開始，上清液中的抗體濃度隨時間的變化。確定了以下樣品的抗體濃度:兩位人類供體;和一個轉導有GALV型逆轉錄病毒的兔B細胞樣品，該GALV型逆轉錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Bcl-xL的核酸分子；以及一個轉導有GALV型逆轉錄病毒的兔B細胞樣品，該GALV型逆轉錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Mcl-1的核酸分子。來自兔的B細胞克隆在較短的時間段(分別為13~18天和15~20天）內產生30ng/ml和100ng/ml的IgG濃度。這提供了重要的優點，即與人類B細胞克隆相比，它允許更早地篩選兔B細胞克隆的感興趣的抗體。[0129]實施例5[0130]兔的免疫。[0131]使用在完全氟氏佐劑中的含15ugHlNl、15ugH3N2和15uginflB的人類流感疫苗，對兩只新西蘭白兔進行免疫。三周后，使用在不完全氟氏佐劑中的相同的疫苗對兔進行增強。在增強后五天，從兔取血，從血液中分離出B細胞，并且使用GALV型逆轉錄病毒(含有與雙嗜性包膜蛋白的胞質結構域融合的，GALV毒株SEATO包膜蛋白的胞外結構域和跨膜結構域)進行轉導，其中GALV型逆轉錄病毒攜帶含人類Bcl-6序列和人類Bcl-xL的核酸分子。將轉導的B細胞以不同的細胞密度接種到培養板中，并且如實施例4中所述進行培養。另外，使用疫苗的熒光標記的組分H1、H3或流感B對轉導的B細胞進行標記，并且使用FACS分選儀以每孔一個細胞進行分選，并且如實施例4中所述進行培養。分析培養細胞的上清液與完整疫苗或與它的各組分的結合。結果示于圖4~圖6中，并且示出：可通過以不同密度接種細胞(圖5)，在來自接種的兔的B細胞庫中鑒定出抗原特異性B細胞;并且，也可使用標記的抗原對細胞進行分選（圖4和圖6)，以非常有效地在來自接種的兔的B細胞庫中鑒定出抗原特異性B細胞。[0132]實施例6[0133]通過使用雙嗜型逆轉錄病毒引入基因Bcl-6和Bcl-xl，使兔B細胞永生化。[0134]可通過使用不同類型的載體，諸如實施例1中所示的GALV和雙嗜型逆轉錄病毒引入基因Bcl-6和Bcl-xl，實現兔B細胞的永生化。進一步追蹤轉導有雙嗜型逆轉錄病毒的B細胞的生長，以證實通過雙嗜型逆轉錄病毒引入Bcl-6和Bcl-xl也導致兔B細胞的永生化。與使用GALV型逆轉錄病毒轉導后的80%的細胞被轉導相比，使用雙嗜型逆轉錄病毒0.8%的細胞被轉導了（圖1和圖10)。轉導后十天，94%的轉導有雙嗜型逆轉錄病毒的細胞是GFP陽性的，這證明轉導的細胞比非轉導的細胞長的快(圖10)。[0135]為了確定細胞倍增時間，如實施例2中，將細胞以50~100.000細胞/孔的密度，與⑶40L-L細胞和IL-21-起培養在24孔板中。每3~4天對細胞進行計數，并且將50~100.000個細胞轉移至新的孔。圖11中，描繪了轉導有雙嗜性病毒的兔B細胞的生長曲線。計算的倍增時間是19小時，這與轉導有GALV型逆轉錄病毒的兔B細胞（18小時)相當。總之，盡管轉導效率比基于GALV的載體低很多，但通過雙嗜性逆轉錄病毒將Bcl-6和Bcl-xl引入到兔B細胞中，也得到兔B細胞的永生化。【附圖說明】[0136]圖1.[0137]兔記憶B細胞的轉導。基于Ig的表達，從PBMC中分離出兔B細胞。在⑶40LL細胞上，同時使用rm-IL-21，使細胞活化36~40小時。使用含BCL6和Bcl-xL的逆轉錄病毒載體轉導細胞。對GALV型逆轉錄病毒和雙嗜型逆轉錄病毒都進行了測試。然后，在重組的小鼠IL-21的存在下，將轉導的細胞培養在CD40L-L細胞上。在培養四天后，基于GFP的表達確定轉導效率。GALV型逆轉錄病毒示出比雙嗜型(0.8%)逆轉錄病毒優秀(80%)的轉導效率。[0138]圖2.[0139]分析兔B細胞的生長曲線，該兔B細胞轉導有含BCL6和Bcl-xL的逆轉錄病毒載體或含BCL6和Mcl-1的逆轉錄病毒載體。為了進行對比，平行分析了來自美洲駝細胞和來自兩位不同供體的人類細胞的B細胞的生長曲線，這些B細胞都轉導有相同的含BCL6和Bcl-xL的逆轉錄病毒載體。[0140]圖3.[0141]使用FACS，對三種不同的轉導Bcl-6Bcl-xL的兔B細胞克隆，檢測了IgG、IgM和IgA表面免疫球蛋白表達。[0142]圖4.[0143]在具有不同特異性的兔B細胞庫內，鑒定抗原特異性兔B細胞。[0144]圖5.[0145]獲得針對含15ugHlNl、15ugH3N2和15uginflB的人類流感疫苗的不同組分的抗原特異性兔抗體。使用人類流感疫苗對兔進行免疫和增強。使B細胞永生化，并且在重組的小鼠IL-21的存在下，以不同密度接種在384孔板中的CD40L-L細胞上。在ELISA中，篩選兔B細胞培養物上清液中存在的抗體的流感特異性。針對疫苗所有組分，觀察抗原特異性抗體。[0146]圖6.[0147]使用熒光標記的流感蛋白，對來自兔的永生化B細胞進行染色，其中兔經過含15ugHlNl、15ugH3N2和15uginflB的人類流感疫苗的免疫。使用FACSAria分選儀，將示出與流感蛋白結合的B細胞以每孔一個細胞的密度分選在384孔板中，在重組的小鼠IL-21的存在下的CD40L-L細胞上。為了流感特異性抗體，而在ELISA中對上清液進行篩選。高頻率地觀察到針對用于抗原特異性分選的疫苗組分的抗原特異性抗體。[0148]圖7.[0149]在不同時間點，克隆B細胞的上清液中的抗體濃度。在輻照的⑶40L-L細胞并且補充有小鼠IL-21的存在下，將人類、美洲駝和兔的轉導的B細胞以每孔一個細胞的密度進行接種。每3~4天，補充⑶40L-L細胞和IL-21。在培養過程中的不同時間點，在ELISA中分析各細胞的IgG濃度。每一測量在不同孔中進行。兔B細胞經含BCL6和Bcl-xL的逆轉錄病毒載體或含BCL6和Mcl-1的逆轉錄病毒載體轉導。其它所有細胞(人類和美洲駝)都經BCL6和Bcl-xL轉導。[0150]圖8.[0151]用于轉導兔和人類B細胞的載體的示意圖。[0152]圖9.[0153]與雙嗜性包膜蛋白的胞質結構域(斜體+點下劃線）融合的，GALVSEAT0包膜蛋白的胞外結構域的序列(粗體），和GALVSEAT0包膜蛋白的跨膜結構域(下劃線）。[0154]圖10.[0155]兔記憶B細胞的轉導，和轉導有雙嗜型逆轉錄病毒的兔B細胞的生長物。基于Ig的表達，從PBMC中分離出兔B細胞。在⑶40LL細胞上，同時使用rm-IL-21，使細胞活化36~40小時。使用含BCL6和Bcl-xL的逆轉錄病毒載體轉導細胞。對GALV型逆轉錄病毒和雙嗜型逆轉錄病毒都進行了測試。然后，在重組的小鼠IL-21的存在下，將轉導的細胞培養在CD40L-L細胞上。在培養四天后，基于GFP的表達確定轉導效率。GALV型逆轉錄病毒示出比雙嗜型(0.8%)逆轉錄病毒優秀(80%)的轉導效率。轉導后10天，基于GFP的表達，94%的轉導有雙嗜型逆轉錄病毒的細胞是永生化的，這示出轉導的細胞比非轉導的細胞長的快。[0156]圖11.[0157]分析了兔B細胞的生長曲線，該兔B細胞轉導有含BCL6和Bcl-xL的雙嗜型逆轉錄病毒載體。[0158]參考文件[0159]Christopherson,K.S.etal.PNAS89,6314-8(1992)[0160]Guzman,L.M.etal.Bacteriol177,4121-4130(1995)[0161]T.M.Kinsella，G.P.Nolan，HumGeneTher7(1996)1405.[0162]Kwakkenbosetal.Generationofstablemonoclonalantibody-producingBcellreceptor-positivehumanmemoryBcellsbygeneticprogramming.NatureMedicine(2010)vol.l6(l)pp.123-8[0163]Lametal.Improvedgenetransferintohumanlymphocytesusingretroviruseswiththegibbonapeleukemiavirusenvelope.Humangenetherapy7(1996)1415-1422[0164]A.L.SzymczakjC.J.Workman,Y.Wang,K.M.Vignali,S.Dilioglou,E.F.Vanin,D.A.A.Vignali,NatBiotechnol22(2004)589.[0165]C.A.Wilson，M.V.Eiden，W.B.Anderson，C.Lehel，Z.01ah，JVirol69(1995)534.[0166]W02007/067046【主權項】1.兔B細胞在獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細胞培養物中的應用。2.-種獲得具有20小時或更短的平均倍增時間的離體B細胞培養物的方法，所述方法包括：在B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達；以及在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持至少一種抗凋亡的核酸分子的表達，其特征在于，所述B細胞是兔B細胞。3.-種用于增加兔B細胞的復制壽命的方法，所述方法包括：在兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達；以及在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持至少一種抗凋亡的核酸的表達，其特征在于，經由基因遞送工具的轉導，向所述兔B細胞提供編碼Bcl-6、或其兔同源物、或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或提供至少一種抗凋亡的核酸分子;所述基因遞送工具包括長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白。4.長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白，在將感興趣的核酸分子引入到兔B細胞中的應用。5.-種獲得抗體的方法，包括：在兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Bcl-6或其兔同源物的表達；在所述B細胞中，誘導、增強和/或維持至少一種抗凋亡的核酸分子的表達；離體培養所述B細胞；以及在7~14天內，優選在9~12天內，收獲由所述B細胞生產的抗體。6.根據權利要求2、3或5中任一項所述的方法，其特征在于，向所述兔B細胞提供：編碼非兔的Bcl-6，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或至少一種非兔的抗凋亡的核酸分子。7.根據權利要求6所述的方法，其中，所述非兔的核酸分子是人類的核酸分子。8.根據權利要求2~3或5~7中任一項所述的方法，其中，所述至少一種抗凋亡的核酸分子包括Bcl2家族的基因，所述Bcl2家族的基因優選選自由Bcl-χL、Mcl-l、Bcl-2、Al、Bcl-w、BC12L10、及它們的兔同源物和它們的功能部分和它們的功能衍生物組成的組。9.根據權利要求2~3或5~8中任一項所述的方法，其中，所述方法還包括在所述兔B細胞中，誘導、增強和/或維持Blimp-Ι或其兔同源物的表達。10.根據權利要求2~3或5~9中任一項所述的方法，進一步包括向所述兔B細胞提供IL21和CD40L。11.根據權利要求10所述的方法，其中，所述IL21是小鼠或人類的IL21，和/或，其中，所述⑶40L是小鼠或人類的⑶40L。12.根據權利要求2~3或5~11中任一項所述的方法，包括：向所述兔B細胞提供能直接或間接增強Bcl-6的表達或其兔同源物的表達的化合物；和/或在能直接或間接增強Bcl-6的表達或其兔同源物的表達的化合物的存在下，培養所述兔B細胞。13.根據權利要求2~3或5~12中任一項所述的方法，包括：向所述兔B細胞提供能直接或間接增強Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10和/或其兔同源物的表達的至少一種化合物;和/或在能直接或間接增強Bcl-xL和/或Mcl-1和/或Bcl-2和/或A1和/或Bcl-w和/或Bcl2L10和/或其兔同源物的表達的至少一種化合物的存在下，培養所述兔B細胞。14.根據權利要求2~3或5~13中任一項所述的方法，進一步包括：向所述兔B細胞提供能直接或間接增加Blimp-Ι的表達或Blimp-Ι的兔同源物的表達的至少一種化合物;和/或在能直接或間接增加Blimp-Ι的表達或Blimp-Ι的兔同源物的表達的至少一種化合物的存在下，培養所述兔B細胞。15.-種分離或重組的兔B細胞，所述分離或重組的兔B細胞與長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分結合，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白結合。16.根據權利要求15所述的兔B細胞，所述兔B細胞經由GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分，或經由與所述GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白，與基因遞送工具結合，其中所述基因遞送工具包括編碼Bcl-6，或其兔同源物，或其功能部分或功能衍生物的核酸分子，和/或抗凋亡的核酸序列。17.根據權利要求16所述的兔B細胞，其中，所述抗凋亡的核酸序列是編碼選自下組中的蛋白的核酸序列:8(31-6、8(3131^、]\^1-1、8(31-2^1、8(311、8(3121^10，它們的兔同源物，它們的功能部分，它們的功能衍生物，和它們的任意組合。18.-種分離或重組的兔B細胞，包括：非兔的抗凋亡的核酸分子，所述非兔的抗凋亡的核酸分子優選編碼Bcl-xL或Mcl-1或Bcl-2或A1或Bcl-w或Bcl2L10或其功能部分或功能衍生物;和非兔的核酸分子，所述非兔的核酸分子編碼Bcl-6或其功能部分或功能衍生物。19.根據權利要求18所述的兔B細胞，其中，所述非兔的核酸序列是人類的核酸序列。20.-種離體的兔B細胞培養物，所述離體的兔B細胞培養物具有20小時或更短的平均倍增時間。21.-種離體的兔B細胞培養物，包括根據權利要求18或19所述的兔B細胞。22.-種離體的兔B細胞培養物，所述離體的兔B細胞培養物通過根據權利要求2~3或5~14中任一項所述的方法獲得。23.-種抗體，所述抗體通過根據權利要求2~3或5~14中任一項所述的方法獲得。24.-種抗體，所述抗體由根據權利要求18或19所述的兔B細胞生產或由根據權利要求20~22中任一項所述的離體的兔B細胞培養物生產。25.-種基因遞送工具在增加兔B細胞的復制壽命中的應用，其中所述基因遞送工具包括：長臂猿白血病病毒(GALV)包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分，或與所述GALV包膜蛋白的胞外結構域的至少一個功能部分具有至少70%序列同一性的蛋白；以及，編碼Bcl-6或其兔同源物或其功能部分或功能衍生物的核酸序列，和/或至少一種抗凋亡的核酸序列。26.根據權利要求3所述的方法，或根據權利要求4所述的應用，或根據權利要求15或16所述的兔B細胞，或根據權利要求25所述的應用，其中，所述胞外結構域是GALV毒株SEATO的包膜蛋白的胞外結構域。27.根據權利要求3所述的方法，或根據權利要求16所述的兔B細胞，或根據權利要求25所述的應用，其中，所述基因遞送工具包括如圖9所示的嵌合包膜蛋白，或包括如圖9所示的嵌合包膜蛋白的蛋白，或與如圖9所示的嵌合包膜蛋白具有至少70%序列同一性的蛋白。【文檔編號】C12N15/867GK106029873SQ201480076247【公開日】2016年10月12日【申請日】2014年12月24日【發明人】保利娜·瑪麗亞·威爾荷米娜·范赫爾登,M·J·克瓦肯博斯,H·斯皮茨,T·博蒙特【申請人】埃姆醫療有限公司