用于檢測人丙型肝炎病毒的引物組和探針的制作方法
【專利摘要】本發明涉及用于特異性檢測人丙型肝炎病毒(HCV)的引物組和/或探針。本發明還涉及包含引物組和/或探針的用于特異性檢測人丙型肝炎病毒的試劑盒和微陣列。本發明還涉及引物組和/或探針在制備用于特異性檢測樣品中丙型肝炎病毒的試劑盒和微陣列中的用途。本發明還涉及使用引物組和/或探針檢測樣品中HCV基因的方法。
【專利說明】
用于檢測人丙型肝炎病毒的引物組和探針
技術領域
[0001] 本發明設及用于特異性檢測人丙型肝炎病毒化CV)的引物組和/或探針。本發明還 設及包含引物組和/或探針的用于特異性檢測人丙型肝炎病毒的試劑盒和微陣列。本發明 還設及引物組和/或探針在制備用于特異性檢測樣品中丙型肝炎病毒的試劑盒和微陣列中 的用途。本發明還設及使用引物組和/或探針檢測樣品中HCV基因的方法。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎是一種主要經血液傳播的疾病，丙型肝炎的傳染源主要為急性臨床型和 無癥狀的亞臨床病人、慢性病人和病毒攜帶者。一般病人發病前12天，其血液即有感染性， 并可帶毒12年W上。HCV主要經血源傳播，國外30-90%輸血后肝炎為丙型肝炎，我國輸血后 肝炎中丙型肝炎占1/3。此外還可通過其他方式如母嬰垂直傳播，家庭日常接觸和性傳播 等。
[0003] 輸入含肥V或HCV-RNA的血漿或血液制品，一般經6-7周潛伏期后急性發病，臨床表 現為全身無力，胃納差，肝區不適，1/3病人有黃痘，ALT升高，抗HCV抗體陽性。丙型肝炎病毒 化CV)慢性感染可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，臨床丙型肝炎病人50%可發展為慢性肝 炎。甚至部分病人會導致肝硬化及肝細胞癌，對患者的健康和生命危害極大。
[0004] 丙型肝炎發病機理仍未十分清楚，當HCV在肝細胞內復制引起肝細胞結構和功能 改變或干擾肝細胞蛋白合成，可造成肝細胞變性壞死，表明HCV直接損害肝臟，對發病起一 定作用。但多數學者認為細胞免疫病理反應可能起重要作用，發現丙型肝炎與乙型肝炎一 樣，其組織浸潤細胞WCD3+為主，細胞毒T細胞(TC)特異攻擊HCV感染的祀細胞，可引起肝細 胞損傷。
[000引在肥V急性感染期，在血漿或血清中的病毒基因組水平可達到105~107拷貝/ml。在 HCV慢性感染者中，HCV RNA水平在不同個體之間存在很大差異，但同一名患者的血液中HCV RNA水平相對穩定。對抗-HCV陽性的HCV持續感染者，需要通過HCV RNA檢測確證。只要一次 病毒定性檢測為陽性，即可確證肥V感染，但一次檢測陰性并不能完全排除HCV感染，應重復 檢查。HCV病毒載量的高低與疾病的嚴重程度和疾病的進展并無絕對相關性，但可作為抗病 毒療效評估的觀察指標。
[0006] 抗-HCV陽性，但反復檢測HCV RNA均為陰性:可能為既往HCV感染已自行恢復，或經 治療病毒已清除；一些自身免疫缺陷病患者可能出現抗-HCV陽性，但肥V RNA始終陰性。HCV RNA陽性，但抗-HCV陰性:可能為HCV感染早期，抗-HCV尚未產生;處于嚴重免疫抑制狀態或 免疫受損(如HIV感染），或接受透析的患者，亦可在肥V RNA陽性的情況下呈抗-HCV陰性。母 體的IgG型抗-HCV可W通過胎盤進入胎兒體內，因此6個月W內的嬰兒抗-HCV陽性并不一定 代表HCV感染。應WHCV RNA陽性作為其HCV感染的依據。
【發明內容】
[0007] 發明要解決的技術問題 目前市場上已有的HCV檢測試劑盒已不能滿足臨床診斷治療的要求，主要表現在W下 幾個方面： (1) 靈敏度較低，低于500 lU/ml病毒載量很難檢測到，然而丙型肝炎病毒核酸國家參 考品要求靈敏度至少達到50IU/ml; (2) 手工操作，低重現性，非標準化的操作流程極大的影響了病人的治療效果； (3) 低通量，手動操作時間長，結果報告不及時； (4) 因長期進行抗病毒治療，產生耐藥性，導致假陰性率不斷升高。
[000引另外《YY/T 1182-2010核酸擴增檢測用試劑盒》行業標準于2012年6月1日開始實 施，其中對皿V、HIV、HCV有要求，（1)加入全程參與的內標；（2)質控品和標準品需要進行核 酸提取和純化;（3)核酸加樣體積不小于20μ1，總反應體積不小于40μ1。
[0009] 為滿足臨床診斷治療要求，需要具有靈敏度高、精密度高和假陰性率低的用于檢 測人HCV的引物、探針W及包含所述引物和探針的試劑盒。
[0010] 本發明目標在于提供能滿足上述要求的用于檢測人HCV的引物組、探針W及包含 所述引物組和探針的試劑盒。本發明的引物組和探針可解決因 HCV高突變而產生的漏檢問 題，并且具有較高的靈敏度及特異性。
[00川技術方案 本發明設及一種用于檢測人丙型肝炎病毒化CV)基因的引物組。在一個實施方案中，所 述引物組包括或者是至少一種選自W下的引物組： (1) 引物組1，其包含具有如SEQ ID NO: 1所示的核巧酸序列的引物和具有如SEQ ID NO: 2所示的核巧酸序列的引物;或者由所述引物組成;和 (2) 引物組2,其包含具有如SEQ ID NO: 4所示的核巧酸序列的引物和具有如SEQ ID NO: 5所示的核巧酸序列的引物，或者由所述引物組成。
[0012] 在一個實施方案中，所述引物組包括或者是至少一種選自W下的引物組： (1) 引物組1，其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 2所示的引物;或者由所述引物組成;和 (2) 引物組2,其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 4所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示的引物，或者由所述引物組成。
[0013] 在一個實施方案中，本發明的引物組包括或者是： (1) 引物組1，其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 1所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 2所示的引物，或者由所述引物組成;和 (2) 引物組2,其包含核巧酸序列如SEQ ID NO: 4所示的引物和核巧酸序列如SEQ ID NO: 5所示的引物，或者由所述引物組成。
[0014] 本發明還設及一種用于檢測人HCV基因的探針。在一個實施方案中，探針包括或者 是至少一種選自W下的探針： (1) 探針1，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核巧酸序列;和 (2) 探針2,其具有如SEQ ID NO: 6所示的核巧酸序列。
[0015] 在一個實施方案中，探針包括或者是至少一種選自W下的探針： (1) 探針1，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 3所示;和 (2) 探針2,其核巧酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
[0016] 在一個實施方案中，探針包括或者是： (1) 探針1，其核巧酸序列如SEQ ID NO: 3所示;和 (2) 探針2,其核巧酸序列如SEQ ID NO: 6所示。
[0017] 在一個實施方案中，探針通過標記物標記。在一個實施方案中，所述探針的一個末 端(例如5'末端或3'末端)通過報告巧光基團標記，并且探針的另一個末端(例如3'末端或 5'末端)通過澤滅巧光基團標記。在一個實施方案中，SEQ ID NO: 3所示的探針1的5'末端 由FAM標記并且3'末端由BHQ1標記。在一個實施方案中，SEQ ID NO: 6所示的探針2的5'末 ?由FAM柄記并且3末?而由B冊1柄記。
[0018] 本發明還設及一種用于檢測人HCV基因的試劑盒或微陣列，其含有本發明的引物 組。在一個實施方案中，本發明的試劑盒或微陣列包含引物組1。在又一個實施方案中，本發 明的試劑盒或微陣列包含引物組2。在再一個實施方案中，本發明的試劑盒或微陣列包含引 物組及引物組2。
[0019] 本發明還設及一種用于檢測人HCV基因的試劑盒或微陣列，其含有本發明的探針。 在一個實施方案中，本發明的試劑盒或微陣列包含探針1。在又一個實施方案中，本發明的 試劑盒或微陣列包含探針2。在再一個實施方案中，本發明的試劑盒或微陣列包含探針 及探針2。
[0020] 本發明還設及一種用于檢測人HCV基因的試劑盒或微陣列，其含有本發明的引物 組和探針。在一個實施方案中，本發明的試劑盒或微陣列包含引物組1和探針1。在又一個實 施方案中，本發明的試劑盒或微陣列包含引物組2和探針2。在再一個實施方案中，本發明的 試劑盒或微陣列包含引物組1和探針及引物組2和探針2。
[0021] 本發明還設及引物組在制備用于檢測樣品中HCV基因的試劑盒或微陣列中的用 途。在一個實施方案中，引物組是至少一種選自W下的引物組：引物組1和引物組2。
[0022] 本發明還設及引物組和/或探針在制備用于檢測樣品中HCV基因的試劑盒或微陣 列中的用途。在一個實施方案中，引物組和探針為引物組1和探針1。在另一個實施方案中， 引物組和探針為引物組2和探針2。在又一個實施方案中，引物組和探針為引物組1和探針1 W及引物組2和探針2。
[0023] 本發明還設及檢測樣品中HCV基因的方法，所述方法包括： (1) 提取和任選純化樣品中的核酸，和 (2) 使用引物組進行擴增和/或使用探針進行特異性雜交，W檢測所述核酸。
[0024] 在一個實施方案中，檢測樣品中HCV基因的方法包括： (1) 提取和任選純化樣品中的核酸， (2) 使用引物組對從步驟(1)中獲得的核酸進行擴增，從而得到擴增產物，和 (3) 使探針與擴增產物進行特異性雜交，W檢測所述核酸。
[0025] 在一個實施方案中，步驟(2)和步驟(3)同時進行。在一個實施方案中，檢測HCV基 因可為定性檢測或定量檢測。在另一個實施方案中，檢測為定量檢測。在又一個實施方案 中，通過RT-PCR法來檢測。在再一個實施方案中，檢測為通過巧光定量RT-PCR檢測。在另一 個實施方案中，檢測為通過一步巧光定量RT-PCR檢測。
[00%] 在一個實施方案中，核酸包括DNA和/或RNA，優選RNA。
[0027]在一個實施方案中，通過RT-PCR進行擴增反應。在另一個實施方案中，使用巧光定 量RT-PCR法對樣品中HCV基因進行定量檢測。在又一個實施方案中，使用一步巧光定量RT- PCR法對樣品中HCV基因進行定量檢測。
[0028] 在一個實施方案中，檢測樣品中HCV基因的方法所使用的引物組和/或探針包括引 物組1和/或探針1。在另一個實施方案中，檢測樣品中HCV基因的方法所使用的引物組和探 針包括引物組2和/或探針2。在另一個實施方案中，檢測樣品中HCV基因的方法所使用的引 物組和探針包括引物組1和探針及引物組2和探針2。
[0029] 在一個實施方案中，樣品可來源于動物受試者，例如人受試者。在一個實施方案 中，樣品為生物學樣品，例如來源于人的生物學樣品，包括但不限于體液樣品或組織樣品。 在一個實施方案中，樣品可為受試者的體液，包括但不限于血液、血清、血漿、尿液、唾液、分 泌液、淚液等，優選血液、血清和血漿，和更優選血液。
[0030] 在一個實施方案中，樣品可不來源于人受試者或者任何其它動物來源，優選為環 境樣品和工業樣品。在又一個實施方案中，檢測樣品中HCV基因的方法可不用于診斷受試者 受到HCV感染，例如可用于檢測環境樣品和工業樣品是否受到HCV污染。
[0031] 在一個實施方案中，樣品經過QIAsymphony SP/AS自動化儀器平臺處理W提取并 純化HCV核酸，優選HCV RNA。
[0032] 引物及探針 本發明的引物組包括引物組1和/或引物組2。本發明的探針包括探針1和/或探針2。
[0033] 用于檢測人HCV基因的本發明引物組和探針的實例分別見表1和2。
[0034] 表1本發明所用的引物及相應的祀序列
祀序列1對應于引物組1，祀序列2對應于引物組2。探針1可與由引物組1擴增得到的PCR 產物特異性雜交。探針2可與由引物組2擴增得到的PCR產物特異性雜交。
[0035] 本發明的引物和探針的核巧酸序列還包括其修飾形式，只要所述引物的擴增效果 或者探針的雜交效果不受到明顯的影響即可。所述修飾可W為例如在核巧酸序列中或兩端 添加一個或多個核巧酸殘基、在核巧酸序列中缺失一個或多個核巧酸殘基、或者將序列中 的一個或多個核巧酸殘基替換成另外的核巧酸殘基，例如將A替換成T，將C替換成G等。本領 域技術人員清楚，所述修飾形成的引物或探針也涵蓋在本發明之內、特別是權利要求的保 護范圍之內。在一個實施方案中，引物和探針的核巧酸序列的修飾形式為如CN103270174A 中所公開的化學增強型引物。
[0036] 探針的一個末端(例如5'末端或3'末端)可通過報告巧光基團標記，并且探針的另 一個末端(例如3'末端或5'末端)可通過相應的澤滅巧光基團標記。一方面，SEQ ID NO: 3 所示的探針1的5 '末端可由FAM標記并且3 '末端可由MGB或BHQl或BHQ2標記。另一方面，SEQ ID NO: 6所示的探針2的5'末端可由FAM標記并且3'末端可由MGB或B冊1或B冊2標記。
[0037] 可W使用例如通用DNA合成儀(例如由Applied Biosystems制造的394型），經化學 方法合成本發明引物組和探針中的各個核巧酸。還可采用本領域眾所周知的任何其它方法 來合成寡核巧酸，例如引物組和探針。
[0038] 使用從樣品中提取的HCV病毒核酸作為模板，并使用前述引物組對HCV基因進行擴 增反應，W獲得擴增產物。擴增反應包括但不限于聚合酶鏈式反應(PCR)、連接酶鏈式反應 化CP)、自動維持序列復制（3SR)、基于核酸序列的擴增(NASBA)、鏈置換擴增(SDA)、多重置 換擴增(MDA)和滾環擴增(RCA)，其公開于W下參考文獻(在此引作參考）中:Mullis等，美國 專利第4,683,195號;第4,965,188號;第4,683,202號；第4,800,159 (PCR)號;Gelfand等， 美國專利第5,210,015號（用叮aqman"或"Taq"[注冊商標]探針進行的實時PCR);Wittwer 等，美國專利第6，174，670號;Kacian等，美國專利第5，399，491號TNASBA" ); Lizardi，美國 專利第5,854,033號;Aono等，日本專利公開第肝4-262799號(滾環擴增）；等等。
[00例優選使用PCR法對HCV基因進行擴增。PCR法本身是本領域眾所周知的。術語"per 包括該反應的衍生形式，其包括但不限于反轉錄PCR (RT-PCR)、實時PCR、嵌套式PCR、多重 PCR和巧光定量PCR等。優選使用巧光定量RT-PCR法、特別是一步巧光定量RT-PCR法對肥V基 因進行定量檢測。
[0040] 樣品經過提取并純化獲得HCV RNA后，可使用RT-PCR對肥V RNA進行檢測。首先，通 過反轉錄酶對HCV RNA進行反轉錄成cDNA。在本發明的HCV檢測中，可使用各種常規的反轉 錄酶，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶;禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶;嗜熱 棲熱菌（巧er皿/S iAermo如別化?)、黃棲熱菌（巧ermt/s /7aras)等嗜熱微生物的熱穩定性反 轉錄酶;MMLV反轉錄酶的RNA酶Η突變體(商品名為Superscript和SuperScriptll)。然后， 在引物、模板cDNA和耐熱DNA聚合酶存在下，使用與有義鏈雜交的引物(反向引物)和與反義 鏈雜交的引物(正向引物），通過使退火、延伸和變性步驟的循環重復大約30次~50次(例如 45次）來進行PCR。
[0041] 在本發明的HCV檢測中，可使用各種常規的耐熱DNA聚合酶進行擴增，包括但不限 于F'astSta;rtTaqDNA聚合酶（Roche)、ExTaq(注冊商標，Takara)、Z-Taq、AccuP;rime Taq DNA聚合酶和Hots化rTaq Plus DNA聚合酶。優選使用HotStarTaq Plus DNA聚合酶。也 可使用市售反轉錄酶和DNA聚合酶的混合物，例如化eSt邱Enzyme Mix (例如可獲自德國 QIAGEN公司）。在存在引物例如本發明引物組的情況下，所述酶混合物可用于在同一管中進 行cDNA的合成和PCR反應，即一步RT-PCR。在存在引物和探針例如本發明引物組和探針的情 況下，所述酶混合物可用于一步巧光定量RT-PCR法，即在同一管中進行cDNA的合成、PCR反 應和PCR產物的檢測。
[0042] 基于引物Tm值選擇合適PCR反應條件的方法是本領域眾所周知的，本領域普通技 術人員可W根據引物長度、GC含量、目標特異性和靈敏度、所使用的聚合酶性質等，選出最 佳條件。例如，可使用W下條件進行巧光定量PCR反應:50°C 30分鐘，95°C 15分鐘，95°C 15 秒，50 °C 45秒，72 °C 15秒，循環45次。
[0043] 可將能夠檢測HCV的本發明探針與樣品中的核酸例如HCV核酸或者由PCR擴增的 DNA產物進行特異性雜交反應，從而實現對擴增產物的定量或定性檢測。本發明的探針可通 過標記物進行標記W方便光學儀器檢測，標記物例如包括巧光物質和生物素中的任一種。 標記物的實例包括FITC、切3、切5、切5.5、切7、TAMRA、Dab巧1、3(^、了61'、羅丹明、德克薩斯 紅、皿X、切ber 0'6611^41、]\?^、8朋1和8朋2等。優選的標記物可包括但不限于。41、]\?；8、 B冊1和BHQ2等。通過采用光學檢測手段，觀察源于運類巧光物質的巧光強度，能夠W高靈敏 度檢測被用于巧光標記的各種巧光物質。標記物還可包括報告巧光基團和澤滅巧光基團。 報告巧光基團可為例如FAM、肥X或TET;巧滅巧光基團可為例如TAMRA、MGB、B冊1或B冊2。
[0044] 可采用化qman技術使用本發明的引物組和探針進行PCR檢測。TaqMan技術的要點 是在普通PCR原有的特異性引物對基礎上增加了特異性的巧光雙標記探針。該探針同樣與 病原體核酸特異性結合，而且結合部位位于引物結合區域的中間。探針的5/端和y端分別 標記不同的巧光素，如5/端標記FAM巧光素，它發出的巧光能夠被檢測儀器接收，稱為報告 巧光基團（用R表示），3/端一般標記TAMRA巧光素，它在近距離內能吸收5/端報告巧光基團 發出的巧光信號，稱為澤滅巧光基團（用Q表示）。當PCR反應在退火階段時，引物對和探針同 時與目的基因片段結合，此時探針上R基團發出的巧光信號被Q基團所吸收，儀器檢測不到R 所發出的巧光信號；當PCR反應進行到延伸階段時，Taq酶在引物的引導下，W四種核巧酸為 底物，根據堿基配對的原則，沿著模板鏈合成新鏈；當鏈的延伸進行到探針結合部位時，受 到探針的阻礙而無法繼續，此時的化q酶發揮它的5/^3/外切核酸酶的功能，將探針切成單 核巧酸，消除阻礙，與此同時標記在探針上的R基團游離出來，R所發出的巧光再不為Q所吸 收而被檢測儀所接收;在化q酶的作用下繼續延伸過程合成完整的新鏈，R和Q基團均游離于 溶液中，儀器可繼續檢測到R所發出的巧光信號。如上所述，PCR進行一個循環，合成了N條新 鏈的同時，就水解了 N條探針，亦釋放了相應數量的巧光基團。儀器所接收到巧光信號的強 度與PCR反應產物的量呈對應關系。隨著PCR反應的循環往復，PCR產物呈指數形式增長，巧 光信號也相應增長。如果W每一個PCR循環結束時所測得的巧光值為縱坐標，WPCR循環數 為橫坐標作圖，即可得到一條連接每一個循環后巧光值的曲線一稱為擴增曲線。當檢測標 本中含有所要檢測病原體的核酸序列時，所得到的曲線呈"S"型；而當標本中不含病原體， 貝化CR過程不發生，探針不被水解，不產生巧光信號，其擴增曲線為一水平線。PCR擴增信號 進入相對穩定對數增長期的最下限，通常設定在S型擴增曲線的增長拐點處附近，稱為闊值 線（Threshold);而擴增曲線與闊值線交叉點的循環數稱為Ct值。樣本中病原體的濃度越 高，Ct值就越小。W此方法測定未知標本中的病原體核酸，不僅能快速定性，還因為巧光PCR 本身先進的巧光信號檢測系統和強大的信息處理能力，可W實現對病原體核酸的定量。
[0045] 樣品 本發明所用的樣品可W是生物來源、環境來源、醫學來源或患者來源的一定量的材料。 一方面，它可包括標本或培養物(例如微生物培養物）。另一方面，它也可包括但不限于生物 學樣品和非生物樣品（例如環境樣品和工業樣品等）。生物學樣品可包括采自受試者的材 料，其包括但不限于體液樣品（例如血液、血清、血漿、唾液、尿液、組織液、精液、分泌液、脈 汁和呼吸液和粘液)和組織樣品（例如活組織切片等）。生物學樣品可獲自人受試者或其它 動物。環境樣品是指取自例如自然環境、生活環境、工作環境和生產環境等的樣品，包括但 不限于天然食物、表面物質、±壤、水。工業樣品是指取自工業制品的樣品，包括但不限于從 加工食品和奶制品、加工設備、儀器、裝置、器具、一次性用品和非一次性用品中獲得的樣 品。運些實例不能理解為限制適用于本發明的樣品類型。
[0046] 從樣品中提取核酸的方法是本領域眾所周知的，可用例如苯酪和氯仿進行RNA提 取，或者使用市售RNA提取試劑進行提取。例如，可使用RNA提取試劑盒（例如RNeasy Mini Kit (Qiagen))進行提取。
[0047] 核酸可通過本領域眾常規的純化方法來純化。本發明優選采用磁珠法核酸純化技 術實現病毒核酸純化。在磁珠(純化)法中，加入蛋白酶使病毒裂解并將病毒DNA或RNA釋放 出來，磁珠表面包裹有一層二氧化娃，二氧化娃在高離液劑的條件下特異吸附核酸DNA或 RNA，接著通過洗涂步驟有效去除二價陽離子和蛋白質等PCR反應抑制物，最后用洗脫液(低 鹽)將病毒DNA或RNA從磁珠上洗脫下來，完成純化。經過純化的病毒DNA或RNA不含蛋白質、 核酸酶和其他雜質，而且回收率高。
[004引本發明可W采用QIAsymphony SP/AS自動化儀器平臺進行核酸提取并純化。
[0049] 試劑盒 本發明設及一種用于檢測人HCV基因的試劑盒，其含有本發明的引物組或者引物組與 探針的組合。本發明還設及引物組或者引物組與探針的組合在制備用于檢測樣品中HCV基 因的試劑盒中的用途。在一個實施方案中，引物組選自引物組1和引物組2。在一個實施方案 中，所述引物組和探針的組合選自至少一種W下組合：引物組1和探針1的組合，和引物組2 和探針2的組合。
[0050] 試劑盒可包含實施本發明方法所用的材料或試劑(包括引物組和探針）。試劑盒可 W包括儲存反應試劑(例如在合適容器中的引物、探針、酶等)和/或支持材料(例如緩沖液、 實施檢測的說明書等）。例如，試劑盒可W包括一個或多個含有相應反應試劑和/或支持材 料的容器(例如盒子）。運樣的內容物可一起或分開遞送給既定的接受者。例如，第一個容器 可含有用于測定的酶，第二個容器含有引物組，而第Ξ個容器含有探針。所述試劑盒還可含 有適合容納所述試劑或容器的隔室。作為一個實例，試劑盒可含有引物組、探針、PCR反應緩 沖液和使用說明書。試劑盒還可含有聚合酶和dTNP等。試劑盒還可含有UNG、用于質控的內 標、陽性和陰性對照和/或HCV假病毒標準品等。試劑盒還可包含用于從樣品制備HCV RNA的 試劑。本發明試劑盒還可包含除了本發明的引物組和探針之外的其它任何引物組和/或探 針，例如能夠有效檢測人HCV基因的引物組和/或探針。W上實例不能理解為限制適用于本 發明的試劑盒及其內容物。
[0化1 ]微陣列 本發明設及一種用于檢測人HCV基因的微陣列，其含有本發明的引物組和/或探針。本 發明還設及引物組和/或探針在制備用于檢測樣品中HCV基因的微陣列中的用途。在一個實 施方案中，引物組選自引物組1和引物組2。在一個實施方案中，探針選自探針1和探針2。在 一個實施方案中，引物組和探針的組合選自至少一種W下組合：引物組1和探針1的組合，和 引物組2和探針2的組合。
[0052]微陣列是指具有平坦表面的固相支持體，其具有核酸陣列，陣列中的各個成員包 含固定在空間上確定的區域或位點上的寡核巧酸或多核巧酸的相同的拷貝，所述區域或位 點不與陣列中的其它成員的區域或位點重疊;也就是說，所述區域或位點在空間上是離散 的。此外，空間上確定的雜交位點可為"可尋址的"，因為其位置及其固定化的寡核巧酸的身 份是已知或預先確定的（例如在其使用前是已知或預先確定的）。通常寡核巧酸或多核巧酸 為單鏈，并通常由5'-端或3'-端與固相支持體共價連接。微陣列中含有非重疊區的核酸的 密度通常大于100/cm2,更優選大于1000/cm2。微陣列技術公開于例如W下參考文獻中： Schena編輯的Microarrays: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, 2000); Southern, Qirrent Opin. Qiem. Biol., 2:404-410,1998,其全部內容通過引用結合到 本文中。
[0化3]有益效果 本發明提供了檢測限低、假陰性率低、靈敏度高、線性范圍寬W及精密度高的用于人 HCV基因檢測的引物組和探針、包含它們的試劑盒W及檢測方法。
【附圖說明】
[0054] 圖1表示AB 口 300、AB 口 500、RGQ和LC480四個PCR平臺最低檢測限的原始數據。A. RGQ儀器，其中左側窗口為定量檢測數據，右側窗口為內標檢測數據;N50為中國食品藥品檢 定研究院HCV核酸國家參考品中的靈敏度參考品稀釋的樣本，濃度為50IU/ml;NC為陰性對 照，HP為強陽對照，CP為臨界陽性對照，QS1-QS4為定量標準品。B. AB口300儀器，其中N50和 N100為中國食品藥品檢定研究院HCV核酸國家參考品中的靈敏度參考品稀釋的樣本，濃度 分別為50IU/ml和100IU/ml;NC為陰性對照，HP為強陽對照，CP為臨界陽性對照，QS1-QS4為 定量標準品。C. ABI7500儀器，其中N50和N100為中國食品藥品檢定研究院HCV核酸國家參 考品中的靈敏度參考品稀釋的樣本，濃度分別為50IU/m巧日100IU/ml;NC為陰性對照，HP為 強陽對照，CP為臨界陽性對照，QS1-QS4為定量標準品。D. LC480儀器，其中N50為中國食品 藥品檢定研究院HCV核酸國家參考品中的靈敏度參考品稀釋的樣本，濃度為50IU/ml;NC為 陰性對照，HP為強陽對照，CP為臨界陽性對照，QS1-QS4為定量標準品。
[0055] 圖2表示本發明試劑盒通過巧光定量PCR檢測肥V核酸的線性范圍（1X102-5X107 lU/mL)。
[0056] 本發明的目的、特征及優點將結合實施例，參照附圖作進一步詳細闡述。應當理 解，運些實施例僅用于說明本發明而不用于限定本發明的范圍。下列實施例中未注明具體 條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New York: Cold Spring化rbor LaboratoiT Press,0989)中所述的條件，或者試劑盒生產廠家推薦 的方法。 實施例
[0化7]實施例1 材料 1.試劑盒 本發明試劑盒包含W下組分:RT-PCR溶液和OneStep Enzyme Mix (購自德國QIAGEN公 司）。
[005引 RT-PCR溶液包含W下組分：超純水、OneStep RT-PCR緩沖液，5x (450ml/500)， KG、白蛋白，Rinderserum, Mol-Biol.、100mmol/L dATP、100mmol/L dCTP、100mmol/L dGTP、100mmol/L dTTP、引物組1(正向引物1和反向引物1)、探針1(探針1)、引物組2 (正向 引物2和反向引物2)和探針2(探針2)。
[0化9] 2.定量標準品 用肥V假病毒化CV Armored RNA, SEQ ID NO: 9)制備。首先標定濃度(可溯源至中國 食品藥品檢定研究院的丙型肝炎病毒RNA國家定量標準品(購自中國食品藥品檢定研究院， 批號:GB-1307004)，然后用陰性血漿稀釋至合適濃度。檢測4個定量標準品各3次，計算每一 標準品標示濃度的對數值，W濃度的對數值為Yi，Ct均值為Xi，進行線性擬合并計算線性相 關系數，線性相關系數應I r I值>0.98。
[0060] 3. HCV對照 3.1 HCV陰性對照： 市售陰性化CV-RNA = 0 lU/mL)且外觀澄清的血清或血漿。
[0061] 3.2 HCV強陽性對照： 選用HCV假病毒（SEQ ID NO: 9)制備，用市售陰性血清或血漿稀釋至合適濃度化(：￥- RNA = 6.32 X 1〇5~6.32 X l〇6lU/mL)。
[0062] 3.3 HCV臨界陽性對照： 選用HCV假病毒（SEQ ID NO: 9)制備，用市售陰性血清或血漿稀釋至合適濃度化(：￥- RNA = 6.32 X 1〇3~6.32 X l〇4lU/mL)。
[0063] 4.樣品制備試劑 樣品制備試劑為QIAsym地ony Virus/Bacteria Midi Kit (購自德國QIAGEN，批號 148045667)，其包含下列成分：PK 化nzyme Rack Virus (購自QIAGEN GmbH))、Reagent RackVirus(購自QIAGENGm地，包含MBS、QSL2、QSBl、QSWl、QSW5、QSW2)和AVE(40ml/20ml/ 2ml)。
[0064] 方法 1. HCV RNA樣品的制備 按照QIAsymphony SP/AS自動化儀器操作說明書進行操作，利用樣品制備試劑 QIAsymphony Virus/Bacteria Midi Kit按照試劑說明書進行核酸自動化提取，并按照下 表用量完成自動化上樣。
[00化]表3
2. 巧光定量RT-PCR反應(一步法） 在使用本發明試劑盒進行的巧光定量RT-PCR反應中，使用W下引物和探針： 正向引物 1: ACCCTATCAGGCAGTACCACAAG 反向引物 1: CGTGCCCCCGCAAGA 探針 1: FAM-CCTTTCGCGACCCAACACTACTCG-BHQ1 正向引物2: GAGTGTCGTGCAGCCTCCAGG 反向引物2: AATTCCGGTGTACTCACCGG 探針 2: FAM-CCACTATGGCTCTCCCGGGAGG-B冊 1。
[0066] 反應條件如下：50°C 30分鐘，95°C 15分鐘，95°C 15秒，50°C 45秒，72°C 15秒，循 環45次。反應體系50μ1，其中引物終濃度0.4μΜ，探針終濃度0. ΙμΜ，dNTP終濃度0.3mM，樣品 3化1，酶混合物化1。
[0067] 實施例2 -本發明試劑盒的最低檢測限(L0D) 使用實施例1中所述的定量標準品，用陰性血漿稀釋至50IU/ml (lU/ml表示每毫升所 含病毒的量）。通過實施例1中所述的方法制備標準品的HCV RNA。使用本發明試劑盒，通過 巧光定量RT-PCR反應對每個濃度梯度重復檢測25次。
[006引 AB口300、AB口500、RGQ和LC480四個PCR平臺檢測原始數據見圖1(僅示第1批），結 果統計見下表4。
[0069] 表4
結果表明本發明試劑盒最低檢測限可W達到50IU/ml。目前國內幾家優秀體外診斷試 劑生產企業HCV試劑盒的靈敏度均較低，為250 lU/ml~1000 lU/ml，本發明試劑盒明顯占 優。
[0070] 實施例3 -本發明試劑盒的精密度(重復性） 取1份HCV臨床陽性樣本，用定量標準品標定濃度后，梯度稀釋成5 X 102IU/ml和5 X 104IU/ml濃度的2個樣本。通過實施例1中所述的方法制備臨床陽性樣本的HCV RNA，用3個 批次的本發明試劑盒，通過巧光定量RT-PCR反應對每個樣本重復檢測40次，統計每個樣本 定量結果均值、標準差，并計算變異系數CV。
[0071] 通過W下標準判定精密度：W同一濃度樣品的定量檢測結果的對數值計算變異系 數(CV，％)(CV = STD/平均值xlOO%，即分別計算定量檢測結果對數值的標準偏差和平均值， 然后用標準偏差除W平均值得到變異系數），同一批次試劑盒的檢測結果用于計算批內精 密度。要求CV小于5%。
[0072] 結果見下表5。
[0073] 表 5
3批試劑盒檢測了5 X 102IU/ml和5 X 104IU/ml兩個濃度樣本，定量結果變異系數CV< 5%，顯示試劑盒精密度較好。
[0074]實施例4 -本發明試劑盒的定量準確性和線性 取定量標準品，用陰性血漿梯度稀釋至l〇6IU/ml、105IU/ml、104IU/ml、10 3IU/ml和 102IU/ml濃度。通過實施例1中所述的方法制備定量標準品的HCV RNA，用本發明試劑盒通 過巧光定量RT-PCR反應對每個濃度重復檢測3次。結果見下表6。
[00巧]表6
各樣本定量檢測濃度均在驗收標準范圍（樣本實際濃度± ο. 51ogl0值范圍）內，提示試 劑盒定量檢測準確性好。
[0076] 各濃度樣本理論濃度loglO對數值與PCR Ct值之間呈現良好的線性關系，線性擬 合的相關系數大于0.99 (見圖2)。試劑盒檢測線性范圍為1X102~5X107 lU/mL。
[0077] 實施例5 -本發明試劑盒的特異性 按照實施例1，用本發明的試劑盒檢測了HCV核酸國家參考品（購自中國食品藥品檢定 研究院，批號:GB-1307004)中的特異性參考品、皿V、HIV-1、邸V、HSV-1、HSV-2、CMV、金黃色 葡萄球菌樣本W及健康獻血員血漿樣本，檢測結果均顯示肥V RNA=0 lU/ml(結果未顯示）。 運表明本發明試劑盒無交叉反應，特異性較好。
[007引實施例6 -本發明試劑盒的敏感性 按照實施例1，用本發明的試劑盒檢測了HCV核酸國家參考品（購自中國食品藥品檢定 研究院，批號:GB-1307004)中的陽性參考品和NIBSC的用于核酸擴增技術的HCV RNA基因型 組(購自NIBSC，code:08/264) 1、2、3、4、5和6基因型樣本，所有樣本檢測結果為肥V RNA〉0 IU/ mL(結果未顯示），即HCV1-6基因型樣本均能被本發明試劑盒成功檢測，顯示試劑盒具 有良好的敏感性。
[0079]本領域技術人員應該明白，本文所述發明除明確闡述的內容外，還容允變化和修 改，特別是等同的變化和修改。應該理解，所有運樣的變化和修改均落入本發明，特別是權 利要求中所限定的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種用于檢測人丙型肝炎病毒HCV基因的引物組，所述引物組包括至少一種選自以 下的引物組： (1) 引物組1，其包含具有SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 2所示的核苷酸序列的引物;和 (2) 引物組2,其包含具有SEQ ID NO: 4所示的核苷酸序列的引物和具有SEQ ID NO: 5所示的核苷酸序列的引物。2. -種用于檢測人HCV基因的探針，所述探針包括至少一種選自以下的探針： (1) 探針1，其具有如SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列;和 (2) 探針2,其具有如SEQ ID NO: 6所示的核苷酸序列， 優選其中所述探針通過標記物來標記。3. 權利要求2的探針，其中所述探針的一個末端例如5'末端通過報告熒光基團標記，并 且探針的另一個末端例如3'末端通過淬滅熒光基團標記。4. 權利要求3的探針，其中所述報告熒光基團為FAM，并且所述淬滅熒光基團為MGB或 BHQ1或BHQ2。5. -種用于檢測人HCV基因的試劑盒或微陣列，其包含權利要求1的引物組，或權利要 求2-4中任一項的探針。6. -種用于檢測人HCV基因的試劑盒或微陣列，其包含權利要求1的引物組，和權利要 求2-4中任一項的探針。7. 權利要求1的引物組在制備用于檢測樣品中HCV基因的試劑盒或微陣列中的用途。8. 權利要求1的引物組和權利要求2-4中任一項的探針在制備用于檢測樣品中HCV基因 的試劑盒或微陣列中的用途。9. 權利要求7或8的用途，其中所述樣品選自生物學樣品、環境樣品和工業樣品，優選其 中所述樣品為體液樣品或組織樣品，和更優選所述樣品選自血液、血清、血漿、尿液、唾液、 分泌液和淚液。10. 檢測樣品中HCV基因的方法，所述方法包括： (1) 提取和任選純化樣品中的核酸，和 (2) 使用權利要求1的引物組進行擴增和/或使用權利要求2-4中任一項的探針進行特 異性雜交，以檢測所述核酸， 其中所述方法不用于診斷受試者受到HCV感染， 優選其中所述核酸為RNA，并且 優選所述檢測是RT-PCR檢測，更優選熒光定量RT-PCR檢測。
【文檔編號】C12Q1/70GK106011309SQ201610341409
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月20日
【發明人】陳華, 彭進
【申請人】凱杰生物工程（深圳）有限公司