丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒、寡核苷酸及其應用
【專利摘要】本發明提供了丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒、引物及其應用，采用熒光PCR技術，對血液樣品中可能存在的HCV RNA病毒并對HCV 1b、HCV 2a、HCV 6a、HCV 3a、HCV 3b、HCV 1a、HCV 4和HCV 5的HCV基因型進行鑒定。本發明可檢測的丙型肝炎病毒亞型范圍廣，檢測靈敏度高，降低了丙型肝炎基因型檢測的漏檢率。
【專利說明】
丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒、真核昔酸及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于醫學檢驗領域，具體設及一種高敏感性HCV基因分型檢測的引物、試劑 盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒化epatitis C virus,肥V)引起的W肝臟損害為 主的傳染性疾病，可通過輸血、靜脈注射毒品、性傳播、母嬰傳播等傳染，HCV是慢性肝病的 主要病原之一。丙型肝炎分布較廣，容易演變為慢性、肝硬化、肝癌，嚴重危害患者的健康和 生命。
[0003] 丙型肝炎病毒是一種球形帶脂蛋白包膜的病毒，病毒顆粒直徑約為55-65nm，為單 股正鏈RNA病毒，基因組全長約9.化Da;根據丙型肝炎病毒在NS5B區域的差異性，分成不同 的基因型，如1、2、3、4、5、6型等，不同亞型的肥￥感染，其臨床表現、肝病的嚴重程度及慢性 化病程均有差異，抗病毒質粒的效果也不同。臨床檢測HCV基因亞型有助于判斷治療的程 度，可作為指定個性化抗病毒治療方案的參考指標之一。
[0004] 目前HCV基因型分型方法包括：（1)核巧酸序列分析法，通過PCR擴增出目標基因， 再進行核巧酸序列測定。（2)型特異性引物擴增法，根據核巧酸片段某區域內序列變異的特 點，設計一系列型特異性引物進行擴增，不容的型被擴增出長短不一的片段，然后進行分 型。（3)型特異性探針雜交法，設計出多個具有型特異性的探針，并使之呈線狀平行固定在 雜交膜上，然后把PCR擴增產物標記生物素，繼續梓反向雜交后分型。（4)限制性片段長度多 態性，根據DNA在限制性內切酶酶切后形成的特定DNA片段的大小分型。（5)遺傳發育關系進 化樹法。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于提供用于丙型肝炎病毒基因分型檢測的寡核巧酸，所述寡核巧 酸包括：用于檢測HCV的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :1~3;用于檢測HCV化 的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :4~6;用于檢測HCV 2a的探針和引物，其堿 基序列分別為SEQ ID NO. :7~9;用于檢測HCV 6a的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 10~12;用于檢測肥V 3a的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 13~15;用于 檢測肥V 3b的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :16~18;用于檢測肥V la的探針 和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. ~24;用于檢測肥V 4的探針和引物，其堿基序列 分別為SEQ ID NO. :25~27;用于檢測肥V 5的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 28 ~30。
[0006] 進一步地，還包括化-RT引物，其堿基序列為SEQ ID NO. :31;2a-RT引物，其堿基序 列為SEQ ID N0.:32;6a-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:33;3a-RT引物，其堿基序列為 SEQ ID N0.:34;3b-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:35;la-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:36;4-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:37;5-RT引物，其堿基序列為沈Q ID NO.: 38 ο
[0007] 進一步地，還包括內標探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :19~21。
[000引本發明還提供了丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒，包括HCV RNA/化/3a RT-PCR 反應液、HCV2a/6a/3b RT-PCR反應液、HCVla/4/5RT-PCR反應液和酶混合液，其特征在于，所 述HCV RNA/化/3a RT-PCR反應液包括檢測HCV RNA的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 1~3,檢測HCV化亞型的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :4~6,檢測 肥V3a亞型的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID N0.:13~15;HCV2a/6a/3b RT-PCR反 應液包括檢測的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :7~9,檢測肥Wa亞型的 探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. : 10~12,檢測肥V3b亞型的探針和引物，其堿基 序列分別為SEQ ID NO. :16~18;HCVla/4/5RT-PCR反應液包括檢測肥Via的探針和引物，其 堿基序列分別為SEQ ID NO. ~24,檢測肥V 4亞型的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :25~27,檢測HCV5亞型的探針和引物，其堿基序列分別為沈Q ID NO. :28~30。
[0009] 進一步地，所述寡核巧酸還包括化-RT引物，其堿基序列為SEQ ID NO. :31;2a-RT 引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:32;6a-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:33;3a-RT引物， 其堿基序列為SEQ ID N0.:34;3b-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:35;la-RT引物，其堿 基序列為SEQ ID N0.:36;4-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:37;5-RT引物，其堿基序列 為沈Q ID NO. :38。
[0010] 進一步地泡括內參基因的內標模板，和檢測所述內參基因的內標探針和引物，所述 內標探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 19~21，所述內標模板為SEQ ID NO. :39。 [0011 ] 進一步地，所述酶混合液包括RT AcejTaq和RNase。
[0012]根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR緩沖液、MgC12、 dNTP、BSA、HCV分型陽性對照和HCV分型陰性對照。
[001引進一步地，所述HCV分型陽性對照來源于臨床收集的HCnb陽性感染的血清樣本， 用生理鹽水適當稀釋，經滅活處理的HCV化陽性血清;所述HCV分型陰性對照來源于臨床收 集的HCV陰性血清，經滅活處理的HCV陰性血清。
[0014] 本發明還提供了所述試劑盒在制備對丙型肝炎病毒進行基因分型的試劑中的應用。
[0015] 本發明的有益效果:本發明檢測的丙型肝炎病毒的亞型范圍廣，檢測靈敏度高，降 低了丙型肝炎的漏檢率。
【附圖說明】
[0016] 圖1臨床樣本的HCV RNA檢測結果圖。
[0017] 圖2臨床樣本的HCV化檢測結果圖。
[0018] 圖3臨床樣本的HCV2a檢測結果圖。
[0019] 圖4臨床樣本的HCV6a檢測結果圖。
[0020] 圖5臨床樣本的HCV3a檢測結果圖。
[0021] 圖6臨床樣本的HCV3b檢測結果圖。
[0022] 圖7臨床樣本的HCVla檢測結果圖。
[0023] 圖8臨床樣本的HCV4檢測結果圖。
[0024] 圖9臨床樣本的HCV5檢測結果圖。
[0025] 圖10靈敏度實驗結果圖。
[0026] 圖11同時使用反向引物和RT引物擴增的示意圖。
[0027] 圖12在HCV RNA/lb/3a體系中，使用RT引物和不使用RT引物的實驗結果圖。
[0028] 圖13在HCV2a/6a/3b體系中，使用RT引物和不使用RT引物的實驗結果圖。
[0029] 圖14在HCVla/4/5體系中，使用RT引物和不使用RT引物的實驗結果圖。
【具體實施方式】
[0030] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。
[0031] 丙型肝炎病毒基因分型檢測的引物和探針的設計和制備包括:根據HCV的5'UTR區 域設計了檢測HCV RNA病毒的引物和探針。根據化、2a、6a、3a、3b、la、4、5亞型的NS5B區域， 分別針對上述各亞型在NS5B區域設計了引物和探針，并針對上述各亞型分別設計了各自對 應的RT引物。本發明采用植源性的外源基因作為內參基因，使用外源性的基因作為檢測的 內參基因，避免了由于擴增人血清中的內參基因導致HCV或者HCV基因型別擴增效率降低， 從而不影響檢測祀標的擴增。
[0032] 丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒包括HCV RNA/化/3a RT-PCR反應液、HCV2a/ 6a/3b RT-PCR反應液、肥Vla/4/5RT-PCR反應液和酶混合液，其中肥V RNA/lb/3a RT-PCR反 應液包括檢測HCV RNA的探針和引物，檢測HCV化亞型的探針和引物，檢測HCV3a亞型的探 針和引物;HCV2a/6a/3b RT-PCR反應液包括檢測肥￥姑的探針和引物，檢測HCWa亞型的探 針和引物，檢測HCV3b亞型的探針和引物;肥Vla/4/5RT-PCR反應液包括檢測肥Via的探針和 引物，檢測HCV 4亞型的探針和引物，檢測HCV5亞型的探針和引物，其中：
[0033] 檢測HCV的換針堿基序列為：
[0034] HCV P:TCTGCGGAACCGGTGAGTACACCG(SEQ ID NO. :1 所示）
[00對檢測肥V的擴增引物堿基序列為：
[0036] HCV FP:TCCCGGGAGAGCCATAGTG(SEQ ID NO. :2所示）
[0037] HCV RP:ACCCAACACTACTCGGCTAG(SEQ ID NO. :3所示）
[0038] 檢測HCV化亞型的探針堿基序列為：
[0039] CHbP:TGGAAGGCGACAACC(SEQ ID NO. :4所示）
[0040] 檢測HCV化亞型的擴增引物堿基序列為：
[0041 ] CTlbFP:CGAGCGGTCGCAACCT(沈Q ID NO. :5所示）
[0042] CHbRP:TCATTGCCATAGAGGGGCC(SEQ ID NO. :6所示）
[0043] 檢測HCV 2a亞型的探針堿基序列為：
[0044] CT2aP:AGCCACCCGCGTCA(SEQ ID NO. :7所示）
[0045] 檢測HCV 2a亞型的擴增引物堿基序列為：
[0046] CT2aFP:CAGCCATAATTGARAGGTTACACG(SEQ ID NO. :8所示）
[0047] CT2aRP:CCCCAAGTTTTCTGAGGGC(沈Q ID NO. :9所示）
[004引檢測HCV 6a亞型的探針堿基序列為：
[0049] CT6aP:CTCAATAGGGTAGGRGCTT(沈Q ID NO. :10所示）
[0050] 檢測HCV 6a亞型的擴增引物堿基序列為：
[0051] CT6aFPl:ACTCCACGGATACTCTCCAGTTG(沈Q ID NO. :11 所示）
[0052]押6曰1?口2:64〔46(：1'(：了66(：1^64了61'(：1'(沈9 10備.：12所示）
[0化3] 檢測HCV 3a亞型的探堿基序列為：
[0054] CT3aP:ATCGCTGGGGTGACC(SEQ ID NO. :13所示）
[0055] 檢測HCV 3a亞型的擴增引物堿基序列為：
[0化6] CT3aFP:TCTGCGGAACCGGTGAGTAC(沈Q ID NO. :14所示）
[0057] CT3aRP:AATTTCTGGGTATTGAGCGGGT(沈Q ID NO. :15所示）
[005引檢測HCV 3b亞型的探針堿基序列為：
[0059] CT3bTP:ACCCATCTTTCCTTGTCT(沈Q ID NO. :16所示）
[0060] 檢測HCV 3b亞型的擴增引物堿基序列為：
[0061] CT3bFP:ACCTGTTACATCAAGGCCACTGC(沈Q ID NO. :17所示）
[0062] CT3bRP:CACAGCTTTCAGATATCACCACCA(SEQ ID NO. :18所示）
[0063] 檢測HCV la亞型的探針堿基序列為：
[0064] CTlaP:ACTGGAGTGTGTCTTGC(沈Q ID NO. 所示）
[0065] 檢測HCV la亞型的擴增引物堿基序列為：
[0066] CTlaFP:ATCATGCTCCTCCAACGTGTC(SEQ ID NO. :23所示）
[0067] CTlaRP:GGGCAAACATRATTATGTTGCC(SEQ ID NO. :24所示）
[0068] 檢測HCV 4亞型的探針堿基序列為：
[0069] CT4P:ACTTCGAYATGTACGGAGTCA(SEQ ID NO. :25所示）
[0070] 檢測HCV 4亞型的擴增引物堿基序列為：
[0071] CT4FP:AGCCAGGARGCCCTTGARAAAG(SEQ ID NO. :26所示）
[0072] CT4RP:GCGCTYAAGCCRTGGAGTCTTTG(SEQ ID NO. :27所示）
[0073] 檢測HCV 5亞型的探針堿基序列為：
[0074] CT5P:CTCCTGTAGAGCTGCAAA(SEQ ID NO. :28所示）
[0075] 檢測HCV 5亞型的擴增引物堿基序列為：
[0076] CT5FP:GGCAACACCATGACGTGCTA(沈Q ID NO. :29所示）
[0077] CT5RP:CTGGCTCTCGCARATGGCCA(SEQ ID NO. :30所示）
[0078] 在另一個實施方案中，所述HCV RNA/化/3a RT-PCR反應液還可W包括HCV化亞型 和肥V 3a亞型的RT引物。肥V2a/6a/3b RT-PCR反應液還可W包括HCV2a亞型、肥V 6a亞型和 肥V 3b亞型的RT引物。HCVla/4/5RT-PCR反應液中還可W包括HCVla亞型、HCV 4亞型和HCV 5亞型的RT引物。其中對應的RT引物堿基序列為：
[0079] 肥V化亞型的RT引物的堿基序列為：
[0080] 化-RT Primer:GGTGACAGGARCCATCCTG(SEQ ID NO. :31 所示）
[0081 ] 肥V 2a亞型的RT引物的堿基序列為：
[0082] 2a-RT Primer:CCACGGGAGATGAGGGACGC(沈Q ID NO. :32所示）
[0083] HCV 6a亞型的RT引物的堿基序列為：
[0084] 6a-RT Primer:TGGAGTGAGTTTTAGTTTGGT(沈Q ID NO. :33所示）
[0085] 肥V 3a亞型的RT引物的堿基序列為：
[00化]3a-RT Primer:GCACTCGCAAGCACCCTATC(SEQ ID NO. :：34所示）
[0087] 肥V 3b亞型的RT引物的堿基序列為：
[0088] 3b-RT Primer:TATCTGGTCATAGCCTCCGTGAA(SEQ ID NO. :35所示）
[0089] 肥V la亞型的RT引物的堿基序列為：
[0090] la-RT Primer:TTGAATGATTGGAGGTAGATCCA(SEQ ID NO. :36所示）
[0091] 肥V 4亞型的RT引物的堿基序列為：
[0092] 4-RT Primer:TTGAGTTCGTGTGGAGARTATCC(沈Q ID NO. :37所示）
[0093] HCV 5亞型的RT引物的堿基序列為：
[0094] 5-RT Primer:GAGTACCTGGTCATAGCCTC(SEQ ID NO. :38所示）
[00M]所述的酶混合液包括RT Ace、巧aq、化asin。在另一個實施方案中，所述酶混合液 還可W包括anti-Taq。
[0096] 所述丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒還可W包括內參基因的內標模板，和檢測 所述內參基因的探針和引物，所述內參基因選自植源性的外源基因，HCV分型的內標模板含 TE稀釋的外源性DNA片段制備的蛋白包裹RNA(假病毒）。其中：
[0097] 內標的探針堿基序列為：
[009引 IC-P:CAAGCTTCCCGTTCTCAGCC(沈Q ID NO. :19所示）
[0099] 內標的擴增引物堿基序列為：
[0100] IC-FP:GTAGCTGCGATGTCTCTGCGTAT(沈Q ID NO. :20所示）
[0101] IC-RP:AGCTCAGGAGATGACTGCAGTCTA(SEQ ID NO. :21 所示）
[0102] 所述內標模板堿基序列為：
[0103] GTAGCTGCGATGTCTCTGCGTATTGTATTATCCAAGCTTCCCGTTCTCAGCCTCTAGCTTCATGTTAGACTGCAGTC ATCTCCTGAGCT(SEQ ID N0.:39所示）。
[0104] 所述的丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒還可W包括PCR緩沖液、MgCb、dNTP和 BSA，W及HCV分型陽性對照品、HCV分型陰性對照品。其中所述HCV分型陽性對照來源于臨床 收集的HCnb陽性感染的血清樣本，用生理鹽水適當稀釋，經滅活處理的HCV化陽性血清。 HCV分型陰性對照來源于臨床收集的HCV陰性血清，經滅活處理的HCV陰性血清。
[0105] 丙型肝炎病毒基因分型檢測中所述的探針標記，可W根據需要選擇合適的5'端的 巧光報告基團和3'端的澤滅基團。表1所述探針和引物序列是其中的一個方案。
[0106] 表1:
[0107]
[010 引
[0109]
[0110] 實施例1病毒RNA的提取
[0111] 在1.5ml離屯、管中加入30化1的裂解液，再加入10化1標本，旋滿振蕩數秒混合均 勻，室溫靜置10分鐘。每管加入32化1無水乙醇，溫和地翻轉離屯、管3-5次混合均勻。取一個 核酸純化柱放入到2ml離屯、管中，將上述混合液加入到核酸純化柱中，蓋上管蓋，12000rpm 離屯、30秒。棄2ml離屯、管中的濾液，并將2ml離屯、管在紙巾上倒扣拍擊一次，將核酸純化柱置 回到2ml離屯、管中，在核酸純化柱中加入50化1洗涂液1，蓋上管蓋，12000rpm離屯、30秒。棄 2ml離屯、管中的濾液，并將2ml離屯、管在紙巾上倒扣拍擊一次，將核酸純化柱置回到2ml離屯、 管中，在核酸純化柱中加入60化1洗涂液2,蓋上管蓋，14000rpm離屯、1分鐘。棄2ml離屯、管中 的濾液，并將2ml離屯、管在紙巾上倒扣拍擊一次，將核酸純化柱置回到2ml離屯、管中， 140(K)rpm離屯、1分鐘。棄2ml離屯、管，將核酸純化柱置于一個潔凈的1.5ml離屯、管中，在純化 柱的膜中央加入50μ1 TE，蓋上管蓋，室溫靜置1分鐘，12000rpm離屯、30秒。詳細見艾康生物 技術(杭州)有限公司的核酸純化試劑盒(離屯、柱法）（浙杭食藥監械(準)字2014第1400038 號)說明書。
[0112] 實施例2:巧光PCR反應步驟
[0113] HCV基因分型反應溶液的配制體系：
[0114] HCV RNAAb/3a反應體系：
[0115]
[0116]
[0117] HCV2a/6a/3b 反應體系：
[011 引
[0119]
[0120] HCVla/4/5 反應體系：
[0121]
[0122] 所述探針和引物選自表1中的探針和引物。
[0123] 酶混合液的配制體系： Γ01241
[01 巧]從試劑盒中取出HCV RNA/lb/3aRRT-PCR反應液、HCV2a/6a/3bRRT-PCR反應液、 肥Vla/4/5RT-PCR反應液，在室溫下融化并振蕩混勻后，200化pm離屯、lOsec。計算需準備樣 本數η份[η =樣本數+2管對照]。
[0126] 每測試反應體系配制如下：
[0127]
[0128] 按η人份計算上述各試劑的用量，加入一適當容積的離屯、管中，混勻。按20μ1量分 裝到PCR薄壁管中，然后轉移到樣本處理區。
[0129] 計算上述各試劑的使用量，加入一適當體積的離屯、管中，充分混勻后，按20μ1量分 裝到PCR反應管中，轉移至樣本處理區。對應的反應管中分別加入20μ1的實施例1中樣本處 理上清液，蓋緊反應管，轉移至檢測區。
[0130] 將各反應管按一定順序放入PCR儀上，按W下程序進行PCR擴增，擴增程序如下：
[0131]
[0132] 其中步驟1為逆轉錄，包括RP及RT-Pr imer逆轉錄。步驟2為預擴增，步驟3為q-PCR 檢測。
[0133] 檢測時選擇FAM、VIC、Texas Red、Cy5,各通道結果解釋如下：
[0134] 2.1如果檢測樣本無典型S型曲線或者Ct值>32,則判樣本為HCV RNAab、2a、3a、 3b、6a陰性。
[0135] 2.2如果檢測樣本呈典型S型曲線且Ct <32，則根據下表標判斷樣本的亞型。
[0136]
[0137]
[013引實施例3:臨床樣本檢測
[0139]按實施例2和3的方法檢測96例HCV陽性樣本。采用測序法作為對照試劑。具體的 RT-PCR檢測結果如圖1至圖9所示。其中圖1為HCV RNA的檢測結果，圖2是HOab的檢測結果， 圖3是HCV^的檢測結果，圖4是HCVfe檢測結果，圖5是HCV3a檢測結果，圖6是HCV3b檢測結 果，圖7是肥Via檢測結果，圖8是肥V4檢測結果，圖9是肥V5檢測結果。結果顯示96例肥V陽性 樣本檢測結果同測序法完全一致。
[0140]
[0141 ]實施例4:HCV基因分型試劑盒靈敏度檢測結果
[0142] 按照實施例巧日2的試劑盒和方法測定肥V la/化/2a/3a/3b/4/5/6a樣本，按照肥V RNA標定濃度，參考標定濃度梯度對W上樣本血清進行梯度稀釋至約為lX103IU/ml，如圖 10所示，測試W上稀釋樣本結果均為陽性。因此試劑盒的靈敏度為IX l〇3IU/ml。
[0143] 實施例5:使用和不使用RT-Primer的對照試驗
[0144] 本發明中設計了針對各種亞型的特異性擴增引物和探針(SEQ ID NO. :1至SEQ ID NO.: 18 和沈 Q ID NO.: 22 至沈 Q ID NO.: 30)和 RT 引物（SEQ ID NO.: 31 至沈 Q ID NO.: 38)， 如圖11所示，A為需要擴增的目標序列。在逆轉錄階段，特異性擴增引物和RT-Prime巧I物均 可W做為特異性引物進行逆轉錄。在預擴增階段，配合正向引物，RP和RT-Primer均可W擴 增出祀標序列，由于增加了RT Primer可W避免由于RP不完全匹配或者擴增效率低造成的 漏檢風險。
[0145] 按照實施例1和2的試劑盒和方法，對照組為每管不加相應的RT引物，實驗組為每 管均有對應的RT引物。對照組的實驗結果W化-C、3a-C、HCV2a-C、6a-C、3b-C、HCVla-C、4-C、 5-C表示，實驗組的實驗結果W化、33、肥￥23、63、36、肥￥13、4、5表示。對照組和實驗組分別 擴增相應的陽性樣本，結果如圖12至圖14所示。從結果中可W明顯看出，增加 RT引物的實驗 組的Ct值相比于沒有RT引物的對照組，Ct值提前1-3個，且巧光值不變或者顯著提高。
[0146] 本發明所述的特異性逆轉錄引物和RT引物采用了兼并堿基，運大大減少了漏檢的 風險。實驗結果表明，其檢測準確率明顯高于特異性逆轉錄引物和RT引物中沒有采用兼并 堿基的檢測結果。
【主權項】
1. 用于丙型肝炎病毒基因分型檢測的寡核苷酸，其特征在于，所述寡核苷酸包括:用于 檢測HCV的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 1~3;用于檢測HCV lb的探針和引 物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :4~6;用于檢測HCV 2a的探針和引物，其堿基序列分別 為SEQ ID NO. :7~9;用于檢測HCV 6a的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 10~ 12;用于檢測HCV 3a的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :13~15;用于檢測HCV 3b的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :16~18;用于檢測HCV la的探針和引物， 其堿基序列分別為SEQ ID NO. :22~24;用于檢測HCV 4的探針和引物，其堿基序列分別為 SEQ ID N0.:25~27;用于檢測HCV5的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID N0.:28~30。2. 根據權利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，還包括lb-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:31;2a-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:32;6a-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:33;3a-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:34;3b-RT引物，其堿基序列為SEQ ID NO.: 35;la-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:36;4-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:37;5-RT引物，其堿基序列為SEQ ID NO. :38。3. 根據權利要求1所述的寡核苷酸，其特征在于，還包括內標探針和引物，其堿基序列 分別為SEQ ID NO. : 19~21。4. 丙型肝炎病毒基因分型檢測試劑盒，包括HCV RNA/lb/3a RT-PCR反應液、HCV2a/6a/ 3b RT-PCR反應液、HCVla/4/5RT-PCR反應液和酶混合液，其特征在于，所述HCV RNA/lb/3a RT-PCR反應液包括檢測HCV RNA的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :1~3,檢測 HCV lb亞型的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :4~6,檢測HCV3a亞型的探針和 引物，其堿基序列分別為SEQIDN0.:13~15;HCV2a/6a/3bRT-PCR反應液包括檢測HCV2a 的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :7~9,檢測HCV6a亞型的探針和引物，其堿基 序列分別為SEQ ID N0.:10~12,檢測HCV3b亞型的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :16~18;HCVla/4/5RT-PCR反應液包括檢測HCVla的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :22~24,檢測HCV 4亞型的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :25~27,檢 測HCV5亞型的探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO. :28~30。5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述寡核苷酸還包括lb-RT引物，其堿基 序列為SEQ ID N0.:31;2a-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:32;6a-RT引物，其堿基序列 為SEQ ID N0.:33;3a-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:34;3b-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:35;la-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:36;4-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:37;5-RT引物，其堿基序列為SEQ ID N0.:38。6. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，包括內參基因的內標模板，和檢測所述 內參基因的內標探針和引物，所述內標探針和引物，其堿基序列分別為SEQ ID NO.: 19~ 21，所述內標模板為SEQ ID NO.:39。7. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述酶混合液包括RT ACe、rTaq和 RNase〇8. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括PCR緩沖液、MgCl2、 dNTP、BSA、HCV分型陽性對照和HCV分型陰性對照。9. 權利要求8所述的試劑盒，其特征在于，所述HCV分型陽性對照來源于臨床收集的 HCVlb陽性感染的血清樣本，用生理鹽水適當稀釋，經滅活處理的HCVlb陽性血清;所述HCV
【文檔編號】C12Q1/70GK106011308SQ201610086072
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年2月15日
【發明人】張太松, 劉學鋒, 朱麗敏, 呂娜
【申請人】利多(香港)有限公司