一種檢測肺癌相關基因shox2甲基化的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測肺癌相關基因SHOX2甲基化的試劑盒，以游離DNA中目的基因甲基化位點進行檢測，包括三個甲基化的目的基因對應的引物及1個內參基因引物，優選還包括三個目的基因甲基化位點對應的MGB探針及內參基因對應的MGB探針，和三個甲基化目的基因對應的MGB探針。檢測位點不僅包括基因的啟動子區，還包括基因的編碼區，多區域檢測有利于提高SHOX2甲基化的準確性以及特異性。優選的通過MGB探針與甲基化序列特異性結合，對甲基化位點進行更精確的檢測。操作簡便、易于判讀，對儀器的要求不高，整個PCR過程采用全封閉形式，避免了交叉污染的可能，結果更加精準。試劑盒檢測的高靈敏性適用于肺癌的早期篩查。
【專利說明】
-種檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒
技術領域
[0001] 本發明設及肺癌早期篩查檢測技術領域，特別是一種WcfDNA檢測肺癌相關基因 S冊X2甲基化的試劑盒。
【背景技術】
[0002] 據最新的數據顯示，肺癌、乳腺癌分別位居男、女性惡性腫瘤發病首位，男女惡性 腫瘤死亡人數很高的均為肺癌。腫瘤專家指出，近年來在我國癌癥發病的可能呈明顯上升 趨勢，但得到規范治療的患者卻不足一半。肺癌在我國是常見的惡性腫瘤之一，我國的肺癌 發病及死亡年齡自40歲W后迅速上升，70歲達到高峰，75歲W后略有下降。女性和男性年齡 發病的可能和死亡人數的變化趨勢基本一致。但在肺癌死亡人數迅速上升的同時，不同時 期的肺癌死亡人數年齡曲線顯示，肺癌死亡人數高峰出現前移。也就是說，我國肺癌的發病 及死亡年齡有年輕化的趨向。
[0003] 在肺癌的早期階段，所表現出來的病癥與一般呼吸系統疾病類似，并沒有的明顯 的臨床癥狀，待出現相關臨床癥狀時，已是肺癌的中晚期。并且臨床數據表明肺癌發展到中 晚期時，只有15.8%的患者生存期能達到五年W上。因此，早期發現、早期診斷、早期治療是 降低肺癌死亡人數的重要措施。目前，對于肺癌早期篩查的方法有多種，比如低劑量CT診 斷、組織細胞層面的肺癌診斷、基因層面的肺癌診斷等。低劑量CT檢測存在較多的假陽性， 并且檢測成本高;組織層面的肺癌診斷在取樣方面會給患者帶來較大痛苦。而對于基因層 面的診斷，隨著目前分子生物學W及基因檢測技術的快速發展，腫瘤特異性分子標志物檢 測可作為肺癌早期診斷的一種手段。多個臨床實驗結果表明，腫瘤發生過程中某些基因甲 基化程度的不同可作為腫瘤診斷的一種分子標志，并且運種改變是腫瘤所特有的。DNA甲基 化是在腫瘤發生的早期階段，在腫瘤形成初期能夠利用基因檢測手段提前發現，為之后的 預防、治療、疾病監控W及預后提供一個直觀的潛在指標。
[0004] 人矮小同源盒基因甜0X2(sho;rt stature homebox2)是同源盒基因家族的一員， 其表達于中胚層和外胚層，對骨骼、屯、臟和神經系統的發育起到重要的作用。有研究發現， 96%的肺癌患者細0X2發生高度甲基化，并且與基因拷貝數明顯相關。并且最新的研究表 明，SH0X2基因的甲基化與肺癌密切相關，運也提示了細0X2基因的甲基化可能成為肺癌的 早期篩查指標。并且有相關研究表明在-800bp到-900bp、-1550bp到-165化P和+270化P到+ 2800bp等幾個位點S冊X2基因發生甲基化的概率較高。
[0005] DNA異常甲基化是人類腫瘤常見的改變。發生在啟動子區W及基因內部的CpG島異 常甲基化是基因失活的最常見機制。目前檢測DNA甲基化檢測方法有：甲基化特異性的PCR (Methylation-specific PCR，MSP)、亞硫酸氨鹽測序法（Bisulfite sequencing PCR， BSP)、高分辨率烙解曲線法化ighResolution Melting，HRM)和高通量測序方法等。相對于 其他的檢測方法而言，亞硫酸氨鹽測序法(Bisulfite sequencing PCR，BSP)是DNA甲基化 檢測中的"金標準"，檢測較為精準，但其檢測靈敏度相對較低，且操作較繁瑣、成本高。高分 辨率烙解曲線法化igh Resolution Melting,HRM)在PCR擴增中通過觀察烙解曲線的變化 來判斷DM是否發生甲基化，此類方法結果分析相對復雜。高通量測序檢測方法主要是設及 到的成本太高，不利于臨床上的推廣。對于甲基化特異性的PCR(Methylat ion-specific PCR，MSP)檢測方法，操作簡便、耗時較短，結果易于分析。
[0006] 組織活檢對于患者而言除了具有較大的創傷，也會因為腫瘤具有異質性，容易產 生假陰性結果。腫瘤液體活檢是現在比較流行的檢測方法，樣本是血漿，相對組織較易獲 得，且對患者無創。但血漿中腫瘤循環DNA的量較少，且易發生降解。因此，檢測血漿中基因 的甲基化難度相對較大，不僅需要得到高質量的腫瘤循環DNAW及高質量的重亞硫酸鹽轉 化后DNA，而且需要將基因的甲基化高靈敏度、高準確度地檢測出來。因此，對于此類檢測試 劑盒的開發需要具備兩個方面的要求:高特異性W及高靈敏度。
【發明內容】
[0007] 針對現有技術中肺癌檢測產品靈敏度和特異性不佳的問題，本發明的目的是提供 一種通過檢測患者血液中的游離DNA的SN0X2基因啟動區和基因編碼區域中Ξ個目標位點 甲基化情況來判斷患病狀態的試劑盒，達到輔助肺癌早期篩查的目的。上述Ξ個目標位點 對應的基因片段或者DNA片段即本發明技術方案中所述的Ξ個目的基因。
[0008] 本發明提供的檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒，針對待檢樣品中Ξ個目 的基因的甲基化位點進行檢測，其特征在于，包括已經甲基化的Ξ個目的基因對應的引物 及內參基因引物，具體引物序列如下：
[0009] 目的基因1正向引物F:TGATGTTTTTTTGTCGGAG(SEQ ID N0.1)，
[0010] 目的基因 1 反向引物R:TCAAAACAAAAAACCGC(沈Q ID N0.2);
[0011] 目的基因2正向引物F:GTTTGTATTTTTTTCGAT(沈Q ID N0.3)，
[0012] 目的基因2反向引物R:CACGAATAATAAAACGAAT(沈Q ID N0.4);
[0013] 目的基因3正向引物F:TTTTTTGGGTAGTTAATATGG(SEQ ID N0.5)，
[0014] 目的基因3反向引物R:CCAAATAATCTCCGTCC(沈Q ID N0.6);
[0015] 內參基因（β-actin)正向引物F:GTGATGGAGGAGGTTTAG(SEQ ID N0.7)，
[0016] 內參基因（β-actin)反向引物R:AAATTACAAAAACCACAA(沈Q ID N0.8)。
[0017] 本發明為了增加肺癌早期篩查的可靠性，通過選擇與肺癌早期篩查密切相關的Ξ 個甲基化位點，采用特殊的引物設計方法，得出上述四對引物，提高了細0X2甲基化檢測的 靈敏度W及特異性，避免了假陽性和假陰性結果的出現，使得整個試劑盒的檢測準確性明 顯得到提升。
[0018] 優選地，上述檢測肺癌相關基因甜0X2甲基化的試劑盒，還包括Ξ個目的基因甲基 化位點對應的MGB探針W及內參基因對應的MGB探針，具體核巧酸序列如下：
[0019] 目的基因 1探針:FAM-AGCGACGTTGCGT-MGB-B冊 1(沈Q ID N0.9);
[0020] 目的基因2探針:FAM-TTCGGTTCGTAGGT-MGB-B冊 1(沈Q ID N0.10);
[00別]目的基因3探針:FAM-TGCGATTTCGGTCG-MGB-B冊 1(沈Q ID N0.11);
[0022] 內參基因（β-actin)探針：
[0023] VIC-CACCACCCAACACACAAT-MGB-B冊1(沈Q ID N0.12)。
[0024] 上述Ξ種探針序列，核巧酸序列5 '端標記巧光報告基團（FAM或VIC)，3 '端標記巧 光澤滅基團（BHQ1)。利用MGB探針設計手段，采取相對較短的探針序列，更有利于甲基化位 點的識別，進一步提高檢測的特異性和靈敏度。
[0025]優選地，上述檢測肺癌相關基因甜0X2甲基化的試劑盒，還包括Ξ個非甲基化目的 基因對應的MGB探針，具體核巧酸序列如下：
[00%] Blocked引物：AGTGATGTTGTGT-CY3(沈Q ID N0.13);
[0027] Blocked引物：TTTGGTTTGTAGGT-CY3(沈Q ID N0.14);
[002引 Blocked引物：TGTGATTTTGGTTG-CY3(沈Q ID N0.15)。
[0029] 在PCR擴增過程中，目的片段的引物容易與未發生甲基化的基因片段結合，并發生 突破擴增，從而產生非特異性條帶，影響擴增效果。因此，作為優選方案，本試劑盒在每個擴 增體系中額外增加了一條Blocker引物(Blockerl-3分別為目的基因1-3的Blocker引物）， 引物5'端進行CY3修飾后可W阻止擴增，目的是運條引物特異性地與非甲基化基因片段結 合，進而擬棄非甲基化片段的擴增，使目的引物只與甲基化片段結合，進一步提高PCR擴增 效率W及擴增的特異性。
[0030] 優選地，上述檢測肺癌相關基因甜0X2甲基化的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應 液包括DNA聚合酶、dNTPs和Mgh。
[0031] 本發明提供的檢測肺癌相關基因 S冊X2甲基化的試劑盒，具有如下有益效果：
[0032] 本發明試劑盒檢測細0X2甲基化的位點不僅包括基因的啟動子區域，還包括基因 的編碼區域，運樣進行多區域檢測有利于提高SH0X2甲基化的準確性W及特異性，進一步提 高甜0X2的檢出率。該試劑盒在分子水平上對于肺癌早期篩查具有很強針對性，具有檢測特 異性、高靈敏度、準確性高等優點，運樣對于早期可能的肺癌患者及早的進行預防W及采取 相應的治療措施。
[0033] 本發明試劑盒主要采用化qman-MGB探針檢測的手段，通過探針與甲基化序列特異 性結合，進而將甲基化位點精確檢測。對比于用PCR特異性引物進行檢測的方法，利用探針 對甲基化位點進行識別，具有更高的靈敏度、精準性。本發明采用運種技術進行相關基因的 甲基化檢測，操作簡便、易于判讀，對儀器的要求不高，并且整個PCR過程采用全封閉形式， 避免了交叉污染的可能，使結果更加精準。試劑盒檢測的高靈敏性適用于肺癌的早期篩查。
【附圖說明】
[0034] 圖1為實施例1檢測結果。
【具體實施方式】
[0035] 為了使本技術領域的人員更好地理解本發明方案，下面結合【具體實施方式】對本發 明作進一步的詳細說明。
[0036] 實施例1檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒的檢測試驗
[0037] 試劑盒組分如下表：
[00；3 引
[0039] 選取經過已知型別的10個腫瘤血漿樣本:5個鑒定為細0X2甲基化陽性，均為肺癌 樣本;5個為甜0X2甲基化陰性，為非肺癌的腫瘤樣本。
[0040] 1、對上述10例血漿樣本進行提取游離DNA，游離DNA提取試劑盒來自天根生化科技 有限公司。
[0041] 2、游離DNA提取完成，對提取好的DNA進行重亞硫酸鹽轉化，未甲基化的胞喀晚(C) 轉變為尿喀晚化），而甲基化的胞喀晚(C)不變。得到純化好的DNA，轉化試劑盒來自天根生 化科技有限公司。
[0042] 3、配制PCR反應液:DNA聚合酶、dNTPs、Mgh、10XDNA聚合酶buffer、目的基因1引物 探針、目的基因巧I物探針、目的基因3引物探針、內參基因引物探針。
[0043] 4、PCR反應條件為：37°CUDG酶反應2min;95°C預變性3min;94°C變性15s，60退火延 伸35s，45個循環；
[0044] 5、PCR反應體系的配置
[0045] DNA PCR擴增MIX
[0046]
[0049]~PCR擴增程序如下:
' '
[(K)加]第一擴增階段:37 rUDG酶反應2min;
[0化1] 第二擴增階段:95Γ預變性3min;
[0052] 第Ξ擴增階段:94 Γ變性15s，60 Γ退火延伸35s，45個循環；
[0化3]信號收集，第Ξ階段6(TC收集FAM，VIC信號。
[0化4] 6、檢測結果分析
[0055] 利用上述反應體系對10例樣本進行檢測，檢測結果如圖1所示。顯示本發明試劑盒 能夠準確檢出5例陽性樣本，目的基因 l/2/3ct值與內參基因 Ct值之差均小于8,說明甜0X2 發生甲基化。對剩下的5例陰性樣本沒有擴增曲線，目的基因 l/2/3ct值與內參基因 Ct值之 差均大于8，說明S冊X2沒有發生甲基化。（如表1)
[0056] 表1結果判讀參考 [0化7]
[0化引實施案例2:
[0059] 收集來自浙江腫瘤醫院的105例肺癌血漿樣本和15例正常血漿樣本，對運120例血 漿樣本進行SH0X2基因甲基化的檢測，具體操作步驟如實施案例1所述。15例正常血漿樣本 檢測結果目的基因 l/2/3ct值與內參基因 Ct值之差均大于8;而對于105個肺癌血漿樣本，檢 測出90例樣本結果目的基因 l/2/3ct值與內參基因 Ct值之差均小于8,其敏感性達到 85.7%，特異性達到98%。
[0060] W上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的核屯、思想。應當指出，對于本技術 領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可W對本發明進行若干改進 和修飾，運些改進和修飾也落入本發明權利要求的保護范圍內。
【主權項】
1. 一種檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒，用于針對待檢樣品中三個目的基因 的甲基化位點進行檢測，其特征在于，包括已經甲基化的三個目的基因對應的引物及內參 基因引物，具體引物序列如下： 目的基因1正向引物F:TGATGTTTTTTTGTCGGAG， 目的基因1反向引物R:TCAAAACAAAAAACCGC; 目的基因2正向引物F:GTTTGTATTTTTTTCGAT， 目的基因2反向引物R:CACGAATAATAAAACGAAT; 目的基因3正向引物F: ITITTTGGGTAGTTAATATGG， 目的基因3反向引物R:CCAAATAATCTCCGTCC; 內參基因(β-ac t in)正向引物F: GTGATGGAGGAGGTTTAG， 內參基因（β-act in)反向引物R: AAATTACAAAAACCACAA。2. 根據權利要求1所述的檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒，其特征在于，還包 括三個目的基因甲基化位點對應的MGB探針以及內參基因對應的MGB探針，具體核苷酸序列 如下： 目的基因 1探針:FAM-AGCGACGTTGCGT-MGB-BHQ1; 目的基因2探針:FAM-TTCGGTTCGTAGGT-MGB-BHQ1; 目的基因3探針:FAM-TGCGAITTCGGTCG-MGB-BHQ1; 內參基因(β-actin)探針： VIC-CACCACCCAACACACAAT-MGB-BHQ1〇3. 根據權利要求1所述的檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒，其特征在于，還包 括三個非甲基化目的基因對應的MGB探針，具體核苷酸序列如下： Blocker 1 引物:AGTGATGTTGTGT-CY3; Blocker2 引物：TTTGGTTTGTAGGT-CY3; Blocker3 引物：TGTGATTTTGGTTG-CY3。4. 根據權利要求1所述的檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒，其特征在于，還包 括PCR反應液、重亞硫酸鹽和UDG酶。5. 根據權利要求4所述的檢測肺癌相關基因 SH0X2甲基化的試劑盒，其特征在于，所述 PCR反應液包括DNA聚合酶、dNTPs和Mg2+。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011292SQ201610602854
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月27日
【發明人】劉沛, 王林海
【申請人】北京鑫諾美迪基因檢測技術有限公司