一種快速檢測g6pd缺乏癥基因突變的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發明公開了一種快速檢測G6PD缺乏癥基因突變的試劑盒，包括擴增檢測試劑，所述擴增檢測試劑包括下述(1)?(5)中的至少一個引物對：(1)用于檢測G6PD基因G1376T突變位點的特異擴增引物對；(2)用于檢測G6PD基因G1388A突變位點的特異擴增引物對，(3)用于檢測G6PD基因A95G突變位點的特異擴增引物對，(4)用于檢測G6PD基因G871T突變位點的特異擴增引物對，(5)用于檢測G6PD基因C1024T突變位點的特異擴增引物對。當試劑盒同時包括上述5對引物時，可以實現在單個反應管中同時檢測G1376T、G1388A、A95G、G871T和C1024T等5種突變類型。
【專利說明】
-種快速檢測G6PD缺乏癥基因突變的試劑盒
技術領域
[0001] 本發明設及醫學檢測技術領域，具體設及一種快速檢測G6PD缺乏癥基因突變的試 劑盒。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖-6-憐酸脫氨酶（glucose-6-phosphatedehy化ogenase ,G6PD)缺乏是常見 的遺傳性紅細胞酶病，又稱蠶豆病，它是糖酵解憐酸戊糖旁路中的一個關鍵酶和限速酶，并 普遍存在各種生物細胞內。G6H)缺乏會引起藥物性溶血、感染性溶血和非球形細胞溶血性 貧血等疾病的發生，新生兒由急性溶血性貧血可引起核黃痘，嚴重可導致智力低下等情況 的發生。
[0003] G6PD缺乏癥在世界范圍內都比較普遍，并具有區域特異性，在熱帶和亞熱帶地區 該病發病率較高，存在南高北低的趨勢，不同民族差異明顯，同一地區差異不顯著等特點。 在高發區G6PD缺乏癥是引起新生兒高膽紅素血癥最主要的原因，嚴重者可因腦神經系統損 害導致不可逆的智能和身體殘疾，因此聯合國衛生組織把該病列入6種主要應該預防和控 制的遺傳病之一。
[0004] G6PD缺乏癥的分子基礎是基因突變，G6ro基因是一個看家基因，位于X染色體長臂 的2區8帶，基因全長20114bp，由13個外顯子和12個內含子組成，編碼區長1548bp，編碼515 個氨基酸。隨著對G6PD分子結構的不斷闡明和研究的不斷深入，用WHO標準化方法鑒定的 G6PD生化變異型達400余種，基因突變型達到140余種。在中國人群中，A95G、G1376T、 G1388A、G871T、C1024T等5種突變類型是中國人群中最常見基因突變型，約占總突變率的 90%W 上。
[000引自1991年化en等報告了基因全序列后，G6PD研究進入了基因水平，目前我國對常 見已知G6PD基因突變的篩查方法有等位基因寡核巧酸探針雜交（Alleles-specific oligonucleotide probe，AS0)，該方法需要比較繁瑣的PCR后的雜交盒洗脫等步驟，不僅操 作繁瑣，而且如果雜交或洗脫的條件控制不好時，易出現假陰性或假陽性的結果。錯配堿基 聚合酶反應/限制性內切酶圖譜分析也能實現突變位點的檢測，但此方法同樣較為繁瑣，而 且經常出現酶切不完全的現象，造成結果判斷不準確。杜傳書報道的突變特異性擴增系統 (ARMS)在中國人常見突變的檢測中具有簡便、快速、準確和經濟等特點，但由于引物設計要 求較高，早期還不能實現單管同時檢測多個突變位點，因此，增加了實驗的繁瑣性，不利于 突變位點檢測的廣泛推廣應用。
[0006]隨著分子診斷技術的不斷發展，更多的檢測方法應用于G6PD基因突變的檢測。近 年來發展起來的一種自動化、高通量的基因篩查技術一變性高效液相色譜（Denaturing High Performance Liquid化romatogra地ty，DHPLC)，已廣泛用于遺傳病基因突變篩查和 單核巧酸多態性（Single Nucleotide Polymo;rphisms,SNP)的分析。運類技術的出現使 G6PD突變的檢測相對較便捷和穩定，但該方法需要較為昂貴的儀器設備，因此，也不利于市 級W下單位的推廣應用。高分辨率烙解曲線化RM)對G6PD基因進行未知突變檢測，有一定的 優越性與易操作性，但是對于常見突變位點的檢測，往往需要多管操作，因而不利于常見突 變位點的篩查使用。
【發明內容】
[0007] 本發明要解決的技術問題是提供一種快速檢測G6PD缺乏癥基因突變的試劑盒，具 體來說是一種基于多重突變特異性擴增系統(ARMS)-多重烙解曲線技術快速檢測G6PD基因 位點613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5種突變類型的突變的試劑盒。采用該試劑盒 可在單管中同時檢測613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5種突變類型，而且在檢測時 無需進行PCR后的電泳檢測分析，直接通過烙解曲線方法就能判斷擴增的有無，檢測更為快 速、簡便，且檢測結果準確。
[0008] 本發明所述的快速檢測G6PD缺乏癥基因突變的試劑盒，包括擴增檢測試劑，其特 征在于:所述的擴增檢測試劑包括下述(1)-(5)中的至少一個引物對：
[0009] (1)用于檢測G6PD基因 G1376T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分 別如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2所示；
[0010] (2)用于檢測G6PD基因 G1388A突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分 別如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:3所示；
[0011] (3)用于檢測G6PD基因 A95G突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別 如沈Q ID NO:4和沈Q ID NO:5所示；
[0012] (4)用于檢測G6TO基因 G871T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別 如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:7所示；
[001引（5)用于檢測G6PD基因 C1024T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分 別如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:8所示。
[0014] 本發明試劑盒中所設及的引物是針對已知突變位點的G1376T、G1388A、A95G、 G871T、C1024T等5種突變類型的位點引物，引物能特異的擴增發生突變的運5個位點，未發 生突變的位點不會有擴增。本發明試劑盒中的引物對SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:2用于檢測 G1376T位點的突變情況;SEQ ID N0:1和SEQ ID N0:3用于檢測G1388A位點的突變情況;SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:5用于檢測A95G位點的突變情況;SEQ ID N0:6和沈Q ID N0:7用于檢 巧化871T位點的突變情況;SEQ ID N0:6和SEQ ID N0:8用于檢測C1024T位點的突變情況。其 中，SEQ ID NO: 1既作為檢測G1376T位點突變的引物對中的上游序列，同時也作為檢測 G1388A位點突變的引物對中的上游序列；SEQ ID N0:6既作為檢測C1024T位點突變的引物 對中的上游序列，同時也作為檢測G871T位點突變的引物對中的上游序列。
[0015] 在實際的應用過程中，本發明所述試劑盒中每對引物均可單獨使用，也可將其任 意組合使用。當試劑盒包括上述（1)-(5)中全部的引物對時，可W實現在單個反應管中同時 檢測 613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5種突變類型。
[0016] 本發明所述試劑盒采用的是烙解曲線法，因此，本發明試劑盒中還包括巧光染料， 具體可W是LC Green染料、SYBR Green I染料、G-Green染料或現有技術中常規使用的其它 染料。優選采用LC Green染料，運樣可W進一步提高檢測結果的準確性、穩定性和分辨率。
[0017] 本發明所述試劑盒還包括一些現有試劑盒中常規且必須的組分，如陽性對照模 板、陰性對照模板、緩沖液、酶液、dNTP、Mgh等。
[0018] 本發明所述試劑盒用于檢測613761\613884、4956、68711'、(：10241'等5種突變類型， 檢測原理如下:本發明所述的試劑盒引物僅能特異的擴增發生突變的上述5種類型的位點， 如果發生突變，相應的，在檢測烙解曲線的結果中就會有烙解曲線峰；而如果沒有發生不 變，檢測烙解曲線的結果就沒有烙解曲線峰。
[0019] 同時，不同突變位點的烙解曲線的烙點也不相同。當本發明試劑盒中的巧光染料 為LC Green染料，酶液、緩沖液及其它現有試劑盒中的常規且必須組分(如dNTP、Mgh等）均 為北京康為世紀生物科技有限公司的產品時，本試劑盒對各突變位點進行擴增所得的擴增 產物的烙點分別如下：突變位點613761\613884、4956、68711'和(：10241'的突變擴增產物的烙 點分別為 78.5±0.2°(：、81.0±0.2°(：、83.5±0.2°(：、86±0.2°(：和87.5±0.2°(：，進一步確定 為78.5 °C、8rC、83.5 °C、86 °C和87.5 °C。可見，采用本發明所述試劑盒通過不同烙解曲線烙 點的分析就能判斷突變的位點和類型。
[0020] 與現有技術相比，當本發明所述試劑盒同時包括（1)-(5)中全部的引物對時，可W 實現在單個反應管中同時檢測613761\613884、4956、68711'和(：10241'等5種突變類型，在口〇? 后儀器即可自動檢測結果；而傳統的ARMS不僅需要多管處理，而且需要PCR后電泳檢測（如 在檢測本試劑盒中所提到的5種類型的突變時，傳統的ARMS方法需要5個PCR管，分別檢測運 5種類型的突變;在擴增完成后，還需要通過電泳檢測是否有擴增片段，從而再判斷突變的 情況），因此，本發明所述試劑盒具有快速、簡便、準確、可批量化、應用廣泛、成本低廉等諸 多優點。
【附圖說明】
[0021] 圖1為G1376T突變位點擴增產物的烙解曲線；
[0022] 圖2為G1388A突變位點擴增產物的烙解曲線；
[0023] 圖3為A95G突變位點擴增產物的烙解曲線；
[0024] 圖4為G871T突變位點擴增產物的烙解曲線；
[0025] 圖5為C1024T突變位點擴增產物的烙解曲線。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發明作進一步的詳述，W更好地理解本發明的內容，但 本發明并不限于W下實施例。
[0027] 實施例1:采用本發明所述試劑盒對正常標本、G1376T突變樣本、G1388A突變樣本、 A95G突變樣本、G871T突變樣本和C1024T突變樣本共1種正常樣本和5種突變類型的樣本進 行檢測。
[0028] 1、突變特異性擴增系統引物的設計
[0029] 突變特異性擴增系統(ARMS)最重要的是如何設計出特異性的引物，因為野生型和 突變型的序列幾乎完全相同，只是突變位點具有一個堿基的差異，因此，如果僅僅W突變位 點為引物末端進行擴增，在擴增過程中很容易出現假陰性或假陽性的擴增產物，從而影響 診斷的準確性。因此，還需要在突變位點之前的引物序列，人為的引入1-3個不相匹配的堿 基，從而提高擴增的特異性。
[0030] 2、試劑盒的組成：
[0031] 2.1ARMS 引物
[0032] (1)用于檢測G6PD基因 G1376T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分 別如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:2所示：
[0033] CAAGCCATACTATGTCCCCTCAG(SEQ ID N0：1)；
[0034] TGAAAATACGCCAGGCCTCAA(SEQ ID NO：2)；
[0035] (2)用于檢測G6PD基因 G1388A突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分 別如沈Q ID NO: 1和沈Q ID NO:3所示：
[0036] CAAGCCATACTATGTCCCCTCAG(SEQ ID N0：1)；
[0037] TGCAGCAGTGGGGTGAAATTAT(沈Q ID N0:3);
[0038] (3)用于檢測G6PD基因 A95G突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別 如沈Q ID NO:4和沈Q ID NO:5所示：
[0039] CCCTGAGCCGGACCCA(SEQ ID NO：4)；
[0040] GATGCACCCATGATGATGAATTTGC(沈Q ID N0:5);
[0041 ] (4)用于檢測G6PD基因 G871T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別 如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:7所示：
[0042] TGAGCTGGGCCTCTGGCAG(SEQ ID N0：6)；
[0043] TGCTCCTCTGAGATGCATTTCATCAT(沈Q ID N0:7);
[0044] (5)用于檢測G6PD基因 C1024T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分 別如沈Q ID NO:6和沈Q ID NO:8所示：
[0045] TGAGCTGGGCCTCTGGCAG(SEQ ID N0：6)；
[0046] CCACCTCTCATTCTCCACATTGAA(SEQ ID N0：8)〇
[0047] 2.2其它組成成分：
[004引 Hotstar-Taq酶，緩沖液，LC Green染料，dATP、dTTP、dCTP和dGTPW及Mgh均購自北 京康為世紀生物科技有限公司。
[0049] 3、PCR反應體系的配制：
[0050] 按下述表1配制PCR反應體系：
[0051] 表1: (ml表示mmol/L，yM表示皿ol/L)
[0化2]
[0053] PCR反應體系為50uL。
[0化4] 4、樣本的來源及處理
[0055]樣本來源于經測序分析，已經確認為5種突變類型的樣本，DNA樣本采用實驗室常 規DNA提取方法進行提取，W雙蒸水稀釋至20ngAiL，并于-20°C保存備用。
[0056] 5、PCR擴增程序：
[0057] PCR反應所用儀器為普通的PCR儀。PCR反應程序為:95Γ預變性10min;95°C15sec， 60°C30sec，72°Clmin，32個循環;在72°C延伸lOmin;然后從72°C到92°C進行烙解曲線分析。 [0化引 6、結果檢測與分析：
[0059] 試劑盒檢測5種突變位點，只要有突變發生，即可擴增出相應的擴增產物，而不同 的擴增產物其烙解曲線的烙點都有差異，因而可W根據不同烙解曲線烙點的差異判斷突變 的類型。其中：
[0060] G1376T突變位點的擴增產物烙解曲線的烙點為78.5Γ(如圖1所示）；
[0061] G1388A突變位點的擴增產物烙解曲線的烙點為SrC (如圖2所示）；
[0062] A95G突變位點的擴增產物的烙點為83.5Γ(如圖3所示）；
[0063] G871T突變位點的擴增產物烙解曲線的烙點為86°C (如圖4所示）；
[0064] C1024T突變位點的擴增產物烙解曲線的烙點為87.5°C (如圖5所示）。
[00化]實驗結果顯示，試劑盒的檢測體系能非常有效檢測出G1376T、G1388A、A95G、G871T 和C1024T的突變位點，與測序結果一致，因此，本發明所述試劑盒能用于臨床標本的檢測。
[0066] 實施例2:用實施例1所述試劑盒、方法、步驟等對臨床標本進行檢測
[0067] 采用試劑盒對62例篩查陽性的樣本進行檢測，同時對本方法檢測陽性的樣本進行 測序驗證，W確認本方法的準確性。
[006引判斷依據：
[0069] 當擴增產物烙解曲線的烙點為78.5Γ時判定為位點G1376T突變；
[0070] 當擴增產物烙解曲線的烙點為SrC時判定為位點G1388A突變；
[0071 ]當擴增產物烙解曲線的烙點為83.5 °C時判定為位點A95G突變；
[0072] 當擴增產物烙解曲線的烙點為86 °C時判定為位點G871T突變；
[0073] 當擴增產物烙解曲線的烙點為87.5Γ時判定為位點C1024T突變。
[0074] 對62例篩查陽性樣本的檢測結果見表2。
[0075] 表2:G6PD基因突變的檢測結果
[0076]
[0077]
[0078] 實驗結果表明，本發明所述基于多重突變特異性擴增系統(ARMS)-多重烙解曲線 技術的試劑盒可實現單管同時檢測G6PD基因突變位點613761\613884、4956、68711'和 C1024T等5種突變類型的檢測，檢測結果與測序方法一致，準確率為100%，結果可讀性好， 分析、檢測過程簡單、高效。
【主權項】
1. 一種快速檢測G6ro缺乏癥基因突變的試劑盒，包括擴增檢測試劑，其特征在于:所述 的擴增檢測試劑包括下述(1)-(5)中的至少一個引物對： (1) 用于檢測G6PD基因 G1376T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別如 SEQIDN0:GPSEQIDN0:2m*; (2) 用于檢測G6PD基因 G1388A突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別如 SEQIDN0:GPSEQIDN0:3m*; (3) 用于檢測G6H)基因 A95G突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示； (4) 用于檢測G6PD基因 G871T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別如 SEQIDN0:6和SEQIDN0:7所示； (5) 用于檢測G6PD基因 C1024T突變位點的特異擴增引物對，其上下游堿基序列分別如 SEQIDN0:6和SEQIDN0:8所示。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于:該試劑盒還包括熒光染料。3. 據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：所述的熒光染料為L C G r e e η染料、S Y B R Green I染料或G-Green染料。4. 根據權利要求1-3中任一項所述的試劑盒，其特征在于：該試劑盒還包括緩沖液、酶 液、Mg2+和 dNTP。5. 根據權利要求4所述的試劑盒，其特征在于：當試劑盒中的熒光染料為LC Green染 料，酶液及緩沖液均為北京康為世紀生物科技有限公司的產品時，本試劑盒對各突變位點 進行擴增所得的擴增產物的熔點分別如下： (1 )G1376T突變位點的擴增產物的熔點為78.5 ±0.2°C ; (2) G1388A突變位點的擴增產物的熔點為81.0±0.2°C ; (3) A95G突變位點的擴增產物的熔點為83.5 ±0.2°C ; (4) G871T突變位點的擴增產物的熔點為86±0.2°C; (5) C1024T突變位點的擴增產物的熔點為87.5±0.2°C。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011285SQ201610594099
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月26日
【發明人】樊祖茜, 孫雷, 唐維駿
【申請人】欽州市婦幼保健院