一種mody型糖尿病基因檢測試劑盒及突變位點的制作方法
【專利摘要】本發明涉及一種MODY型糖尿病基因檢測試劑盒及突變位點，所述試劑盒針對HNF1A、GCK和KCNJ11基因。所述突變位點為c.160C>T、c.932C>A、c.8C>T、c.51C>G或c.823G>A。經過本發明試劑盒的檢測，通過判斷突變位點即可輔助了解青少年糖尿病的遺傳因素背景，為臨床上患者的個體化治療、預后判斷和預防干預提供便利。
【專利說明】
-種MODY型糖尿病基因檢測試劑盒及突變位點
技術領域
[0001] 本發明屬于M0DY型糖尿病領域，特別設及一種M0DY型糖尿病基因檢測試劑盒及突 變位點。
【背景技術】
[0002] 流行病學調查表明中國青少年糖尿病患病率為3.2-4.5% (18-30周歲），世界范圍 內青少年T1DM的發病率呈現逐年上升趨勢，目前成人T1DM發病率的流行病學資料較少，W冊 DIAMOND 1990-1994年的研究表明，全球小于15歲兒童的T1DM發病率每年的增長速率為 3.4%，其中歐洲增長速率為3.2%，北美地區為5.3%，亞洲為4.0%。我國15歲W下兒童的 T1DM發病率為0.1-4.5/10萬人年，是世界上T1DM發病率最低的國家之一，低于北歐高加索 人約365倍。中國預防醫學科學院1988年至1996年的研究表明，我國T1DM發病率為0.59/10 萬人年，整體呈南低北高的變化規律。較近的一項對上海1997-2011年的回顧性研究表明， 14歲W下兒童T1DM發病率為3.1/10萬人年，發病率平均每年增長14.2%。相比于西方國家， 中國的T1DM患病率極低，但發病率增長明顯，且我國人口基數大，病例絕對數并不少。此外， 隨著我國經濟的快速發展和人民生活方式的改變，與肥胖密切相關的T2DM的低齡化傾向也 在日漸明顯。特殊類型的糖尿病中，W青少年起病的成人型糖尿病（maturity onset diabetes of the young,MODY)最受關注。MODY是一種常染色體顯性遺傳的單基因遺傳病， 主要是由于膜島β細胞葡萄糖刺激下的膜島素分泌功能障礙所致，通常于青春期及青年期 發病。在歐洲，MODY的發病率占總糖尿病人群的1 %~2%，在18-45歲的人群中，發病率為百 萬分之108。
[0003] 在特殊類型糖尿病中，MODY發病率相對較高，且有明確的遺傳規律，因此研究MODY 具有重要意義。首先，MODY的診斷有助于設計更個體化的治療方案。例如，M0DY2患者大多不 需要藥物治療，僅通過飲食和運動即可良好控制血糖;而M0DY3患者則對較小劑量橫脈類藥 物治療敏感。其次，MODY的正確診斷有助于判斷患者預后，例如，M0DY2患者雖然高血糖持續 存在，在隨后的數年中血糖無持續增高趨勢，且長期隨訪慢性并發癥少見，預后良好。運將 極大減輕患者的屯、理和經濟負擔；而M0DY3患者血糖隨著病程延長而增高，β細胞功能呈進 行性降低，可出現各種慢性并發癥，特別是微血管并發癥，尤W視網膜和腎臟病變最為常 見。明確的分子遺傳學診斷可為MODY患者及其親屬提供遺傳學指導。
【發明內容】
[0004] 本發明所要解決的技術問題是提供一種MODY型糖尿病基因檢測試劑盒及突變位 點，經過本發明試劑盒的檢測，通過判斷突變位點即可輔助了解青少年糖尿病的遺傳因素 背景，為臨床上患者的個體化治療、預后判斷和預防干預提供便利。
[0005] 本發明的一種MODY型糖尿病基因檢測試劑盒，所述試劑盒針對HNF1A、GCK和 KCNJ11基因，含有下列引物對：
[0006] HNF1A：1F：GGGTGCAAGGAGTTTGGTTTGT；
[0007] 1R:CCCTTCCCAGCAACTAGGCTAA;
[0008] 2F：CCATACCTCACCGTCCCTGAGT；
[0009] 2R：TGCAGGTTGAATCCCACTGACT；
[0010] 3F：AAGTGATGGCATGTGTGCTGTG；
[0011] 3R：CGAGGAATGGGCTTAGGTTCAA；
[0012] 4F：ATGGAGAGACTGAGGTCAGACA；
[00。] 4R:GAGTGATAAGGAGTGGCATGAA;
[0014] 5-6F：AAGTGCTGAGGGCTGTGGAG；
[0015] 5-6R：ATGTAGCACAGTGACTGGTCCAG；
[0016] 7F：GAGGGGGAATGACTTGCCAG；
[0017] 7R：CCCTCAATCACGGAAACACA；
[001 引 8-9F：TCTGGAGCCTCCAGTTTTGA；
[0019] 8-9R：CTGCCAGTGCTTCCTCACAG；
[0020] 1OF：AAGAACCGAGGGTAGAGGTGTG；
[0021] 1OR：TGCTCCTAGCTCTCCACGAC；
[0022] GCK：lAF：CCGACTCGTTGGAGAACAAT；
[0023] lAR：TCCAAAGCTGGATGGGTCTG；
[0024] 1邸：GGGCAGAGTATTTGAGCAGC;
[00 巧]1BR:CATGTGCCTCCTTCCAAGGT;
[0026] 1CF：TCCCACTGCTATCCAACCTG；
[0027] 1CR：GGCTGTCCTAACAATCCCTGTG；
[00 巧]2F:GGGGTCAGAAGACAGAAGGA;
[00 巧]2R:GCCCAAGTCGAGGACTTCAT;
[0030] 3F：TTCCCTGGTTGACCTTTGAC；
[0031] 3R：GATGGTGACTGTGGGACTTG；
[00；32] 4F:AGCAGCAGCGGAAGAGGAGA;
[0033] 4R：TCCAGATCTCCCTTCTGAGCAC；
[0034] 5-6F：AGAATCGTTCCCAAAACCTCTC；
[0035] 5-6R：GGCGTTGAAATGCTTCCTACTG；
[0036] 7F：CCACTGAAGCAACCCAGGTC；
[0037] 7R：TGGAGCTTACGAACGGATTG；
[0038] 8F：GCACGTTCCTAATCCCTGAC；
[0039] 8R：GGCCCTAGTTTCCCATCC；
[0040] 9-1OF：CTGGCGGAAACGCTTTGG；
[0041 ] 9-lOR GCTGTCCCACCGAAAAACTG；
[0042] KCNJl1：1-lF：AGTGAAGTGGGACCCAGGTG；
[0043] 1-lR：CTTGCGTACCACCTGCATGT；
[0044] 1-2F：CATCGTGCAGAACATCGTG；
[0045] 1-2F：TAACACCCTGGATGAGCAG 〇
[0046] 所述試劑盒還包括DM提取試劑、Taq DM聚合酶、PCR緩沖液和dNTP混合物。
[0047] 所述試劑盒的PCR反應條件為:94°C預變性5min;94°C變性Imin，退火lmin，72°C延 伸Imin，最后72 °C延伸5min，30個循環;恢復至4°C。
[0048] 本發明的一種M0DY型糖尿病基因檢測試劑盒檢測得到的突變位點，所述突變位點 為C. 160C〉T、c. 932C〉A、c. 8C〉T、c. 510G或 C. 823G〉A。
[00例有益效果
[0050] 經過本發明試劑盒的檢測，通過判斷突變位點即可輔助了解青少年糖尿病的遺傳 因素背景，為臨床上患者的個體化治療、預后判斷和預防干預提供便利。
【附圖說明】
[0051] 圖1為患者A測序結果；其中，左圖箭頭處示HNF1A基因（c.l60C〉T)雜和突變，右圖 為該位點正常對照；
[0052] 圖2為患者B測序結果；其中，左圖箭頭處示HNF1A基因（C.160OT)雜和突變，右圖 為該位點正常對照；
[0053] 圖3為患者C測序結果；其中，左圖箭頭處示HNF1A基因（C.9320A)雜和突變，右圖 為該位點正常對照。
【具體實施方式】
[0054] 下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，運些實施例僅用于說明本發明 而不用于限制本發明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之后，本領域技術人 員可W對本發明作各種改動或修改，運些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定 的范圍。
[0化5] 實施例1
[0056]研究人群:70個就診或者既往被確診為糖尿病的患者，年齡限于12-30歲，男女不 限。
[0化7] 1.外周血DNA抽提：
[005引取-80°C凍存邸TA抗凝管全血，使用QiAAmp如NA Blood MinAit抽提DNA。
[0化9] 1)取200U1已添加抗凝劑的血液樣品至1.5ml離屯、管中，再加入40U1蛋白酶K溶液， 再加入200ul AL Buffer,立刻禍旋振蕩充分混勻15秒；
[0060] 2)在56°C 烘箱放置 30min;
[0061] 3)從烘箱中取出裂解后的標本，短甩；
[0062] 4)加入200U1無水乙醇，立刻潤旋振蕩充分混勾，短甩；
[0063] 5)將上一步混合物(包括可能有的沉淀）加入一個吸附柱中（吸附柱放入收集管 中），蓋上蓋子，8,000巧m離屯、Imin,換收集管；
[0064] 6)加入500ul AWlBuffer，蓋上蓋子，最大轉速離屯、3min，接著再最大轉速離屯、 Imin，換收集管；
[0065] 7)加入500ul AW2Buffer，蓋上蓋子，8，000巧m離屯、Imin，倒掉收集管的液體，空柱 子干甩Imin;
[0066] 8)取出吸附柱，放入一個消過毒的新離屯、管中，把裝有濾液的收集管扔掉。在吸附 柱內加入lOOul AE Buffer,室溫放置30min左右，然后8,000巧m離屯、1.5min [0067] 9)加入lOOul AE Buffer,室溫放置lOmin左右，然后8,000巧m離屯、1.5min.
[006引10)扔掉吸附柱，測0D值，儲存于4°C冰箱備用。
[00例 2.PCR擴增基因：
[0070] 引物、相應退火溫度及擴增片段長度見表1
[0071] 表1測序基因擴增引物序列
[0072]
[0073]
[0074]
[00巧]2)PCR反應體《（24ul)配制：
[0076] DM模板lul;
[0077] Taq DM聚合酶0.15ul(TaKaRa);
[007引 10 X PCR緩沖液(MghpLus) 2.加1 (TaKaRa);
[00巧]dNTP MixUire 2ul(TaKaRa);
[0080] 上游引物0.加1;
[0081 ] 下游引物0.加1;
[0082] 去離子Ξ蒸水17.3加1。
[0083] 3)PCR擴增參數設置：
[0084] 94°C 預變性 5min;94°C 變性 Imin，退火 lmin，72°C 延伸 Imin，最后 72°C 延伸 5min，30 個循環;恢復至4°C。
[0085] 4)將PCR擴增產物采用2%瓊脂糖凝膠電泳(300￥，3〇111111)，紫外分析儀顯示有清晰 的目的條帶后送上海銷尚生物技術有限公司進行正、反向直接測序，測序系統采用美國AB 公司（Applied Biosystems,i^ster City,CA)ABI 3730化測序儀。
[00化]4.序列比對和分析
[0087] 1)基因序列比對
[0088] 基因組參考序列來源于UCSC數據庫化ttp://genome, ucsc.edu/)和NCBI數據庫 (http://www.ncbi .nlm.nih.gov/pubmed)。通過 NCBI 數據庫（http:// blast. ncbi . nlm. nih. gov/Blast. cgi)將測序結果txt文本與測序圖進行在線序列比對。
[0089] 2)單核昔酸多態性(SNP)及突變位點的數據庫檢索
[0090] 采用化SNP數據庫和千人基因組數據庫（lOOOGenomes)檢索是否為SNP位點，采用 人類基因突變數據庫(HGMD，2015年4月）檢索是否為新發現變異。
[0091] 3).新發現變異的功能預測
[0092] 檢索后明確為新發現變異的，同時采用生物信息學軟件
[0093] Polyphen-2( http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)和SIFT化ttp:// sift, jcvi .org/)進行在線功能學預測。PolyPhen_2軟件根據評分的高低將突變分為很可 能有害（probablydamaging)、可能有害（possibly damaging)和良性（benign)S個等級， SIFT軟件根據評分高低將突變分為有害(damaging)和可耐受(tolerated)兩種。
[0094] 5.結果
[00M] (1)基因檢測結果
[0096] 對70例糖尿病患者進行版)DY2(GCK)、M孤Y3化NF1A)、M0DY13化CNJ11)基因測序。確 診M0DY患者3例，均為HNF1A基因突變導致的M0DY3，占所有未分型患者的4.3 %。2例M0DY家 系的遺傳模式均為常染色體顯性遺傳，1例為de novo突變。突變來源家系及基因檢測的具 體結果見表2。如表2所見，HNF1A基因突變最常發生在1號和4號外顯子，突變形式W無義突 變和錯義突變出現。
[0097] 糖尿病患攜帶4個已知2型糖尿病易感SNP位點，為HNF1A基因 rsll69288(I2化， c.79A乂）、rs2464196(S487N，c.l460G〉A)及KCNJll基因 rs5219化23E，c.67A〉G)、rs5215 (V337I，c100 9G〉A)。攜帶rsll69288和/或rs2464196位點的先證者有28例，占40% ;攜帶 rs5219和/或rs5215位點的先證者有47例，占67.1 % dSNP位點的攜帶情況如表3所示。
[009引表2糖尿病患者GCK、HNF1A和KCNJ11基因檢測結果
[0102] 注:HGMD'編號來自HGMD數據庫(2015年4月）。
[0103] (2)新發現變異的生物信息學分析
[0104] 上述2個HNF1A突變位點均為己經報道過的突變，并明確基因相關功能。經與HGMD 數據庫及化SNP數據庫比對，確認3個為新發現的HNF1A遺傳變異形式，分別為S3F(c. 8C〉T)、 LI化(。.5106)、62751(((3.8236〉4)。采用生物信息學軟件對新發現的變異位點進行突變有 害性分析。PolyPhen-2和SIFT軟件都對S3F和L1化給出了良性的預測，而對E275K，兩種軟件 都給出了巧害性"的結論。
[0105] (3)結論
[0106] 本實施例選擇M0DY2化肥14)、]\?)0￥3(60〇、]\?)0￥13化〔附11)運^個基因進行篩查。
[0107] 本實施例基因測序發現3例由HNF1A基因突變導致的M0DY3,其中兩例相互獨立的 患者發生exonl的無義突變354乂((3.16001')。1?54乂((3.16001')首次在英國的1'101家系中發 現，該研究對18個連續立代1101家系進行HNF1A基因測序，發現1例R54X突變，未做功能學研 究。文獻顯示，該突變也見于漢族的M0DY家系。3D構象顯示，該位點的無義突變導致HNF1A蛋 白截斷。正常情況下，HNF1A基因編碼631個氨基酸的蛋白質和至少3個結合模體，其中包括 DNA結合模體，54位氨基酸上發生無義突變造成了嚴重截斷，從而喪失了 DNA結合模體結合 DNA的功能。本研究的另一例M0DY3為exon4的錯義突變A311D(c.932C〉A)，該突變首次在中 國人群中發現，該研究在146個相互獨立的M0DY家系中篩查M0DY1、M0DY2和M0DY3，發現13例 M0DY3和兩例M0DY2,其中A311D(c.932C〉A)使用Chou-Fasman方法預測能夠影響HNFIA蛋白 功能，未做功能學研究。上述兩個突變位點都見于中國的M0DY家系，可見運兩種突變形式是 中國較為高發的M0OT3形式。
[0108] 本實施例中1例患者(A)的父母均未攜帶R54X突變，因此該患者發生了 denovo突 變。斯洛伐克和捷克近期的一項研究對150例沒有明確兩代或W上家族史的先證者篩查 Μ孤Y1、M0DY2和M0DY3，發現58例有M0DY基因突變，其中28例無法收集家系，19例患者的父母 是無癥狀的突變攜帶者，而11例患者是denovo突變，即至少有7.3%的患者發生了M0DY基因 的denovo突變。因此，M0DY基因的denovo突變頻率可能比預期要高。在臨床上，對于符合其 他條件而缺乏家族史的患者，仍然應該考慮篩查M0DY基因。
[0109] 本實施例新發現Ξ個變異形式，其中S3F(c.8C〉T)和1^化((3.5106)用生物信息學 軟件化ly化en-2和SIFT分析得到了良性的預測，而對E275K(c.823G〉A)，兩種軟件都給出了 "有害性"的結論。有兩例患者發生E275K變異，分別是患者B和C，患者B14歲，男，BMI 24.92kg/m2，FCP 1.24ng/ml，抗體均為陰性，目前使用二甲雙脈治療，外公有糖尿病史。患 者C31歲，男，BMI 22.2化g/m2，FCP1.61ng/ml，抗體均為陰性，目前使用沙格列汀治療，母 親、外公、二舅有糖尿病史。明確E275K是否是新發現的M0DY基因需要進一步收集家系，驗證 正常人中的攜帶情況W及功能驗證。
[0110] 本實施例并未發現GCK突變導致的M0DY2和KCNJ11突變導致的M0DY13。考慮與W下 原因有關:其一，M0DY2患者的臨床癥狀較輕，僅空腹血糖輕度升高，往往是通過查體偶然發 現的，一般通過飲食調整即可控制，且很少發生酬癥等急性并發癥。而本實施例中70%的患 者來自于病房，入選的病人大多血糖相對較高，病情較重，因此不容易納入M0DY2患者。其 二，KCNJ11基因在2012年被命名為M0DY13,至今共發現4個M0DY13家系，可見發病率不高。 M0DY3由肝細胞核因子Ια突變所致，該基因突變可導致B細胞發育不良，進行性功能喪失。患 者"Ξ多"癥狀明顯，餐后化血糖水平高，患者高血糖隨著病程延長而增高，可給予小劑量橫 脈類藥物治療。大多數M0DY3患者的血清高敏C反應蛋白化sCRP)水平降低，可將hsCRP作為 輔助臨床診斷的標志物，敏感性90%，特異性80%。
[0111] 本實施例共發現3例由HNF1A基因突變導致的M0DY3,4個與2型糖尿病易感有關的 SNP位點，W及3個新的HNF1A遺傳變異形式，促進更深入了解青少年糖尿病的遺傳因素背 景，為臨床上患者的個體化治療、預后判斷和預防干預提供便利。
【主權項】
1. 一種MODY型糖尿病基因檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒針對HNF1A、GCK和 KCNJ11基因，含有下列引物對： HNF1A：IF：GGGTGCAAGGAGTTTGGTTTGT； 1R：CCCTTCCCAGCAACTAGGCTAA； 2F：CCATACCTCACCGTCCCTGAGT； 2R：TGCAGGTTGAATCCCACTGACT； 3F：AAGTGATGGCATGTGTGCTGTG； 3R：CGAGGAATGGGCTTAGGTTCAA； 4F：ATGGAGAGACTGAGGTCAGACA； 4R：GAGTGATAAGGAGTGGCATGAA； 5-6F：AAGTGCTGAGGGCTGTGGAG； 5-6R：ATGTAGCACAGTGACTGGTCCAG； 7F：GAGGGGGAATGACTTGCCAG； 7R：CCCTCAATCACGGAAACACA； 8-9F：TCTGGAGCCTCCAGTTTTGA； 8- 9R：CTGCCAGTGCTTCCTCACAG； 10F：AAGAACCGAGGGTAGAGGTGTG； 1OR：TGCTCCTAGCTCTCCACGAC； GCK：1AF：CCGACTCGTTGGAGAACAAT； 1AR：TCCAAAGCTGGATGGGTCTG； 1BF：GGGCAGAGTATTTGAGCAGC； 1BR：CATGTGCCTCCTTCCAAGGT； 1CF：TCCCACTGCTATCCAACCTG； ICR：GGCTGTCCTAACAATCCCTGTG； 2F：GGGGTCAGAAGACAGAAGGA； 2R：GCCCAAGTCGAGGACTTCAT； 3F：TTCCCTGGTTGACCTTTGAC； 3R：GATGGTGACTGTGGGACTTG； 4F：AGCAGCAGCGGAAGAGGAGA； 4R：TCCAGATCTCCCTTCTGAGCAC； 5-6F：AGAATCGTTCCCAAAACCTCTC； 5-6R：GGCGTTGAAATGCTTCCTACTG； 7F：CCACTGAAGCAACCCAGGTC； 7R：TGGAGCTTACGAACGGATTG； 8F：GCACGTTCCTAATCCCTGAC； 8R：GGCCCTAGTTTCCCATCC； 9- 10F：CTGGCGGAAACGCTTTGG； 9-10R GCTGTCCCACCGAAAAACTG； KCNJ11：1-1F：AGTGAAGTGGGACCCAGGTG； 1-1R：CTTGCGTACCACCTGCATGT； 1-2F：CATCGTGCAGAACATCGTG； 1-2F：TAACACCCTGGATGAGCAG 〇2. 根據權利要求1所述的一種MODY型糖尿病基因檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒 還包括DNA提取試劑、Taq DNA聚合酶、PCR緩沖液和dNTP混合物。3. 根據權利要求1所述的一種M0DY型糖尿病基因檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒 的PCR反應條件為:94°C預變性5min;94°C變性lmin，退火lmin，72°C延伸lmin，最后72°C延 伸5min，30個循環;恢復至4°C。4. 一種如權利要求1所述的M0DY型糖尿病基因檢測試劑盒檢測得到的突變位點，其特 征在于:所述突變位點為 c · 160C>T、c · 932C>A、c · 8C>T、c · 51C>G或 c · 823G>A。
【文檔編號】C12Q1/68GK106011268SQ201610527671
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】寧光, 顧衛瓊, 繆海韜, 葉蕾, 崔斌, 顧斌, 洪潔, 張翼飛
【申請人】上海市內分泌代謝病研究所, 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院