一種檢測人類C-Kit基因17號外顯子突變的診斷試劑盒和方法
【專利摘要】本發明提供了一種檢測人類c?kit基因突變類型的試劑盒，它包括SEQ ID NO.1～4所示的引物對和SEQ ID NO.5所示的探針。本發明還公開了一種檢測人類c?kit基因17號外顯子突變的方法。本發明試劑盒和方法可以準確檢測人類c?kit基因17號外顯子的D816V、D820H、N822I和N822K突變，為GIST患者的用藥提供指導，臨床應用前景良好。
【專利說明】
-種檢測人類C-K i t基因17號外顯子突變的診斷試劑盒和 方法
技術領域
[0001] 本發明屬于基因檢測領域，具體設及一種檢測人類C-Kit基因17號外顯子突變的 診斷試劑盒和方法。
【背景技術】
[0002] 胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumors, GIST)是一類起源于胃腸道間 葉組織的腫瘤，是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，多發于中老年患者，男女發病率無明顯差 異。Mazur等在1983年提出，GIST是一類區別于平滑肌瘤和神經源性腫瘤的獨立腫瘤類型， 其直接病因是癌基因獲得性功能突變。
[0003] 早期治療GIST主要依賴手術切除，但是即使腫瘤完全切除，也有很多患者死于腫 瘤的復發和轉移，而傳統的放療和化療也沒有明顯的療效。祀向藥物特別是酪氨酸激酶抑 制劑伊馬替尼的出現使得GIST治療發生了根本性的改變，現在對于GIST的治療已發展為針 對不同病情，采取包括手術、輔助治療和新輔助治療的個性化綜合治療。目前臨床上治療 GIST的一線祀向藥物是格列衛（伊馬替尼，諾華制藥），二線藥物索坦(舒尼替尼，輝瑞制 藥），每個患者年消費均為十余萬人民幣。
[0004] 但祀向藥物的療效與有GIST患者有無基因突變及突變位點密切相關，不同的基因 突變類型患者，輔助治療的獲益存在差異，因此祀向治療之前需進行基因檢測，W預測祀向 治療的療效并指導祀向藥物種類和劑量的選用。其規范的用藥方案已經進入《中國胃腸間 質瘤診斷治療共識》(2013年版）。
[0005] GIST患者根據其基因突變類型，可從分子水平分為3類:C-Kit突變型（80~85%)， PDGFRa突變型（5~10%)和野生型GIST(10%)。其中，C-Kit基因位于人染色體4ql2-13,全 長5230bp，含21個外顯子。C-Kit基因的突變形式多樣，包括缺失突變、點突變和插入突變， 突變位點主要發生在第9號（10%)、11號(70%)、13號（1%)、17號外顯子(1%)。
[0006] 研究表明，C-Kit基因突變不僅可協助明確診斷GIST,而且其突變位點與GIST祀向 藥物的治療反應、用藥劑量和預后有關。其中，從伊馬替尼治療反應上看，C-Kit基因有突變 的GIST病例比C-Kit野生型病例治療反應效果好，患者腫瘤無明顯進展的生存期長;C-Kit 有突變的GIST病例中，伊馬替尼的療效由高到低依次為：11號外顯子突變者、9號外顯子突 變者、13號外顯子突變者、17號外顯子突變者;另外，在伊馬替尼起始用藥劑量選擇上，也會 因突變位點不同而異。從酪氨酸激酶抑制劑舒尼替尼治療反應上看，舒尼替尼二線治療原 發C-Kit 9號外顯子突變和野生型GIST病例的療效優于11號外顯子突變患者；治療繼發性 C-Kit的13號外顯子突變患者的療效優于繼發17號突變外顯子。因此，檢測C-Kit基因的突 變位點，對于指導GIST患者的合理用藥，W進行GIST個體化診療，具有重要參考價值。
[0007] 但是，目前檢測人類C-Kit基因 17號外顯子突變，主要是通過傳統的測序方式，測 序的耗費時間長且成本高，不利用普通的臨床檢測。即使有少數使用巧光定量PCR法的報 道，也是僅對17號外顯子的其中某一個位點進行檢測，檢測位點單一，無法對17號外顯子進 行多個突變位點的評估，不能滿足實際應用的需要。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供一種新的定量PCR檢測人類C-Kit基因突變的試劑盒和方 法。
[0009] C-Kit基因17號外顯子突變的信息如下：
[0010]
[0011]本發明提供了一種檢測人類c-kit基因突變類型的試劑盒，它包括SEQ ID N0.1~ 4所示的引物對和SEQ ID NO.5所示的探針。
[0012] 其中，它還包括質控引物與質控探針:沈Q ID NO.6~8所示引物對與SEQ ID NO.9 所示的探針。
[0013] 本發明還提供了所述試劑盒在制備檢測人類c-kit基因17號外顯子突變的試劑中 的用途。
[0014] 其中，所述17號外顯子突變為D816V、D820H、N822I或N822K突變。
[0015] 本發明還提供了沈Q ID NO. 1~4所示引物對。
[0016] 本發明還提供了SEQ ID NO.5所示的探針。
[0017] 本發明還提供了一種檢測人類c-kit基因 17號外顯子突變的方法，它包括如下步 驟：
[001引（1)提取樣本DNA:取待檢組織，提取其中的DNA;
[0019] (2)基因擴增:用上述試劑盒對待檢樣本中的DNA進行擴增；
[0020] (3)結果檢測:對DNA擴增結果進行檢測。
[0021] 其中，所述17號外顯子突變為D816V、D820H、N822I或N822K突變。
[0022] 本發明設計的特定引物，可W用于檢出C-Kit基因17號外顯子的D816V、D820H、 N822I和N822K突變。只要本發明檢測試劑盒和方法測出有突變，就可W確認C-Kit基因的17 號外顯子存在D816V、D820H、N822I和N82a(四種突變類型的至少一種突變。從而可W預測 GIST患者對祀向藥物的治療反應。
[0023] 本發明提供的試劑盒可W同時準確檢測待檢人群是否出現C-Kit基因的17號外顯 子上的4個突變位點，更能準確判斷待檢GIST患者的藥物反應，為GIST患者的用藥提供指 導，且靈敏度高，特異性好，而且檢測快速、簡便，成本低廉，可W大量推廣使用，臨床應用前 景良好。
[0024] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可W做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0025] W下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于w下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0026] 圖1為突變型樣本測序結果圖
[0027] 圖2為特異性檢測結果圖
[002引圖3為靈敏度檢測結果圖：編號1-5分別為濃度為8ng/ul、4ng/ul、化g/ul、Ing/ul、 0.5ng/ul的DM擴增結果。
【具體實施方式】
[0029] 下面W實施例作進一步說明，但本發明不局限于運些實施例。
[0030] 本發明所用的實驗試劑與儀器如下：
[0031] FastS^dTaq DNA Polymerase:購自Roche公司，Cat No. 12 032 937 001;
[0032] Uracil DNA Glycosylase(UNG),heat labile 200U 2u/l:購自大連Takara公司， No.2820;
[003；3] dU plus dNTP Mixture(12.5X)(dATP 2.5mM，dGTP 2.5mM，dCTP 2.5mM，dUTP 7.5mM，）：購自大連Takara公司，Cat No. 4035。
[0034] 實施例1本發明檢巧UC-Kit基因17號外顯子突變的試劑盒和檢巧巧法
[0035] -、本發明試劑盒的組成
[0036] PCR擴增試劑（1人份）：
[0037]
[003引其中'中rimer溶液"配制如下： [0039]
[0040] c-kit基因17號外顯子突變的擴增引物W及檢測探針:
[0041]
[0042]外控引物及探針：
[0045] 二、采用本發明試劑盒檢測C-Kit基因 17號外顯子突變
[0046] 1、樣本DNA提取:可W使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取試劑盒 提取。
[0047] W石蠟組織樣本，用Qiagen公司試劑盒為例，提取DNA。
[0048] 1)利用手術刀取出組織邊界無用的石蠟；
[0049] 2)將石蠟包埋組織切成4WI1厚的薄片；
[(K)加]3)迅速用滅菌小綴子取2-6枚裝入面ase/RNase Free EP管中（每張攤開面積500 (最大)mm2,即邊長1.6cm的正方形大小；
[0051 ] 4)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉數離屯、3分鐘；
[0052] 5)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉數離屯、3分鐘；
[0053] 6)棄二甲苯，加入80化1無水乙醇，最大轉數離屯、3分鐘；
[0054] 7)棄無水乙醇，揮干樣品；
[0055] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C -小時W上，直至清亮；
[0化6] 9)90°C -小時；
[0化7] 10)離屯、6000g Imin，取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[0化引 11)加入20化1 混勻，加入20化1乙醇，再混勻；
[0059] 12)簡單離屯、清潔管壁；
[0060] 13)將全部混合液加入到DNA分離柱，關蓋，離屯、6000g Imin，換新的收集管；
[0061 ] 14)加入500μ1 AWl，6000g 離屯、Imin;換收集管；
[0062] 15)加入500μ1 AW2,6000g 離屯、Imin，換收集管；
[0063] 16)全速離屯、3min，干燥柱子；
[0064] 17)換一只干凈的1.5ml收集管，準備收集DNA;加入20-3化1 ATE，在室溫保持Imin W溶解DM。全速離屯、Imin收集DM。
[0(?日]2、定量PCR擴增
[0066] c-kit基因突變的擴增引物W及檢測探針：
[0067] C17引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR體系中加入 lul即可。
[006引
[0069]
[0070] c-kit外控引物溶液(Primer溶液)配制如下，配制出引物溶液后，在定量PCR體系 中加入lul即可。[0071]
[0072] 1)定量PCR體系配制:[0073]
[0074] 按照如下表格加樣入2個PCR管：[0075]
[0076] 2)BI0-RAD CFX96機器PCR熱循環程序設置：
[0077]
[007引3、結果判讀：
[0079] W外控信號為標準，其信號Ct值在15-25,表明上樣DNA的量在允許范圍W內。所有 實驗樣本的外控曲線均應該升起，否則重新提取DNA檢測。讀取待檢孔(孔號l)Ct值，Ct值為 〇(或者無擴增曲線)或者大于29判讀陰性，判定為無 C17突變;Ct值小于28判讀該信號孔陽 性。28~29重復實驗，若仍然在28~29判讀C17弱陽性突變。
[0080] 其中，陽性、弱陽性:代表樣品有突變，突變類型為D816V、D820H、N822I或N822K。
[0081] W下用實驗例的方式說明本發明的有益效果：
[0082] 實驗例1本發明試劑盒W及方法的準確度和特異性檢測
[0083] 1、待檢樣本
[0084] 選取已知突變類型為c-kit基因17號外顯子突變（分別為D816V、D820H、N822I、 N82a(突變）的臨床GIST石蠟組織樣本各1例（其中，D816V突變的測序結果見圖1)和已知野 生型臨床GIST石蠟組織樣本1例，檢測人類c-kit基因突變類型。
[00化]2、檢測方法
[0086]本發明方法:采用實施例1的試劑盒，按照實施例1的方法進行檢測。
[0087] 樣本DNA提取方法:用Qiagen公司試劑盒提取：
[008引1)利用手術刀取出組織邊界無用的石蠟；
[0089] 2)將石蠟包埋組織切成4WI1厚的薄片；
[0090] 3)迅速用滅菌小綴子取2-6枚裝入面ase/RNase Free EP管中（每張攤開面積500 (最大)mm2,即邊長1.6cm的正方形大小；
[0091] 4)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉數離屯、3分鐘；
[0092] 5)加入80化1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉數離屯、3分鐘；
[0093] 6)棄二甲苯，加入80化1無水乙醇，最大轉數離屯、3分鐘；
[0094] 7)棄無水乙醇，揮干樣品；
[0095] 8)加入 180μ1 ALT buffer及20μ1 proteinase K，56°C-小時W上，直至清亮；
[0096] 9)90°C -小時；
[0097] 10)離屯、6000g Imin，取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[009引 11)加入20化1 混勻，加入20化1乙醇，再混勻；
[0099] 12)簡單離屯、清潔管壁；
[0100] 13)將全部混合液加入到DNA分離柱，關蓋，離屯、6000g Imin，換新的收集管；
[0101] 14)加入500μ1 AWl，6000g 離屯、Imin;換收集管；
[0102] 15)加入500μ1 AW2,6000g 離屯、Imin，換收集管；
[0103] 16)全速離屯、3min，干燥柱子；
[0104] 17)換一只干凈的1.5ml收集管，準備收集DNA;加入20-3化1 ATE，在室溫保持Imin W溶解DM。全速離屯、Imin收集DM。
[01化]3、實驗結果
[0106] 如果突變型樣本信號Ct值在28W內，則表示樣本出現了c-kit基因17號外顯子檢 測突變類型(D816V、D820H、N822I和Ν823(突變）中至少一種突變。
[0107] 本發明的4例突變型樣本信號Ct值均在28W內，其中D816V突變型樣本的測序結果 如圖2所示。圖2中，曲線1是突變型樣本信號；曲線2是外控信號，曲線3是陰性對照(野生型 對照）信號，樣本信號Ct值在28W內，表示該樣本出現了c-kit基因17號外顯子的D816V突 變。
[0108] 實驗結果說明，本發明方法和試劑盒的檢測結果與已知檢測結果比較:結果一致， 說明本發明方法和試劑盒可W準確c-kit基因17號外顯子突變，準確性強；另外，陰性對照 樣本Ct值大于30,為陰性，說明了本發明方法和試劑盒的特異性好。
[0109] 實驗例2本發明試劑盒W及方法的靈敏度分析
[0110] 1、試驗方法
[0111] 取含有人類c-kit基因17號外顯子突變的DNA，定量至濃度為8ng/ul，進行等比稀 釋，稀釋后的濃度分別為8ng/u 1、4ng/u 1、化g/u 1、1 ng/u 1、0.5ng/u 1。
[0112] 用實施例1的試劑盒，按照實施例1的定量PCR擴增進行檢測。
[0113] 2、實驗結果
[0114] 如圖3所示，本發明試劑盒可W檢測到濃度為Ing/ul的低濃度樣本，靈敏度高。
[0115] 綜上，本發明提供的試劑盒可W準確檢測人類C-Kit基因17號外顯子突變，檢測快 速、簡便，成本低廉，可W大量推廣使用，臨床應用前景良好。
【主權項】
1. 一種檢測人類c-kit基因突變類型的試劑盒，其特征在于:它包括SEQ ID N0.1~4所 示的引物對和SEQ ID NO.5所示的探針。2. 根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于：它還包括質控引物與質控探針：SEQ ID NO.6~8所示引物對與SEQ ID NO.9所示的探針。3. 權利要求1或2所述的試劑盒在制備檢測人類c-kit基因17號外顯子突變的試劑中的 用途。4. 根據權利要求3所述的用途，其特征在于：所述17號外顯子突變為D816V、D820H、 N822I 或 N822K 突變。 5.SEQ ID NO. 1~4所示引物對。 6.SEQ ID NO.5所示的探針。7. -種檢測人類c-kit基因17號外顯子突變的方法，其特征在于:它包括如下步驟： (1) 提取樣本DNA:取待檢組織，提取其中的DNA; (2) 基因擴增:用權利要求1或2所述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進行擴增； (3) 結果檢測:對DNA擴增結果進行檢測。8. 根據權利要求7所述的方法，其特征在于：所述17號外顯子突變為D816V、D820H、 N822I 或 N822K 突變。
【文檔編號】C12N15/11GK106011254SQ201610440458
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月17日
【發明人】葉豐, 肖林, 陳卉嬌
【申請人】四川大學華西醫院