用于檢測微量組織中pdgfra基因突變的引物組合及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種用于檢測微量組織中PDGFRA基因突變的引物組合，其包括預擴增引物組、用于檢測12號外顯子突變的引物組、用于檢測14號外顯子突變的引物組、用于檢測18號外顯子突變的引物組；該方法旨在將微量的DNA通過預擴增得到較高濃度的DNA模板，結合直接測序法檢測樣本中PDGFRA基因的突變情況；將該引物組合應用于制備檢測PDGFRA基因突變的檢測試劑中，可檢測樣本的DNA濃度低至100pg，且可以同時檢測PDGFRA基因第12、14和18號外顯子的所有突變，本發明提供的檢測方法靈敏度高，特異性強，成本低，適用于臨床腫瘤患者PDGFRA基因突變的檢測，具有很好的臨床應用價值。
【專利說明】
用于檢測微量組織中PDGFRA基因突變的引物組合及其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物檢測技術領域，具體設及一種用于微量組織中戶餅并基因突變檢 測的引物組合及其在腫瘤用藥選擇和疾病診斷相關方面的應用。
【背景技術】
[0002] PDGFR是分子量為180kD的單鏈膜糖蛋白，細胞外配體結合區含5個免疫球蛋白樣 結構域，具保守的半脫氨酸殘基，單一跨膜片段;胞內的酪氨酸激酶區斷裂處，為親水氨基 酸插入序列。受體分子由α，0兩種亞基組成，成熟后的PDGFRW二聚體穩態形式(αα,αβ,ββ) 與配體PDGF (platelet-derived growth factor,PDGF)相應異構體（PDGF-AA，AB，BB)結 合。結直腸癌組織中PDGFR α和PDGFR β均有表達分布，PDGFR α分布于結直腸正常組織、息 肉組織及腫瘤組織上;PDGFR β表達于腫瘤細胞、腫瘤間質細胞和微血管細胞(包括微血管 周細胞）上(Appi址-Kubi Κ, et 曰1 , 2016; Abdel-Rahman 0, 2015)。
[0003] 戶餅并基因突變常見于GIST、膠質母細胞瘤、惡性外周神經銷等腫瘤，其中GIST中 戶餅并亂基因突變率在5~10%左右，突變主要發生于戶餅并亂基因的近膜端區域(外顯子12)和 激酶區（外顯子14和外顯子18)，突變頻率分別為0.8%和3.9%，其中W外顯子18突變為主 (Vega F, et al, 2〇15)。戶0份淵基因突變后則通過活化AKT、MAPK及STAT蛋白中STAT1和 STAT3發揮作用。也有研究發現活化的A-Raf激酶能調節化CG1經PDCFR依賴途徑的信號轉 導，也能調節PI3K經PDGFR非依賴的信號轉導(化rooqi AA，et al, 2015)。
[0004] 伊馬替尼是一種酪氨酸蛋白酶抑制劑，能阻斷酪氨酸蛋白激酶KIT受體功能，從而 抑制腫瘤的形成。研究表明，基因外顯子12和外顯子18大部分基因位點突變后使用 伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑制劑治療時GIST患者可從中獲益。但如外顯子18基因 位點發生D842V、RD841-842KI或D1842-843IM突變使用伊馬替尼、舒尼替尼等酪氨酸激酶抑 制劑治療時GIST患者不能從中獲益。因此，腫瘤病人在用藥之前進行巧?份化^基因的突變檢 測，將有利于運些患者選擇最好的治療方式。
[0005] 目前針對巧?佛突變的檢測方法有很多，如直接測序法，該法對樣本要求較高，檢 測范圍有限。多態性分析法(R化P)，是將PCR與限制性酶切相結合的一種方法，此實驗操作 繁瑣，檢測周期長，成本高昂，存在第一輪酶切不完全導致的假陽性。Taqman水解探針法，使 用擴增阻滯突變系統(ARMS)與巧光探針結合來檢測突變，針對該方法設計的引物，使得突 變型得到擴增，野生型無法擴增，從而增強了突變信號，便于檢測。但是ARMS技術應用最后 一個堿基不匹配并不能完全阻滯野生型DNA的擴增，存在假陽性的風險，且只能針對特異性 位點檢測。此外，如高效液相色譜、毛細血管電泳等，需要特殊的儀器設備，且操作復雜，不 利于在臨床上進行大范圍的推廣。核酸序列擴增法(NASBA)、自序序列復制法(3SR)和鏈置 換復制法(SDA)雖均為等溫擴增法，但是它們對目的序列的擴增特異性不強。
[0006] 盡管如此，巧?份化^突變的檢測方法仍W腫瘤組織標本檢測為金標準，但是臨床上 常常由于組織樣本獲取不足量，使其檢測具有一定的局限性。因此臨床上亟需一種高效準 確全面地檢測微量組織中巧Κ/況^基因突變的產品及方法，W便于為腫瘤個性化治療服務。
[0007] 為此，本發明利用恒溫擴增與直接測序相結合的方法，建立了一套針對微量組織 樣本中基因所有突變類型檢測的技術流程，該檢測方法靈敏度高，特異性強，成本 低，有利于臨床使用和推廣。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的在于提供一種具有高特異性和靈敏度的檢測微量組織樣本中 您佛基因突變的引物組合，W組織DNA為檢測對象，結合恒溫預擴增技術和普通PCR技術， 通過直接測序法確定腫瘤樣本中有無巧基因突變，可對巧?佛基因的突變進行準確的 檢測。
[0009] 本發明提供的引物組合能檢測出巧粉況^基因發生在第12、14和18號外顯子的所有 突變。
[0010] 本發明提供的用于檢測巧粉況^基因突變的引物組合包括如沈Q ID NO: 1-沈Q ID NO: 18所示的預擴增引物組、如沈Q ID NO: 19-沈Q ID NO:20所示的用于檢測12號外顯子 突變的引物組、如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示的用于檢測14號外顯子突變的引物 組，如沈Q ID N0:23-沈Q ID N0:24所示的用于檢測18號外顯子突變的引物組。
[0011] 本發明的另一目的是將上述引物組合應用在制備檢測戶餅并基因突變的檢測試 劑中。
[0012] 本發明的另一目的是將上述引物組合應用于制備用于檢測巧?餅基因突變的檢 測試劑盒中，所述試劑盒組分還包含下列常規組分中的一種或幾種:聚合酶、引物組合、PCR 反應緩沖液、dNTP、BSA、去離子水。
[0013] 本發明用于檢測/??巧基因突變的引物組合的檢測使用方法，具體步驟如下： (1)引物稀釋 將primerl-primelS分別稀釋后混勻制得Primer Mix(表1)，其中primerl-primerlG引 物的終濃度為0.05-0. ΙμΜ，primerU-primer 18引物的終濃度為 1-3μΜ;primer 19-p;rimer24 引物(表1)稀釋至5-10μΜ。
[0014] (2)預擴增 在擴增管中加入化L的10X反應緩沖液、2.5化的Primer Mix、lOO-lOOOpg微量DNA模板 (本發明采用的DNA模板來源于結腸癌病人組織，并按照《分子克隆實驗指南》中所述常規方 法提取組織DNA)、用去離子水補足至8.如レ混勻，98°C預變性5-lOmin，然后置于冰上10- 20min;再加入 0.化 L dNTP (lOmM each)、0.化 L 100XBSAW 及 0.扣 L pM29 DNA 聚合酶， 30-35°C擴增過夜，65°C加熱10-20min使酶失活。
[0015] (3)使用PCR純化試劑盒純化上述預擴增產物。
[0016] (4)巧?佛基因突變檢測 針對戶餅并基因的12號、14號和18號外顯子突變，分別采用如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示的引物組檢測12號外顯子突變;如SEQ ID N0:21- SEQ ID N0:22所示的引物組 檢測14號外顯子突變，如SEQ ID NO:23- SEQ ID NO:24所示的引物組檢測18號外顯子突 變。
[0017] 配置PCR反應總體系為25化:其中Pfu Mix混合液12.5化、所述正向引物（5-10叫1) 的體積〇.5-lyL、反向引物（5-10μΜ)的體積0.5-化L、預擴增產物1-化L、用水補足至25化。 PCR反應條件為:①94°C，5min預變性;②94°C，30s變性;③55°C，30s退火;④72°C，35s延伸； 循環②至④35次;⑤72 °C，5min;測序檢測。
[001引本發明的檢測優勢在于：霞本發明采用多引物組合、利用恒溫擴增及普通PCR相 結合的方法，解決了組織樣本中初始DNA含量低的，無法進行戶餅并基因突變檢測的局限 性。感本發明中使用的試劑價格低廉，可大批量的處理樣本。潑本發明方法擴增效率高，如 lOOpg的DNA經擴增后可得到1000ng/μレ可同時檢測多位點的突變情況。逆本發明方法DNA 擴增后DNA忠實性好。總之，使用本發明方法可實現對微量組織樣本中的戶餅并基因的突變 情況進行高效、準確的檢測，其對于臨床腫瘤早期篩查，指導臨床用藥，W及監測腫瘤的預 后具有很好的實際應用價值。
[0019] 表1:引物1-24的核巧酸序列
【附圖說明】
[0020] 圖1是本發明針對lOOOpg的DNA模板擴增結果;其中A圖為預擴增結果(3次重復）;B 圖為/??并基因12、14和18號外顯子擴增結果。
[0021] 圖2是本發明針對5(K)pg的DNA模板擴增結果;其中A圖為預擴增結果(3次重復）;B 圖為/??并基因12、14和18號外顯子擴增結果。
[0022] 圖3是本發明針對l(K)pg的DNA模板擴增結果。A圖為預擴增結果(3次重復）;B圖為 /??并基因12、14和18號外顯子擴增結果。
[0023] 圖4是本發明針對lOOOpg的DNA模板中WGFW基因12、14和18號外顯子測序結果 圖。
[0024] 圖5是本發明針對50化邑的0臟模板中巧?佛7^基因12、14和18號外顯子測序結果圖。
[0025] 圖6是本發明針對10化g的DNA模板中巧?佛基因12、14和18號外顯子測序結果圖。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。W下實施例僅用于說明本 發明而不用于限制本發明的范圍，該領域的技術人員可W根據上述本
【發明內容】
對本發明做 出一些非本質的改進和調整。下述實施例中，若非特異表明，所用試劑均為分析純，所有試 劑均可從商業渠道獲得，百分比均為質量百分比。文中未注明具體條件的實驗方法，通常按 照《分子克隆實驗指南》中所述常規條件，或試劑制造廠商所建議的條件實施。除非另行定 義，文中所使用的所有專業和科學用語與本領域熟練人員所熟悉的意義相同。
[0027] 實施例1: lOOOpg的DNA模板中巧?佛基因突變檢測 1、實驗材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去離子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer24，PCR 儀，超薄產物純化試劑盒(天根生化科技(北京巧限公司DP203)，1%的瓊脂糖凝膠，電泳儀。 [002引 2、實驗步驟及結果 2.1預擴增 (1)引物稀釋 將primerl-primelS分別稀釋后混勻形成Primer Mix(表1)，其中primerl-primerlG引 物的終濃麼為0.1 μΜ，Dr imer 17-Dr imer 18引物的終濃麼為2μΜ。配晉化下體系：
(2) 將上述試劑混勻后，98°C預變性lOmin，然后迅速置于冰上20min;(3) 再加入如下體系：
將上述混合物混勻后，30-35°C擴增過夜，65°C加熱10-20min使酶失活。鋪1%的膠檢測 (圖ΙΑ)。結果顯示使用地i29DNA聚合酶對lOOOpg的DM模板擴增效果良好。
[0029] 2.2 PCR產物純化 (1)柱平衡步驟：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12，000巧m (~13，400 X g) 離屯、1 min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中； (2 )估計PCR反應液的體積，向其中加入5倍體積的結合液PB，充分混勻(無需去除石蠟 油或礦物油）； (3) 將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min, 12,000巧m(~13,400Xg)離屯、30-60S，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收集管中； (4) 向吸附柱CB1中加入6(Κ)化漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇），12, 000巧m (~13,400Xg)離屯、30-60S，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收集管中； (5) 重復操作步驟(4); (6) 12，000巧m(~13，400 X g)離屯、2 min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數 分鐘，徹底地驚干，W防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗； (7) 取出吸附柱CB1，放入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-5化L洗 脫緩沖液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)離屯、2 min，收集DNA溶液。
[0030] 2.3巧?佛基因突變檢測 (1)配置如下PCR反應體系，分別擴增W佛7?基因的第12、14和18號外顯子；
其中針對12號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;針對14號外顯 子突變的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示；18號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 23-沈Q ID NO :24所示。
[0031] (2)反應條件：①94Γ，5min預變性;②94Γ，30s變性;③55Γ，30s退火;④72Γ， 35s延伸；循環②至④35次;⑤72 °C，5min; (3)PCR反應結束后，鋪1%的膠檢測（圖IB)，結果顯示第二輪PCR對巧?佛亂基因的第12、 14和18號外顯子均出現特異性擴增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序 檢測。測序結果如圖4所示，巧Κ/況^基因第12，14和18外顯子均未檢測到突變。
[0032] 實施例2:50化g的DNA模板中巧?佛基因突變檢測 1、實驗材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去離子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer24，PCR 儀，超薄產物純化試劑盒(天根生化科技(北京巧限公司DP203)，1%的瓊脂糖凝膠，電泳儀。
[0033] 2、實驗步驟 2.1預擴增 (ο引物稀釋。將primerl-primeis分別稀釋后混勻形成Primer Mix(表1 )，其中 primerl-primerie引物的終濃度為0.化1，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的終濃度為241。配置如 下體系：
(2)將上述試劑混勻后，98°C預變性lOmin，然后迅速置于冰上20min。 [0034] (3)再加入如下體系：
將上述混合物混勻后，30-35°C擴增過夜，65°C加熱10-20min使酶失活。鋪1%的膠檢測 (圖2A)。結果顯示使用地i29DNA聚合酶對5(K)pg的DNA模板擴增效果良好。
[0035] 2.2 PCR產物純化 (1)柱平衡步驟：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12,000巧m (~13,400Xg) 離屯、1 min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0036] (2 )估計PCR反應液的體積，向其中加入5倍體積的結合液PB，充分混勻(無需去除 石蠟油或礦物油）。
[0037] (3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400Xg)離屯、30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CBl放入收 集管中。
[003引（4)向吸附柱CB1中加入600化漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇）， 12,000巧m (~13,400Xg)離屯、30-60 sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入收集管 中。
[0039] 巧)重復操作步驟4。
[0040] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)離屯、2 min,盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放 置數分鐘，徹底地驚干，W防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。
[0041 ] (7)取出吸附柱CB1，放入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜中間位置懸空滴加 20-50 化洗脫緩沖液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)離屯、2 min，收集DNA溶液。
[0042] 2.3 /??巧基因突變檢測 (1)配置如下PCR反應體系，分別擴增W佛7?基因的第12、14和18號外顯子。
[0043] 其中針對12號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;針對14號外顯 子突變的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示；18號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 23-沈Q ID NO :24所示。
[0044] (2)反應條件：①94°C，5min預變性;②94°C，30s變性;③55°C，30s退火;④72°C， 35s延伸；循環②至④35次;⑤72 °C，5min; (3 )PCR反應結束后，鋪1%的膠檢測（圖2B)，結果顯示第二輪PCR對巧?佛亂基因的第12、 14和18號外顯子均出現特異性擴增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序 檢測。測序結果如圖5所示，巧Κ/況^基因第12，14和18外顯子均未檢測到突變。
[0045] 實施例3: lOOpg的DNA模板中巧?佛基因突變檢測 1、實驗材料 pM29 DNA聚合酶aOXreaction buffer，dNTP (lOnM)，100XBSA，1000pg的 DNA模 板，去離子水，primerl-primelS (即Primer Mix)，2XP化 Mix，p;rime;rl9-p;rimer24，PCR 儀，超薄產物純化試劑盒(天根生化科技(北京巧限公司DP203)，1%的瓊脂糖凝膠，電泳儀。
[0046] 2、實驗步驟 2.1預擴增 (1)引物稀釋。將primerl-primelS分別稀釋后混勻形成Primer Mix(表1)，其中 口1'；[11161'1-口1'；[11161'16引物的終濃度為0.化1，口1'；[11161'17-口1'；[11161'18引物的終濃度為241。
[0047] 配置如下體系：
(2)將上述試劑混勻后，98°C預變性lOmin，然后迅速置于冰上20mii [004引（3)再加入如下體系：
將上述混合物混勻后，30-35°C擴增過夜，65°C加熱10-20min使酶失活。鋪1%的膠檢測 (圖3A)。結果顯示使用地i29DNA聚合酶對l(K)pg的DNA模板擴增效果良好。
[0049] 2.2 PCR產物純化 (1)柱平衡步驟：向吸附柱CB1中加入500化的平衡液化，12,000巧m (~13,400Xg) 離屯、1 min,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中。
[0050] (2 )估計PCR反應液的體積，向其中加入5倍體積的結合液PB，充分混勻(無需去除 石蠟油或礦物油）。
[0051] (3)將上一步所得溶液加入一個吸附柱CB1中（吸附柱放入收集管中），室溫放置2 min，12,000 rpm(~13,400Xg)離屯、30-60 sec，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CBl放入收 集管中。
[0化2] (4)向吸附柱CB1中加入600 yL漂洗液PW(使用前請先檢查是否已加入無水乙 醇），12,000巧m (~13,400Xg)離屯、30-60 sec,倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB1放入 收集管中。
[0化3] 巧)重復操作步驟4。
[0054] (6)12,000 rpm(~13,400Xg)離屯、2 min,盡量除去漂洗液。將吸附柱置于室溫放 置數分鐘，徹底地驚干，W防止殘留的漂洗液影響下一步的實驗。
[0055] (7)取出吸附柱CB1，放入一個干凈的離屯、管中，向吸附膜中間位置懸空滴加20-50 μL洗脫緩沖液邸，室溫放置2 min。12，000巧m(~13，400Xg)離屯、2 min，收集DNA溶液。 [0化6] 2.3巧?佛基因突變檢測 (1)配置如下PCR反應體系，分別擴增您佛7?基因的第12、14和18號外顯子。
[0化7]
其中針對12號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 19- SEQ ID N0:20所示;針對14號外顯 子突變的引物如SEQ ID NO:21- SEQ ID NO: 22所示；18號外顯子突變的引物如SEQ ID NO: 23-沈Q ID NO :24所示。
[005引（2)反應條件：①94Γ，5min預變性;②94Γ，30s變性;③55Γ，30s退火;④72Γ， 35s延伸；循環②至④35次;⑤72 °C，5min; (3 )PCR反應結束后，鋪1%的膠檢測（圖3B)，結果顯示第二輪PCR對巧?佛亂基因的第12、 14和18號外顯子均出現特異性擴增;然后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序 檢測;測序結果如圖6所示，巧Κ/況^基因第12，14和18外顯子均未檢測到突變。
[0059] W上所述僅為本發明的優選實施例而已，并不用于限制本發明，對于本領域的技 術人員來說，本發明可W有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修 改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 用于檢測微量組織中基因突變的引物組合，其特征在于，包括如SEQ ID NO: 1- SEQ ID NO: 18所示的預擴增引物組、如SEQ ID NO: 19- SEQ ID NO: 20所示的用于檢測 12號外顯子突變的引物組、如SEQ ID NO: 21- SEQ ID NO: 22所示的用于檢測14號外顯子突 變的引物組，如SEQ ID N0:23- SEQ ID N0:24所示的用于檢測18號外顯子突變的引物組。2. 權利要求1所述的引物組合在制備檢測基因突變的檢測試劑中的應用。3. 權利要求1所述的引物組合在制備檢測基因突變的檢測試劑盒中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK106011253SQ201610417813
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月15日
【發明人】唐文如, 李珊珊, 羅瑛, 盛苗苗, 王芳, 趙月光, 張繼虹, 賈舒婷, 吳曉明, 劉靜, 周若宇, 旦菊花
【申請人】昆明理工大學