一種生物轉化降解黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法
【專利摘要】本發明公開了一種生物轉化降解黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法，其特征在于：以黃芪甲苷為底物，通過菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發酵，制得環黃芪醇。本發明以微生物發酵技術降解黃芪甲苷得到高純度的環黃芪醇，工藝簡單易行、成本低，最終環黃芪醇的轉化率達到60％以上、純度高達95％以上，轉化專一性較高；整個工藝過程在常溫、常壓下進行，所要求的設備條件低，適用于大批量生產。
【專利說明】
一種生物轉化降解黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法
技術領域
[0001]本發明公開了一種生物轉化降解黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法，屬于醫藥化工領域。
【背景技術】
[0002]黃芪為豆科植物蒙古黃芪或膜莢黃芪的干燥根。它始載于《神農本草經》，至今已有400多年的藥用歷史，目前仍為中醫臨床治療最常用的藥物之一。皂苷類化合物是黃芪屬植物中最重要的一種活性成分，其中所含有的皂苷類化合物從結構上主要為環阿屯烷型的四環三萜類皂苷。環黃芪醇是黃芪皂苷的苷元部分，分子式為C3qH5qO5、相對分子量為490.71ο其在植株中含量極少，約占干重的0.1 %，是黃芪甲苷在腸道內代謝的主要產物，雖然含量很低但是具有很好的生物學活性:促進神經細胞增值，促進傷口愈合，抗衰老等。尤其是環黃芪醇作為已知的唯一天然端粒酶激活劑在抗衰老，增強機體免疫力等方面具有不可替代的作用，具有廣闊的市場前景。
[0003]傳統的方法是直接從黃芪中提取環黃芪醇，但受制于黃芪中較低的含量，產率較低且成本較高，因此選擇與環黃芪醇結構相似且含量較高的黃芪甲苷轉化生產是一種可行的生產工藝。由于兩者的差別只在于是否存在糖基修飾，目前國內的生產工藝均是利用各種方法打開糖苷鍵轉化生產環黃芪醇。由于結構的不穩定性，一般的水解反應會產生大量的副產物黃芪醇，其破壞原有的環結構，造成分離的困難。
[0004]目前國內關于環黃芪醇相關生產方法報道很少，中國發明專利CN104817610A和中國發明專利CN103880910A依據化學原理直接酸水解糖苷鍵或者經過氧化還原破壞糖環結構再水解糖苷鍵，通過一系列步驟可以得到環黃芪醇，但是反應過程要求條件較高，工藝較為繁瑣，這限制了大規模生產應用。
[0005]犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，屬于真菌門、接合菌亞門、接合菌綱、毛霉目、毛霉科。廣泛分布于土壤、酒曲和糞便中，空氣中常有它們的孢子存在，易污染其他微生物的純培養物。犁頭霉屬被廣泛的用于生物轉化的研究，例如藍色犁頭霉Absdia orchidis由于具有C11P-羥基化作用已用于氫化可的松的生產。
[0006]以微生物發酵技術制備環黃芪醇的方法尚未見報導。
【發明內容】
[0007]本發明是為避免上述現有技術所存在的不足之處，提供一種高效、低成本、簡單且產品純度高的環黃芪醇制備方法，所要解決的技術問題是通過生物轉化降解黃芪甲苷制備環黃芪醇。
[0008]本發明解決技術問題，采用如下技術方案:
[0009]本發明生物轉化降解黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法，其特點在于:以黃芪甲苷為底物，通過菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發酵，制得環黃芪醇。具體包括如下步驟:
[0010](I)種子培養
[0011]在錐形瓶中配制PDB培養基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發酵，在搖床溫度25?35°C、搖床轉速150?200r/min的條件下培養3天，獲得種子一級培養基;
[0012](2)轉化培養
[0013]將步驟(I)所獲得的種子一級培養基按1%的接種量接入15OmL改良PDB培養基中，在搖床溫度25?35°C、搖床轉速150?200r/min的條件下培養3天，然后加入25?50mg黃芪甲苷底物，繼續培養6天，獲得發酵液；
[0014](3)純化
[0015]將步驟(2)所得發酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0016]將萃取物溶解至甲醇中，再按照與萃取物質量比1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應I Omin，所得反應液分離、提純，即獲得目標產物環黃芪醇。
[0017]其中，所述改良PDB培養基的組成為:土豆浸出液300g/L，KH2P04 3g/L,MgSO4.H2Ol.5g/L，Vb lmg/L。PDB培養基的組成為:土豆浸出液200g/L，葡萄糖20g/L，KH2PO4 3g/L，MgSO4.H2O 1.5g/L，Vb lmg/L ο
[0018]所述黃芪甲苷底物的純度為50%?100%。
[0019]步驟(3)中分離、提純的步驟為:在反應液中加入體積不少于反應液體積的水，40°(:減壓濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機相濃縮至干后以甲醇溶解，通過硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標產物。柱層析使用硅膠正相柱。
[0020]本發明所用試劑和原料均市售可得。
[0021]該方法以微生物發酵技術降解黃芪甲苷得到高純度的環黃芪醇。該制備工藝簡單易行、成本低，整個操作過程在常溫、常壓下進行，適用于大批量生產。
[0022]與已有技術相比，本發明的有益效果體現在:
[0023]1、本發明以微生物發酵技術降解黃芪甲苷得到高純度的環黃芪醇，工藝簡單易行、成本低，最終環黃芪醇的轉化率達到60 %以上、純度高達95 %以上，轉化專一性較高；
[0024]2、本發明的整個工藝過程在常溫、常壓下進行，所要求的設備條件低，適用于大批量生產，有效解決了目前生產中原材料限制、提取率低等問題。
【附圖說明】
[0025]圖1為實施例1所得產物的色譜圖。
【具體實施方式】
[0026]實施例1
[0027]本實施例按如下步驟制備環黃芪醇:
[0028](I)種子培養
[0029]在錐形瓶中配制PDB培養基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，獲得種子一級培養基；
[0030](2)轉化培養
[0031]將步驟(I)所獲得的種子一級培養基按10%的接種量接入150mL改良PDB培養基中，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃芪甲苷含34.5mg)，繼續培養6天，獲得發酵液；
[0032]將步驟(2)所得發酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0033]將萃取物按10mg/mL的質量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質量比1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應1min，獲得反應液；
[0034]在反應液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機相濃縮至干后以甲醇溶解，通過硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標產物環黃芪醇。
[0035]經檢測，產物純度為95.5%、反應轉化率61.5%。
[0036]純度鑒定:將本實施例得到的環黃芪醇樣品用高效液相色譜儀檢測純度，色譜條件:色譜柱為分析柱Hypersil GOLD column(4.6mmX 150mm，5ym，Thermo Scientific);柱溫30°C ;流動相:Omin?13min甲醇:水=75: 25，13min?20min甲醇:水= 85:15，20min?30min甲醇100 % ;流速:lmL/min ；上樣量為1yL，ELSD漂移管溫度120 °C，ELSD氣流量2.1L/min。檢測出此樣品的環黃芪醇純度為95.5%，色譜圖如圖1所示。
[0037]實施例2
[0038]本實施例按如下步驟制備環黃芪醇:
[0039](I)種子培養
[0040]在錐形瓶中配制PDB培養基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發酵，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，獲得種子一級培養基；
[0041 ] (2)轉化培養
[0042]將步驟(I)所獲得的種子一級培養基按5%的接種量接入150mL改良PDB培養基中，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃苗甲苷含34.5mg)，繼續培養6天，獲得發酵液；
[0043]⑶純化
[0044]將步驟(2)所得發酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0045]將萃取物按10mg/mL的質量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質量1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應1min，獲得反應液；
[0046]在反應液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機相濃縮至干后以甲醇溶解，通過硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標產物環黃芪醇。
[0047]經檢測，產物純度為95.1 %、反應轉化率27 J %。
[0048]實施例3
[0049]本實施例按如下步驟制備環黃芪醇:
[0050](I)種子培養
[0051 ] 在錐形瓶中配制PDB培養基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，獲得種子一級培養基；
[0052](2)轉化培養[0053 ]將步驟(I)所獲得的種子一級培養基按1 %的接種量接入15OmL普通PDB培養基中，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃芪甲苷含34.5mg)，繼續培養6天，獲得發酵液；
[0054](3)純化
[0055]將步驟(2)所得發酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0056]將萃取物按10mg/mL的質量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質量比1:1的用量加入還原劑NaBH4，常溫反應I Omin，獲得反應液；
[0057]在反應液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機相濃縮至干后以甲醇溶解，通過硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標產物環黃芪醇。
[0058]經檢測，產物純度為95.1 %、反應轉化率44.8%。
[0059]實施例4
[0060]本實施例按如下步驟制備環黃芪醇:
[0061 ] (I)種子培養
[0062]在錐形瓶中配制PDB培養基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，獲得種子一級培養基；
[0063](2)轉化培養
[0064]將步驟(I)所獲得的種子一級培養基按10%的接種量接入150mL改良PDB培養基中，在搖床溫度30°C、搖床轉速180r/min的條件下培養3天，然后加入50mg黃苗甲苷底物(黃芪甲苷含34.5mg)，繼續培養2天，獲得發酵液；
[0065](3)純化
[0066]將步驟(2)所得發酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物；
[0067]將萃取物按10mg/mL的質量體積比溶解至甲醇中，再按照與萃取物質量比1:1的用量加入還原劑NaBH4，常溫反應I Omin，獲得反應液；
[0068]在反應液中加入等體積的水，40°C濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機相濃縮至干后以甲醇溶解，通過硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標產物環黃芪醇。
[0069]經檢測，產物純度為96.4%、反應轉化率34.0%。
【主權項】
1.一種生物轉化降解黃芪甲苷制備環黃芪醇的方法，其特征在于:以黃芪甲苷為底物，通過菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834發酵，制得環黃芪醇。2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于包括如下步驟: (1)種子培養 在錐形瓶中配制I3DB培養基，然后接入菌種犁頭霉Absidia sp.CGMCC 3.2834，在搖床溫度25?35 °C、搖床轉速150?200r/min的條件下培養3天，獲得種子一級培養基； (2)轉化培養 將步驟(I)所獲得的種子一級培養基按1 %的接種量接入150mL改良PDB培養基中，在搖床溫度25?35°C、搖床轉速150?200r/min的條件下培養3天，然后加入25?50mg黃苗甲苷底物，繼續培養6天，獲得發酵液； (3)純化 將步驟(2)所得發酵液與萃取劑乙酸乙酯等體積混合后在室溫下萃取三次、每次1min，所得萃取液真空濃縮至干，獲得萃取物； 將萃取物溶解至甲醇中，再按照與萃取物質量比1:1的用量加入還原劑NaBH4,常溫反應IOmin，所得反應液分離、提純，即獲得目標產物環黃芪醇。3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述改良PDB培養基的組成為:土豆浸出液300g/L,KH2PO4 3g/L,MgSO4.H2O 1.5g/L，Vb lmg/L。4.根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述黃芪甲苷底物的純度為50%?100 %。5.根據權要求2所述的方法，其特征在于:步驟(3)中分離、提純的步驟為:在反應液中加入體積不少于反應液體積的水，40°C減壓濃縮去甲醇，然后加入等體積的乙酸乙酯，靜置分層;取有機相濃縮至干后以甲醇溶解，通過硅膠層析柱純化，干燥，即獲得目標產物。
【文檔編號】C12R1/65GK106011213SQ201610409748
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月3日
【發明人】陳彥, 王力鳴, 王亞, 蔡正楠, 楊維維
【申請人】安徽大學