一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法
【專利摘要】本發明提供了一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，包括原料處理、第一種酶定向酶解、第二種酶定向酶解及純化處理的步驟。所述第一種酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶中的一種或幾種，所述第二種酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶或胰蛋白酶中的一種或幾種。本發明利用超高壓復合酶直接提取制備膠原蛋白肽，其工藝流程簡單，時間短，能耗少，成本低，綠色環保，且制備的膠原肽不變性，產率高，分子量小，活性高，易于被人體吸收利用。
【專利說明】
一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法
技術領域
[0001]本發明涉及生物工程技術領域，特別是一種復合酶分步定向酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法。
【背景技術】
[0002]膠原蛋白是一種生物性高分子物質，在動物細胞中扮演結合組織的重要角色。作為生物科技產業最具關鍵性的原材料之一，膠原蛋白需求量十分龐大，其應用領域包括生物醫藥、化妝品、保健品、食品和研究用途等。膠原蛋白按生產原料，可以分為魚鱗膠原蛋白、皮膠原蛋白和骨膠原蛋白等;按產品的分子量，又可以分為大分子量的膠原蛋白和小分子量的膠原肽，其中小分子量的膠原肽更易被人體吸收利用，因而具有更高的產品附加值，是膠原蛋白產品的發展方向。
[0003]膠原蛋白的生產主要通過酶解轉化動物原料而提取。傳統工藝提取膠原蛋白，需采用清水高溫蒸煮、酸水解、堿水解等方法對動物骨、皮等原料進行預處理，然后再經過酶解轉化提取膠原蛋白。清水高溫蒸煮法中，膠原分子加熱變性，容易變成大分子明膠，不利于人體吸收，降低了其使用價值。酸水解法中，有益的色氨酸，絲氨酸和酪氨酸會被破壞，且產品得率低，設備腐蝕嚴重，并產生二次污染。堿水解法中，有益的含羥基和巰基的氨基酸會被破壞。
[0004]西北地區具有資源豐富的牦牛骨皮原料，據統計，全球95%的牦牛產量和保有量在甘肅、青海和西藏三省。牦牛在高原惡劣環境下生長繁育，其進化過程賦予它抵御缺氧和高紫外線等惡劣條件，保持自身健康強壯的基因。體現在其骨骼上，牦牛骨的密度大，膠原蛋白含量高，其中所含氨基酸豐富而且全面，是極為優良的膠原蛋白原料，特別是用于生產強生健體的保健品和抵御紫外線的護膚品，均具有無可比擬的優點。但是也正因為牦牛骨骼強韌堅硬的原因，現有的工藝技術提取其中的膠原蛋白遇到一定的挑戰。
【發明內容】
[0005]為了克服現有技術的不足，本發明提供了一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，本發明的復合酶分步定向酶解牦牛骨皮工藝，不需酸、堿和高溫等處理過程，便可一步直接從原料中酶解轉化提取出小分子量的活性膠原肽，且制得的膠原肽產率高，分子量小，易于被人體吸收利用。
[0006]本發明解決其技術問題所采用的技術方案是:一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，包括如下步驟:
[0007]步驟[I]原料處理:將牦牛骨皮原料進行清洗，去除異物，然后常溫干燥，粉碎后得粒度為50?400目的原料粉末；
[0008]步驟[2]第一種酶定向酶解:將牦牛骨皮的粉末以料液重量比1:1?12的比例分散于第一種酶溶液中，調整溶液pH為2.0-9.0，控制超高壓反應器的壓力為150-500Mpa，在溫度為35?60 0C的條件下，酶解0.5-6hrs，得第一酶解液；
[0009]步驟[3]第二種酶定向酶解:將第一酶解液的pH調為第二種酶的最適pH，加入第二種酶，控制超高壓反應器的壓力為150?600Mpa，在溫度為40?65°C的條件下，酶解0.1-5hrs，得第二酶解液；
[0010]步驟[4]純化處理:所述第二酶解液經滅活處理后，經膜過濾，冷凍干燥，制得所述小分子量膠原蛋白活性肽。
[0011]優選的，步驟[I]中所述原料粉末的粒度為50?150目。
[0012]優選的，所述第一種酶溶液中的酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶中的一種或幾種。
[0013]優選的，所述第二種酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶或胰蛋白酶中的一種或幾種。
[0014]優選的，所述第一種酶溶液中酶的加入量為1500_6000U/g。
[0015]優選的，步驟[3]中加入第二種酶后酶液中第二種酶的含量為1500_6000U/g。
[0016]優選的，步驟[2]中料液重量比為1:2?8，溶液pH為2.4-7.8，控制超高壓反應器的壓力為200-400Mpa，在溫度為45-55 °C的條件下，酶解0.5_2hrs。
[0017]優選的，步驟[3]中溶液pH調為其最適pH，控制超高壓反應器的壓力為200-400Mpa，在溫度為45-55°C的條件下，酶解0.l_2hrs。
[0018]優選的，步驟[4]中所述膜過濾選擇截留的分子量為1500Da。
[0019]本發明的積極效果:本發明利用超高壓復合酶直接提取制備膠原蛋白肽，其工藝流程簡單，時間短，能耗少，成本低，綠色環保，且制備的膠原肽不變性，產率高，分子量小，活性高，易于被人體吸收利用。
[0020]說明書附圖
[0021 ]圖1為胃蛋白酶與其它酶復配對牦牛骨膠原蛋白肽提取效率的影響。
【具體實施方式】
[0022]下面結合附圖對本發明的優選實施例進行詳細說明。
[0023]實施例1
[0024]本發明優選實施例1提供一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，實現步驟如下:
[0025](I)原料處理
[0026]原料清洗、去除異物，常溫干燥，經粉碎機粉碎后，得到粉末粒度為50目；
[0027](2)第一種酶定向酶解
[0028]取牦牛骨的粉末Ig，以料液重量比1:3的比例，分散于木瓜蛋白酶的溶液中，木瓜蛋白酶用量為4000U/g，加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調節pH至5，控制超高壓反應器的壓力為300Mpa，在溫度為45°C的條件下，酶解2hrs ；
[0029](3)第二種酶定向酶解
[0030]將木瓜蛋白酶酶解后的溶液pH調為胰蛋白酶的最適pH7.8，加入胰蛋白酶，胰蛋白酶用量為5000U/g，控制超高壓反應器的壓力為300Mpa，在溫度為45°C的條件下，酶解2hrs ；
[0031](4)純化處理
[0032]酶解液經滅活處理后，膜過濾，冷凍干燥，制得膠原蛋白肽粉，用羥脯氨酸法測定，獲得膠原蛋白肽lOlmg。
[0033]實施例2
[0034]本發明優選實施例2提供一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，實現步驟如下:
[0035](I)原料處理
[0036]原料清洗、去除異物，常溫干燥，經粉碎機粉碎后，得到粉末粒度為100目；
[0037](2)第一種酶定向酶解
[0038]取牦牛骨的粉末1g，以料液重量比1:5的比例，分散于胰蛋白酶的溶液中，胰蛋白酶用量為5000U/g，加甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液調節pH至7.8，控制超高壓反應器的壓力為200Mpa，在溫度為45°C的條件下，酶解1.5hrs ；
[0039](3)第二種酶定向酶解
[0040]將胰蛋白酶酶解后的溶液pH調為胃蛋白酶的最適pH2.4，加入胃蛋白酶，其中胃蛋白酶用量為1000U/g，控制超高壓反應器的壓力為200Mpa，溫度為45°C的條件下，酶解
1.5hrs ；
[0041](4)純化處理
[0042]酶解液經滅活處理后，膜過濾，冷凍干燥，制得膠原蛋白肽粉，用羥脯氨酸法測定，獲得膠原蛋白肽1.lg。
[0043]實施例3
[0044]本發明優選實施例3提供一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，實現步驟如下:
[0045](I)原料處理
[0046]原料清洗、去除異物，常溫干燥，經粉碎機粉碎后，得到粉末粒度為50目；
[0047](2)第一種酶定向酶解
[0048]取牦牛皮的粉末1g，以料液重量比1:3的比例，分散于木瓜蛋白酶的溶液中，木瓜蛋白酶用量為4000U/g，加檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液調節pH至5.0，控制超高壓反應器的壓力為250Mpa，在溫度為45°C的條件下，酶解Ihrs;
[0049](3)第二種酶定向酶解
[0050]將木瓜蛋白酶酶解后的溶液pH調為菠蘿蛋白酶的最適pH5.0，加入菠蘿蛋白酶，其中菠蘿蛋白酶用量為2000U/g，控制超高壓反應器的壓力為250Mpa，在溫度為45 V的條件下，酶解Ihrs;
[0051 ] (4)純化處理
[0052]酶解液經滅活處理后，膜過濾，冷凍干燥，制得膠原蛋白肽粉，用羥脯氨酸法測定，獲得膠原蛋白肽1.3g。
[0053]實施例4
[0054]本發明優選實施例4提供一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，實現步驟如下:
[0055](I)原料處理
[0056]原料清洗、去除異物，常溫干燥，經粉碎機粉碎后，得到粉末粒度為100目；
[0057](2)第一種酶定向酶解
[0058]取牦牛皮的粉末5g，以料液重量比1:5的比例，分散于胰蛋白酶的溶液中，胰蛋白酶用量為5000U/g，加甘氨酸-氫氧化鈉緩沖溶液調節pH至7.8，控制超高壓反應器的壓力為250Mpa，在溫度為50°C的條件下，酶解Ihrs;
[0059](3)第二種酶定向酶解
[0000]將胰蛋白酶酶解后的溶液pH調為木瓜蛋白酶的最適pH 5.0，加入木瓜蛋白酶，其中木瓜蛋白酶用量為4000U/g，控制超高壓反應器的壓力為250Mpa，溫度為50°C的條件下，酶解Ihrs;
[0061 ] (4)純化處理
[0062]酶解液經滅活處理后，膜過濾，冷凍干燥，制得膠原蛋白肽粉，用羥脯氨酸法測定，獲得膠原蛋白肽0.5g。
[0063]實施例5
[0064]本發明優選實施例5提供一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，包括如下步驟:
[0065]步驟[I]原料處理:將牦牛骨皮原料進行清洗，去除異物，然后常溫干燥，粉碎后得粒度為50?400目的原料粉末；
[0066]步驟[2]第一種酶定向酶解:將牦牛骨皮的粉末以料液重量比1:1?12的比例分散于第一種酶溶液中，調整溶液pH為2.0-9.0，控制超高壓反應器的壓力為150-500Mpa，在溫度為35?60 0C的條件下，酶解0.5-6hrs，得第一酶解液；
[0067]步驟[3]第二種酶定向酶解:將第一酶解液的pH調為第二種酶的最適pH，加入第二種酶，控制超高壓反應器的壓力為150?600Mpa，在溫度為40?65°C的條件下，酶解0.1-5hrs，得第二酶解液；
[0068]步驟[4]純化處理:所述第二酶解液經滅活處理后，經膜過濾，冷凍干燥，制得所述小分子量膠原蛋白活性肽。
[0069]其中第一種酶選取胃蛋白酶，第二種酶分別選取木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶及菠蘿蛋白酶在上述相同的步驟下進行膠原蛋白肽的制備提取，其中獲得的胃蛋白酶與其它酶復配對牦牛骨膠原蛋白肽提取效率的影響如圖1所示，由此圖可看出胃蛋白酶相比其它蛋白酶對牦牛骨膠原蛋白肽有更好的提取效率。
[0070]以上所述的僅為本發明的優選實施例，所應理解的是，以上實施例的說明只是用于幫助理解本發明的方法及其核心思想，并不用于限定本發明的保護范圍，凡在本發明的思想和原則之內所做的任何修改、等同替換等等，均應包含在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟[I ]原料處理:將牦牛骨皮原料進行清洗，去除異物，然后常溫干燥，粉碎后得粒度為50?400目的原料粉末； 步驟[2]第一種酶定向酶解:將牦牛骨皮的粉末以料液重量比1:1?12的比例分散于第一種酶溶液中，調整溶液pH為2.0-9.0，控制超高壓反應器的壓力為150-500Mpa，在溫度為35?60 0C的條件下，酶解0.5-6hrs，得第一酶解液； 步驟[3]第二種酶定向酶解:將第一酶解液的pH調為第二種酶的最適pH，加入第二種酶，控制超高壓反應器的壓力為150?600Mpa，在溫度為40?65°C的條件下，酶解0.1-5hrs，得第二酶解液； 步驟[4]純化處理:所述第二酶解液經滅活處理后，經膜過濾，冷凍干燥，制得所述小分子量膠原蛋白活性肽。2.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:步驟[I ]中所述原料粉末的粒度為50?150目。3.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述第一種酶溶液中的酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶中的一種或幾種。4.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述第二種酶為木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、菠蘿蛋白酶或胰蛋白酶中的一種或幾種。5.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:所述第一種酶溶液中酶的加入量為1500-6000U/g。6.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:步驟[3]中加入第二種酶后酶液中第二種酶的含量為1500-6000U/g。7.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:步驟[2]中料液重量比為1:2?8，溶液pH為2.4-7.8，控制超高壓反應器的壓力為200-400Mpa，在溫度為45-55 °C的條件下，酶解0.5-2hrs。8.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:步驟[3]中溶液pH調為其最適pH，控制超高壓反應器的壓力為200-400Mpa，在溫度為45-55°C的條件下，酶解0.1-2hrs。9.根據權利要求1所述的一種酶解牦牛骨皮制備小分子量膠原蛋白活性肽的方法，其特征在于:步驟[4]中所述膜過濾選擇截留的分子量為1500Da。
【文檔編號】C07K14/78GK106011208SQ201610489372
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月29日
【發明人】肖建喜, 楊德慶, 李婷婷, 李紅霞
【申請人】肖建喜, 楊德慶