一種生產硫酸軟骨素的方法
【專利摘要】本發明提供了一種生產硫酸軟骨素的方法，將芽孢桿菌以4?6％接種量至種子培養基中，所述的芽孢桿菌的保藏編號CCTCC NO:M2016263，振蕩培養得到種子液，將種子液以接種量為4?6％接入發酵培養基中，在搖床上進行培養發酵得到含硫酸軟骨素的發酵液；將得到的硫酸軟骨素發酵液提純后得到硫酸軟骨素。本發明方法步驟簡單，條件溫和，產量較高，發酵生產原料不受動物骨原料短缺的限制，發酵產品可用于藥品原料和保健品原料。CCTCCNO:M201626320160516
【專利說明】一種生產硫酸軟骨素的方法
[0001]
技術領域
[0002]本發明屬于微生物發酵領域，涉及一種硫酸軟骨素，具體來說是一種生產硫酸軟骨素發酵液方法。
【背景技術】
[0003]硫酸軟骨素(Chondroitin Sulfate ,CS)是廣泛分布于動物軟骨組織中的一類酸性黏多糖。2010年Jolly對許多微生物發酵進行分析，發現有多種微生物也能產生硫酸軟骨素。例如巴斯德桿菌(P asiet/re_/_/a multocida )，大腸桿菌(Escherichia coll),芽孢桿菌等少數細菌中存在硫酸軟骨素。硫酸軟骨素分子結構為由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基半乳糖構成的重復二糖單位組成的多糖，硫酸軟骨素一般含有50?70個二糖基本單位，相對分子質量在10 000?50 000之間。按酯化的硫酸基團位置不同，硫酸軟骨素分為A、B、C、D、E、F等多種類型。臨床上主要用于關節炎、肩關節痛、冠心病、心絞痛等輔助治療，近年來，硫酸軟骨素在醫藥制劑、醫學材料、化妝品、保健品等領域更廣泛得到應用，市場需求趨愈來愈大。我國生產和出口量逐年大幅增長，發展前景廣闊。
[0004]目前，我國主要采用酶解法或堿提-酶解法工藝從動物骨頭制備硫酸軟骨素。極少有采用微生物發酵法生產硫酸軟骨素的報道。而動物骨資源比較貧乏，急待開發新的生物資源及新的技術工藝來生產硫酸軟骨素。
【發明內容】
[0005]針對現有技術中的上述技術問題，本發明提供了一種生產硫酸軟骨素的方法，所述的這種生產硫酸軟骨素的方法要解決現有技術從動物骨頭中生產硫酸軟骨素的方法中，骨頭原料短缺難以擴大生產規模的技術問題。
[0006]本發明提供了一種生產硫酸軟骨素的方法，包括如下步驟:
1)將芽孢桿菌以接種量為4-6%接種至種子培養基上進行震蕩培養15_18h，得到種子培養液，所述的芽孢桿菌的保藏編號CCTCC N0:M2016263，種子培養條件為:轉速120-160r/m，初始pH值為7.0-7.2，發酵溫度為28-35 °C;
2)將步驟I)得到種子液以接種量為4-6%接種到裝有發酵培養基的容器中，在搖床上培養30-35h;即可得到含硫酸軟骨素發酵液，培養條件為:轉速120-160r/m，初始pH值為7.0-7.2，溫度為30-35°(:;
3)將得到的硫酸軟骨素發酵液提純后得到硫酸軟骨素。
[0007]進一步的，所述種子培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，每L培養基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化鈉0.5-1.0g,硫酸鎂0.5-1.0g,磷酸二氫鉀1.5-2.5g，所述的氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳
0.1-1.0g，余量為水。
[0008]進一步的，所述發酵培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成;每L培養基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化鈉0.5-2.(^，硫酸鎂1.5-2.58，磷酸二氫鉀
1.5-2.5g，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳0.1-1.0g,磷酸氫二鈉1.0-4.0 g，磷酸二氫鈉0.3一3.0g，余量為水。
[0009]具體的，采用乙醇沉淀法進行純化處理得到硫酸軟骨素。
[0010]本發明的一種芽孢桿菌，其分類命名為芽孢桿菌G-09 Bacillussp.G-09，該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)中，中國典型培養物保藏中心的地址為:中國、武漢、武漢大學，保藏日期為2016年5月16號，保藏號為CCTCC N0:M201623。
[0011]通過本發明方法獲得的硫酸軟骨素多糖的產量約127mg/L。
[0012]本發明和已有技術相比，其技術進步是顯著的。本發明的方法步驟簡單，條件溫和，產量較高，發酵生產原料不受動物骨原料短缺的限制，發酵產品可用于藥品原料和保健品原料。
[0013]
【具體實施方式】
[0014]實施例1:芽孢桿菌的篩選方法。
[00?5]芽孢桿菌分離純化:從采集于郊外枯枝爛葉的土壤中，稱取3_5g土樣，風干后，放入30-50ml滅菌蒸餾水(玻璃珠5粒)的三角瓶中，搖瓶30-60min，然后放在85°C水浴30min，冷卻后，稀釋至10—3，10—4，10—5稀釋液，分別取稀釋液0.1-0.2ml涂布于牛肉膏蛋白胨平板，置于35°C，倒置培養32-48h，觀察菌落的形態特征。并調取單菌落，用孔雀綠染色法染色進一步鏡檢觀察。孔雀綠染色法步驟如下:
(I)挑菌落按革蘭氏染色法涂片后，用6%孔雀綠水溶液染1min。
[0016](2)用自來水沖洗。(3)用0.5%番紅液復染2min，水洗，吸干。于顯微鏡下觀察，芽孢呈綠色，菌體呈紅色。挑出產芽孢的菌落編號保存，作為進一步篩選的菌種。
[0017]產硫酸軟骨素芽孢桿菌的篩選:將上述分離純化得到的菌種接種于LB肉湯培養基(蛋白胨10g，牛肉膏15g，NaC115g，蒸餾水1000ml，調節PH7.2)培養24h-48h后離心收集發酵液，發酵液采用高效液相色譜法分析，選出發酵液中產酸軟骨素較高菌株，即為產硫酸軟骨素的芽孢桿菌。將該菌株保藏于中國典型培養物保藏中心(CCTCC)中，其保藏號為CCTCCN0:M201623。
[0018]將篩選得到的產硫酸軟骨素的芽孢桿菌經形態學、生理生化鑒定為芽孢桿菌，并命名為Bacillus.sp G_09o
[0019]實施例2: Bacillus.sp G-09菌株的鑒定 (I)形態特征觀察
將G-09菌株接種于LB固體培養基中，在35°C恒溫條件下培養48h，形成菌落，菌落特征為乳白色不透明、濕潤、粘稠；顯微鏡觀察菌體呈桿狀，末端圓，單個或呈短鏈狀排列。菌體有芽孢形成，芽胞直徑大于1.Ομπι，革蘭氏染色呈紫色，為革蘭氏陽性桿菌。
[0020](2)生理生化鑒定
參考RE.希坎南.《伯杰氏細菌鑒定手冊》(北京:科學出版社，1989 )的方法，對G-09菌株進行生理生化特性鑒定，鑒定結果是VP試驗陽性，MR試驗陽性，接觸酶實驗陽性，明膠液化陽性，吲哚試驗陽性，檸檬酸鹽實驗陽性，淀粉水解實驗陽性，耐鹽實驗陽性。
[0021](3) 16S rDNA分子生物學鑒定 16S rDNA的擴增:
擴增引物:P1:5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，
P2:5-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3 。
[0022]PCR 反應體系:0.20μ1 Taq DNA 聚合酶；2.5μ1 10 X PCR 反應緩沖液；Ιμ? dNTP(各2.5111]\0;0.5卩1 Pl(10 uM)；0.5yl P2(10 uM) ;0.5μ1 基因組DNA( 20_50ngAU)，加雙蒸H20 至25μ1。
[0023]PCR反應條件:94°C 5 min；94°C 30 S，55°C 40 S，72°C 90 s，30個循環；72°C終延伸10 min。
[0024]PCR產物檢測及16S rDNA序列的測定:PCR產物經過I %瓊脂糖電泳(150V、10mA20min)后，將PCR擴增產物進行測序，然后將得到的16 S rDNA序列提交到NCBI核酸數據庫中進行BLAST在線分析。所得16S rDNA序列與GenBank數據庫中核苷酸序列進行同源性分析，得到與之親緣關系最近的菌種BaciIIus sp 0711P6_2;HM226670，同源性達99%。
[0025]根據菌落的形態，生理生化特性，根據形態特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定G-09菌株為芽孢桿菌(Bacillus.sp)，將其命名為:芽孢桿菌G_09(Bacillus.spG-09)ο
[0026]實施例3
本發明提供了一種生產硫酸軟骨素的方法，包括如下步驟:
(I)將芽孢桿菌以接種量為5%接種至種子培養基上進行震蕩培養16h，得到種子培養液，所述的芽孢桿菌的保藏編號CCTCC NO: M2016263。種子培養條件為:轉速120/m，初始pH值為7.0，發酵溫度為30 V，所述種子培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，每L培養基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化鈉0.5-1.0g,硫酸鎂0.5-1.0g,磷酸二氫鉀1.5_2.5g，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳
0.1-1.0g，余量為水。
[0027](2)將(I)得到種子液以接種量為5%接種到裝有發酵培養基三角瓶中，在搖床上培養30h;即可得到硫酸軟骨素發酵液。培養條件為:轉速120r/m，初始pH值為7.2，溫度為32°C。所述發酵培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成。每L培養基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化鈉0.5-2.(^，硫酸鎂1.5-2.58，磷酸二氫鉀1.5-2.58，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳0.1-1.0g,磷酸氫二鈉1.0-4.0g,磷酸二氫鈉0.3-3.0g,余量為水。
[0028](3)生產的發酵液再經過本領域常用的乙醇沉淀法進行純化處理即可得到硫酸軟骨素，多糖的產量約112mg/L。
[0029]實施例4
本發明提供了一種生產硫酸軟骨素的方法，包括如下步驟:
(I)將芽孢桿菌以接種量為4%接種至種子培養基上進行震蕩培養18h，得到種子培養液，所述的芽孢桿菌的保藏編號CCTCC N0:M2016263。種子培養條件為:轉速140r/m，初始pH值為7.1，發酵溫度為28°C，所述種子培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，每L培養基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化鈉0.5-1.0g,硫酸鎂0.5-1.0g,磷酸二氫鉀1.5_2.5g，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳
0.1-1.0g，余量為水。
[0030](2)將(I)得到種子液以接種量為4%接種到裝有發酵培養基三角瓶中，在搖床上培養35h;即可得到硫酸軟骨素發酵液。培養條件為:轉速120r/m，初始pH值為7.2，溫度為30°C。所述發酵培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成;每L培養基中，每L培養基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化鈉0.5-2.(^，硫酸鎂1.5-2.58，磷酸二氫鉀
1.5-2.5g，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳0.1-1.0g,磷酸氫二鈉1.0-4.0g,磷酸二氫鈉0.3一
3.0g，余量為水。
[0031](3)生產的發酵液再經過本領域常用的乙醇沉淀法進行純化處理即可得到硫酸軟骨素，多糖的產量約105mg/L。
[0032]
實施例5
本發明提供了一種生產硫酸軟骨素的方法，包括如下步驟:
(I)將芽孢桿菌以接種量為6%菌接種至種子培養基上進行震蕩培養15h，得到種子培養液，所述的芽孢桿菌的保藏編號CCTCC NO:M2016263。種子培養條件為:轉速160r/m，初始PH值為7.0，發酵溫度為32°C，所述種子培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，每L培養基中，含有蔗糖15-20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化鈉0.5-1.0g，硫酸鎂0.5-1.0g,磷酸二氫鉀1.5_2.5g，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳0.1-1.0g，余量為水。
[0033](2)將(I)得到種子液以接種量為6%接種到裝有發酵培養基三角瓶中，在搖床上培養32h;即可得到硫酸軟骨素發酵液。培養條件為:轉速160r/m，初始pH值為7.0，溫度為30°C。所述發酵培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成;每L培養基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉10-15g，氯化鈉0.5-2.(^，硫酸鎂1.5-2.58，磷酸二氫鉀1.5-2.58，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳0.1-1.0g，磷酸氫二鈉1.0-4.0g，磷酸二氫鈉0.3-3.0g,余量為水。
[0034](3)生產的發酵液再經過本領域常用的乙醇沉淀法進行純化處理即可得到硫酸軟骨素，多糖的產量約127mg/L。
[0035]所述內容僅為本發明構思下的基本說明，而依據本發明的技術方案所作的任何等效變換，均應屬于本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種生產硫酸軟骨素的方法，其特征在于包括如下步驟: 1)將芽孢桿菌以接種量為4-6%接種至種子培養基上進行震蕩培養15_18h，得到種子培養液，所述的芽孢桿菌的保藏編號CCTCC N0:M2016263，種子培養條件為:轉速120-160r/m，初始pH值為7.0-7.2，發酵溫度為28-35 °C; 2)將步驟I)得到種子液以接種量為4-6%接種到裝有發酵培養基的容器中，在搖床上培養30-35h;即可得到含硫酸軟骨素發酵液，培養條件為:轉速120-160r/m，初始pH值為7.0-7.2，溫度為30-35°(:; 3)將得到的硫酸軟骨素發酵液提純后得到硫酸軟骨素。2.根據權利要求1所述的一種生產硫酸軟骨素的方法，其特征在于:所述種子培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，每L培養基中，含有蔗糖15_20g，蛋白胨15-20g，酵母粉15-20g，氯化鈉0.5-1.(^，硫酸鎂0.5-1.(^，磷酸二氫鉀1.5-2.5g，所述的氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳0.1-1.0g,余量為水。3.根據權利要求1所述的一種生產硫酸軟骨素的方法，其特征在于:所述發酵培養基由蔗糖、蛋白胨、酵母粉、氯化鈉、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、氯化鈣、硫酸錳和水組成，所述緩沖液由磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉組成;每L培養基中，含有蔗糖20-50g，蛋白胨10-15g，酵母粉ΙΟ-? 5g ，氯化鈉0.5-2.0g，硫酸鎂1.5-2.5g，磷酸二氫鉀1.5-2.5g，氯化鈣0.2-0.5g，硫酸錳.0.1-1.0g,磷酸氫二鈉1.0-4.0 g，磷酸二氫鈉0.3-3.0g余量為水。
【文檔編號】C12R1/07GK106011200SQ201610515101
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】龔鋼明, 趙芳芳
【申請人】上海應用技術學院