一種新化合物球腔烯胺的制備方法

一種新化合物球腔烯胺的制備方法
【專利摘要】本發明提供一種新化合物球腔烯胺的制備方法，包括以下步驟：1)獲得ZJLQ129發酵液；2)獲得球腔菌素；3)獲得球腔烯胺。CCTCC NO：M201551720150909
【專利說明】
-種新化合物球腔稀胺的制備方法
技術領域
[0001] 本發明設及化學領域，具體地說是一種新化合物球腔締胺的制備方法，名和氏球 腔菌菌株ZJLQ129可產生代謝產物二苯并巧喃類化合物球腔菌素(-)mycousunine，該化合 物可衍生獲得球腔締胺（-)mycousunine amide,球腔締胺（-)mycousunine amide具有免疫 抑制活性。
【背景技術】
[0002] 植物內生真菌(Ρ?Βη?θη?Ιοφ^??χ化ngi)是指那些在其生活史的一定階段或全部 階段生活于健康植物的各種組織和器官內部的真菌，，被感染的宿主植物(至少是暫時）不 表現出外在癥狀，，可通過組織學方法或從嚴格表面消毒的植物組織中分離或從植物組織 內直接擴增出微生物DNA的方法來證明其內生。它是植物微生物系統中的內生真菌，廣泛存 在于植物組織內，不受外界環境的影響。它是植物微生物系統中的天然組成成分，，在進化 過程中與植物寄主建立了和諧的共生關系，其次生代謝產物十分豐富。植物內生真菌幾乎 存在于所有目前已研究過的植物中，分布廣，種類多。研究表明，感染內生菌的植物宿主往 往具有生長快速、抗逆境、抗病害、抗動物危害等優勢，比未感染植株更具生存競爭力。在內 真生菌-植物宿主-食草動物生態系統中，植物內生真菌扮演著前所未知的重要生態學作 用。發揮運些作用的物質基礎是內生真菌產生的豐富多樣的次生代謝產物，它們具有多種 生物活性，在農業和（或）醫藥業中具有重要的應用潛力。近年來，隨著美國科學家 A.Stierle在太平洋短葉杉上發現了抗腫瘤藥物紫杉醇的產生菌，藥用植物和溯危植物內 生真菌及其活性物質的研究成為了藥物開發的重要方向。我國植物資源十分豐富，對其內 生真菌的研究將有利于微生物藥物的開發和珍稀植物資源的保護。
[0003] 常用的免疫抑制劑主要有五類：（1)糖皮質激素類，如可的松和強的松；（2)微生物 代謝產物，如環抱菌素和藤霉素等；（3)抗代謝物，如硫挫嚷嶺和6-琉基嚷嶺等；（4)多克隆 和單克隆抗淋己細胞抗體，如抗淋己細胞球蛋白和0KT3等；（5)燒化劑類，如環憐酷胺等。其 中，微生物酵解作為主要合成方法，已有多種產品，如環抱菌素 CsA類、他克莫司化crolimus (FK506)、雷帕霉素 Rapamycin(RPM)及其衍生物SDZ RAD、Mizor化ine(MZ)等。W環抱菌素為 例，屯十年代后期瑞±的恥'61發現了一種從霉菌酵解產物里提取的一種只含11個氨基酸 的環形多膚，取名為環抱素(CsA)，可W有效地特異性抑制淋己細胞反應和增生。對T細胞， 尤其是TH細胞有較好的選擇性抑制作用，而對其他的免疫細胞的抑制作用則相對較弱，因 此在抗器官移植排斥中取得了很好的療效;也用于自身免疫病的治療，因此是一種具有很 高臨床使用價值的免疫抑制劑。經10年的臨床試驗應用研究證實其抗排斥反應作用較其他 藥物強而且副作用小的多。故于八十年代末被批準正式注冊投入市場應用。CsA近20年的臨 床應用顯示了神奇的效果，使得除小腸移植外，肝、腎、屯、及屯、/肺、膜移植的病人/移植物一 年存活率達70-85%，而在此之前僅30-50% dCsA相關性神經毒性癥狀的發生率大約為 10-28%，是影響患者預后的一種較為重要的因素。輕度W頭痛、肢體震顫、感覺障礙等多 見，中度W視力障礙為主。CsA相關神經毒性的重癥表現發生率極低。
[0004] 植物內生真菌作為與植物共生的真菌，其在與植物共生的過程中，發展擁有與普 通致病菌不同的天然代謝產物。分離植物中存在的新的內生真菌，探索該菌的次生代謝產 物活性，是一個新的開發方向。

【發明內容】

[0005] 本發明提供一種新化合物球腔締胺的制備方法:包括W下步驟：
[0006] 1)制備Z化Q129發酵液:將直徑為0.5厘米的ZJLQ129菌餅共10個接入500ml PDB中 于25 °C，200轉搖床上培養10天得到菌絲液，菌絲液在無菌條件下粉碎;在500ml PDB接入菌 絲液25ml，室溫下靜置培養2周后過濾分別獲得發酵液與菌絲體。
[0007] 2)制備球腔菌素:發酵液用乙酸乙醋萃3次后萃取液濃縮得浸膏A，重1.72g，菌絲 體用丙酬浸泡過夜后濃縮至小體積，獲得浸膏B，重1.76g;合并二部分得浸膏C，重3.5g;取 浸膏C 3.5g加15g硅膠拌樣，旋轉蒸發儀蒸干，200-300硅膠950克干法裝柱，將拌樣后的樣 品上樣后進行柱層析分離，依次用石油酸：乙酸乙醋體積比4:1，石油酸：乙酸乙醋體積比3: 2,石油酸：乙酸乙醋體積比3:7,乙酸乙醋：甲醇體積比4:1分別進行梯度洗脫分離，硅膠薄 層層析和茵香醒顯色劑顯色，合并Rf值為0.46且茵香醒顯色為藍色的組分;該組分1.70g用 凝膠柱層析分離純化，W氯仿：甲醇體積比1:1為洗脫劑洗脫分離，硅膠薄層層析和茵香醒 顯色劑顯色，獲得球腔菌素純品300mg。
[000引3)制備球腔締胺:取純品球腔菌素200mg，于Ξ頸瓶中，冰鹽浴中至0°C，通入氨氣 反應30分鐘，樣品濃縮至干，取濃縮后的樣品7克用甲醇溶解，加14g硅膠拌樣上柱，加入洗 脫劑為石油酸:氯仿：甲醇=18:4:1，200-300目硅膠柱層析分離，獲得新化合物球腔締胺 150mg。
[0009] 本發明同時提供了上述名球腔締胺具有免疫抑制活性。球腔締胺是由名和氏球腔 菌Mycosphaerella nawae Z化Q129發酵產生的次生代謝產物球腔菌素氨化衍生而來。名和 氏球腔菌Mycosphaerella nawae ZJXQ129保藏名稱為：Mycosphaerella nawae ZJXQ129， 保藏單位：中國典型培養物保藏中屯、，保藏地址：中國武漢武漢大學;保藏日期：2015年9 月9日，保藏號：CCTCC N0:M2015517。
[0010] 上述優選的，球腔締胺具有免疫抑制活性。優選的，在化Μ濃度下球腔締胺對刀豆 蛋白A誘導的Τ細胞增殖的免疫抑制率為32.4±6.2%。
[0011] 球腔菌素化合物具有免疫抑制活性。優選的，ΙΟμΜ濃度球腔菌素化合物的免疫抑 制率為51.28 %。
[0012] 免疫抑制：是指對于免疫應答的抑制作用，或者說是對機體的免疫反應具有抑制 作用。免疫抑制劑能抑制與免疫反應有關細胞(Τ細胞和Β細胞等巨隧細胞）的增殖和功能， 能降低抗體免疫反應。
【附圖說明】
[0013] 圖1:球腔菌素（-)mycousunine結構式圖
[0014] 圖2:球腔締胺（-)mycousunine amide結構式圖
[0015] 圖3:球腔締胺（-)mycousunine amide絕對構型圖
[0016] 圖4:球腔締胺(-)mycousunine amide(化合物2)選擇性抑制T細胞增殖。（A):刀豆 蛋白A(Con A)誘導的Τ細胞增殖。（B):脂多糖(LPS)誘導的B細胞增殖。（C):PANC-1和A549細 胞增殖。縱坐標為細胞相對增殖率，η = 4，與對照組(OnM組)比較，bp<〇. 0巧日平<0.001。
[0017] 圖5: (A和B):球腔締胺（-)mycousunine amide(化合物2)抑制CD3+T細胞增殖。縱 坐標表示CD3+T細胞的比例。n = 3，與對照組比較，bp<〇. 01和。P<〇. 001。（C):化合物2的細胞 毒性。縱坐標表示細胞存活率，η = 4，與對照組(OnM組)比較，ap<〇. 05，bp<〇. 0巧日平<0.001。 [0018]圖6:球腔締胺(-)mycousunine amide(化合物2)抑制活化T細胞中細胞因子的分 泌。縱坐標表示細胞因子的濃度，η = 3，與對照組比較，ap<〇. 05，bp<〇. 01和平<0.001。
【具體實施方式】
[0019] 新化合物球腔締胺的制備方法是主要是通過名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)Z化Q129發酵產生的代謝產物球腔菌素衍生化得到的，下面結合附圖對本發明的具 體實施方式作進一步詳細說明。
[0020] 本發明中的主要儀器包括:3K- 30高速臺式離屯、機，德國Sigma; RE-6000A旋轉蒸發 器，上海亞榮；玻璃層析柱；LCQ-Advantage型質譜儀，美國Finnigan; DRX- 500型核磁共振 儀，德國化址er公司。MC0-15AC型細胞培養箱，日本Ξ洋公司；SpX-250B-Z生化培養箱，上海 博訊實業有限公司；1700型電子天平，德國Sadorius公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺，蘇州安 泰空氣技術有限公司；LD5-2A型離屯、機，北京醫用離屯、機廠；1-13型離屯、機，德國SIGMA公 司;MH-1型微量振蕩器，江蘇海口市其林貝爾儀器制造有限公司；680型酶聯免疫檢測儀，美 國Bio-Rad公司；synergy-2SLFPA全波長多功能酶標儀，美國BioTek公司；XDS-1B型生物倒 置顯微鏡，重慶光學儀器廠；1X73研究級倒置巧光顯微鏡，日本Olympus公司；5804R型高速 冷凍臺式離屯、機，德國邱pendorf·公司；PTC-200PCR儀，美國Bio-Rad公司；ABIPRISM?7900 巧光定量PCR儀，美國應用生物系統公司；Nanc)Drop?ND-1000全波長紫夕tv可見光掃描分光 光度計:美國賽默飛公司;FACS化libur型流式細胞儀:美國Becton Dickson公司。
[0021] 本發明中的主要試劑包括:柱層析硅膠(200-300目），青島海洋化工廠;柱層析凝 膠（Sephadex LH-20) Pharmacia公司。刀豆蛋白A(Con A)、脂多糖LPS、醋酸地塞米松、3- [4,5-dimethylthylthi曰zol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetr曰zoliumbromide(MTT)、臺酪藍、 二甲基亞諷溶液(DMS0)購自Sigma公司；環抱菌素 A(CsA)由華東醫藥股份有限公司饋贈； RPMI1640細胞培養液和DMEM培養液購自化ermo Fisher公司；新生牛血清購自杭州四季青 生物工程有限公司；100 X青鏈霉素溶液和化nk' S液購自江蘇碧云天生物工程研究所;含 10%滅火胎牛血清和IX青鏈霉素溶液的RPMI1640細胞培養液即為完全培養液;40皿孔間 細胞濾網購自 Biologix公司；抗體 FITC-anti-CD3，PE-anti-CD4，陽-anti-CD8，PE-anti- CD69和陽-anti-CD25購自eBioscience公司；小鼠細胞因子（比-2和IFN-丫化lisa檢測試劑 盒購自武漢博±德生物工程公司；Trizol購自Invitrogen公司；MMLV反轉錄酶購自 化rmentas公司；SYBR Green PCR試劑盒購自TIANGEN公司；PCR引物及其他PCR試劑購自上 海生工生物工程技術有限公司；其余試劑均為國產分析純。
[0022] 實施例一、名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)ZJXQ129的獲得
[0023] 名和氏球腔菌菌株(Mycosphaerella nawae)Z化Q129的分離培養與鑒定：
[0024] 在實驗室中按下列條件和步驟分離培養，即可獲得本發明所述的名和氏球腔菌菌 株Z化Q129:
[0025] 1)從我國浙江龍泉自然保護區采集，將采集的拔奠葉子用濃度0.5% (w/v)的次氯 酸鋼進行表面消毒lOmin，然后無菌水漂洗后置于無菌濾紙上吸干水。費奠，也稱金剛藤，百 合科費奠屬，多年生藤本落葉攀附植物。生于山坡林下，分布于中國長江W南各地，攀援灌 木，葉薄革質或堅紙質，干后通常紅、褐色或近古銅色，圓形、卵形或其他形狀，長3-10厘米， 寬1.5-6(-10)厘米，下面通常淡綠色，較少蒼白色;葉柄長5-15毫米，約占全長的1/2-2Λ具 寬0.5-1毫米(一側）的銷，幾乎都有卷須，少有例外，脫落點位于靠近卷須處，根狀莖粗厚， 堅硬，為不規則的塊狀，粗2-3厘米。莖長1-3米，少數可達5米，疏生刺。
[00%] 2)用無菌刀片把表面消毒過的費奠葉子切成1cm左右大小的組織片，將組織片移 接在含l(K)μg/ml氨節青霉素和鏈霉素的2%(w/v)水瓊脂平板上，光照培養箱中培養，培養 條件:25°C，16小時光照，8小時黑暗；
[0027] 3)待菌絲長出后，將單菌絲頂端移接到PDA固體培養基上培養，25Γ培養，連續純 化3次，獲得純培養。本發明的名和氏球腔菌菌株ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae Z化Q129 CCTCC NO: M2015517)具有如下特性:PDA培養基上生長緩慢，20-25d菌落直徑為2- 3畑1，60-66d菌落直徑為3-4cm，生長速率減小。PDA培養基上于25°C，12小時黑暗交替培養， 菌落呈不規則形，無氣生菌絲，菌絲初期為灰色，后期變為灰黑色，背面和正面均有皺折，菌 落邊緣不整齊，無色素分泌;子囊座為黑色，不產生抱子，菌絲有隔膜。名和氏球腔菌菌株 ZJLQ129(即Mycosphaerella nawae Z化Q129 CCTCC N0:M2015517)，它屬于真菌界 (Fungi)，雙核亞界（Dikarya)，子囊菌口（Ascomycota)，盤菌亞口（Pezizomycotina)，子囊 菌綱（Ascomycetes)，盤菌目（Pezizales)，盤菌科（Pezizaceae)，球腔菌屬 (Mycosphaerella)。
[0028] 4)菌種鑒定:將ZJLQ129進行be化-tubulin基因測序，并利用BLAST程序進行比對， 利用PAUP程序進行系統發育分析。
[0029] 將菌株菌絲在液氮中研成粉末，取lOOmg粉末裝于1.5mL離屯、管中，采用DNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN)按廠商的程序提取基因組DM。采用通用引物BT1(5'- AACATGCGTGAGATTGTAAGT-3 '）和BT22(5 '-TCTGGATGTTGTTGGGAATCC-3 '）擴增beta-tubulin 基因，PCR體系：DNA模板（100ng/yL)5.0化，10XPCR緩沖液（含 25mmol/L 1旨(：12)5.0化， dNTPs(5mmol/L)1.0yL，引物（50yg/mL)各0.扣L，Taq DNA聚合酶（211/化）1化，加水補足50μ L，混勻后在BI0RAD公司S1000型號的PCR儀上進行PCR反應，PCR反應條件:94°C3min;94°C 30s，53°C50s，72°C90s，35 個循環；72°C lOmin。
[0030] PCR擴增產物用Axygen柱式DNA膠回收試劑盒進行純化。純化的ITS rDNA PCR擴增 產物分別用擴增引物對ITSl和ITS4測序，純化的beta-tubulin擴增產物測序。測序由上海 生工生物工程服務有限公司完成。測得的序列在GenBank上進行BLAST捜索。基于化AST結 果，用軟件Clus化1 X 1.81將菌株ZJLQ129的序列與GenBank上球腔菌屬的相關序列進行比 對，然后進行系統發育分析。W上結果表明菌株ZJLQ129可W定名為名和氏球腔菌 Mycosphaerella nawae。
[0031] 實施例二、球腔締胺前體球腔菌素(-)mycousunine的制備和結構鑒定
[0032] 1)名和氏球腔菌菌株(Mycos地aerella nawae)ZJXQ129發酵培養，依次進行W下 步驟：
[0033] 將ZJLQ129菌餅(直徑為0.5厘米)共10個接入500ml PDB中于25°C，200轉搖床上培 養10天，培養液在無菌條件下粉碎，加入500ml PDB中培養，每瓶接入菌絲液25ml，共接40瓶 即20L，于室溫下靜置培養2周后過濾分別獲得發酵液與菌絲體。其中發酵液用乙酸乙醋萃3 次后萃取液濃縮得浸膏1.72g(A部分），菌絲體用丙酬浸泡過夜后濃縮至小體積，獲得浸膏 1.76(B部分）。合并二部分得浸膏3.5g(C部分）。
[0034]其中上述培養基或培養液的成分如下：
[00；3日]PDA培養基：即馬鈴馨葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar)去皮馬鈴馨200g，切成 小塊，加水煮沸20min，W紗布濾去固體殘渣，濾液加水補足至lOOOmL，加入20g葡萄糖溶解， 再加入15g溶化的瓊脂粉，分裝，12rC滅菌20min備用。
[0036] PDB培養液：即馬鈴馨葡萄糖(potato dextrose broth):去皮馬鈴馨200g，切成小 塊，加水煮沸20min，W紗布濾去固體殘渣，濾液加水補足至lOOOmL，加入20g葡萄糖溶解，分 裝，121 C滅困20min備用。
[0037] 2)化合物的制備：
[0038] 取上述浸膏C 3.5g加15g硅膠拌樣，旋轉蒸發儀蒸干。另外，用200-300硅膠950克 干法裝柱，將拌樣后的樣品上樣后進行柱層析分離，依次用石油酸：乙酸乙醋4: l(v/v)，石 油酸：乙酸乙醋3:2(v/v)，石油酸：乙酸乙醋3:7(v/v)，乙酸乙醋，乙酸乙醋：甲醇4:l(v/v) 分別進行梯度洗脫分離，每500ml接收1個流分，共接收31個流分，將接收的樣品進行硅膠薄 層層析，W茵香醒顯色劑顯色后，將Rf值為0.46且茵香醒噴霧顯色為藍色的流分合并，獲得 Fr8運一部分。茵香醒顯色劑的配方如下：茵香醒(對甲氧基苯甲醒）1:廣譜。配制方法：135 乙醇巧址濃硫酸+1.5mL of冰醋酸+3.7mL茵香醒，劇烈攬拌，使混合均勻。茵香醒(對甲氧基 苯甲醒)2:祗締，按樹腦(cineoles)，withanolides，出油相堿(acronycine)。配制方法:茵 香醒:肥1 〇4巧酬:水（1:10: 20:80)。化8部分(Rf值=0.46)共1.70g采用凝膠柱層析分離純 化，W氯仿：甲醇l:l(v/v)為洗脫機洗脫反復分離，硅膠薄層層析檢測，W茵香醒顯色劑顯 色后，合并組分相同的流分，最終獲得純品300mg，記為化合物（1)。化合物（1)是從名和氏球 腔菌株ZJLQ129中分離獲得的代謝產物。
[0039] 3)化合物（1)球腔菌素(-)mycousunine的鑒定過程如下：
[0040] 化合物（1)，見圖 1，黃色針晶，mp 86-89°C(Me0H);HRESIMS m/z:376.1158M+ (calcd for Cl姐2〇〇8 376.1158)1h NMR(400MHz，CDCl3)，3.17(lH，d，J=18Hz，H-4a)，3.31 (lH，d，J=18Hz，H-4b)，1.63(3H，s，H-10)，2.56(3H，s，H-12)，2.59(3H，s，H-14)，2.04(3H， s，H-15)，3.54(3H，s，H-16).Uc 醒R(l〇〇MHz，CDCl3)197.7(s，l-C)，110.7(s，2-C),194.6 (s，3-C)，37.9(t，4-C)，51.3(q，4a-C)，156.6(s，5a-C)，101.8(s，6-C)，163.4(s，7-C)， 107.2(s，8-C)，159.1(s，9-C)，105.3(s，9a-C)，59.8(s，9b-C)，17.3(q，10-C)，202.4(s，ll- 〇,27.4(9，12-〇,201.0(3，13-〇,31.2(9，14-〇,7.2(9，15-〇,51.3(9,016)。化合物（1) 的分子量與核磁共振氨譜與碳譜數據與松蘿酸很相似，說明該化合物為二苯并巧喃類化合 物。化合物1比松蘿酸多了一個甲氧基(SC 51.4，δΗ 3.56，s 3H)，一個A的亞甲基(SC 37.9， δΗ 3.17d，J=18.0，SH 3.31(1，1=18.0)，但少了一個苯環叔碳及對應氨質子信號(6〔98.2， δΗ 5.98，s 1H)，說明化合物1的4a位被甲氧基取代，而4號位為亞甲基，化合物（1)的iH NMR 及i3C NMR與文獻中（-)-mycousnine的數據一致，因此將化合物（1)鑒定為(-)mycousnine， 中文名球腔菌素。
[0041 ] 實施例化合物(2)球腔締胺(-)mycousunine amide的獲得和命名
[0042] 1、化合物(2)是化合物(1)通過氨化反應得到的，具體如下：
[0043] 取上述純品化合物（1)共200mg，置于Ξ頸瓶中，放置于冰鹽浴中至0°C，通氨氣反 應30分鐘，將樣品濃縮至干。將反應前后產物進行硅膠薄層層析對比，發現反應在Rf值為 〇.4(展開劑為石油酸:氯仿：甲醇3:3:1)產生一個新化合物，7克用適量甲醇溶解，加14g娃 膠拌樣，旋轉蒸發儀蒸干。采用200-300目硅膠柱層析分離，洗脫劑為石油酸:氯仿：甲醇= 18:4:1，進行分離獲得新化合物150mg，記為化合物(2)。
[0044] 2、化合物（2)球腔締胺（-)mycousunine amide的鑒定：
[0045] 化合物（2)為化合物（1)的氨化反應產物，其結構式見圖2,黃色針晶，旋光度： [a]ff -136。（c = 0.1，MeCN)mp HRESIMS m/z :376.1399[M+H] + (calcd for C19H21O7N 376.1399)。比化合物（1)的分子量少了 1。IH NMR(500MHz，CDCI3)，13C NMR( 125MHz，CDCI3) 見表1。通過比較化合物（1)與（2)的1h及1化NMR數據，確定其結構為（-)mycousnine amide。 為了進一步驗證其結構及絕對構型，對化合物(2)進行X-ray分析。最終確證化合物(2)的絕 對構型為（4日1?，965,6)-6-日。6154-2-(1-日111；[]1〇61:11711(16]16)-7,9-(1比7化〇巧-4日-11161:11〇巧- 8,9b-dimethyl-4,4a-d;?hy化odibenzo[b，d]furan-l，3(2H，9地）-dione，圖3為化合物（2) 的絕對構型。
[0046] 表 1 化合物2的 1化 NMR與 1h NMR數據(CDCl3，Sppm;Hz)
[0049] 實施例Ξ:新化合物球腔締胺的制備方法[0050] 通過W下方法實現：
[0047]
[004引
[0化1 ] 1)制備Z化Q129發酵液:將直徑為ο. 5厘米的ZJLQ129菌餅共10個接入500ml PDB中 于25 °C，200轉搖床上培養10天得到菌絲液，菌絲液在無菌條件下粉碎;在500ml PDB接入菌 絲液25ml，室溫下靜置培養2周后過濾分別獲得發酵液與菌絲體。
[0052] 2)制備球腔菌素:發酵液用乙酸乙醋萃3次后萃取液濃縮得浸膏A，重1.72g，菌絲 體用丙酬浸泡過夜后濃縮至小體積，獲得浸膏B，重1.76g;合并二部分得浸膏C，重3.5g;取 浸膏C 3.5g加15g硅膠拌樣，旋轉蒸發儀蒸干，200-300硅膠950克干法裝柱，將拌樣后的樣 品上樣后進行柱層析分離，依次用石油酸：乙酸乙醋體積比4:1，石油酸：乙酸乙醋體積比3: 2,石油酸：乙酸乙醋體積比3:7,乙酸乙醋：甲醇體積比4:1分別進行梯度洗脫分離，硅膠薄 層層析和茵香醒顯色劑顯色，合并Rf值為0.46且茵香醒顯色為藍色的組分;該組分1.70g用 凝膠柱層析分離純化，W氯仿：甲醇體積比1:1為洗脫劑洗脫分離，硅膠薄層層析和茵香醒 顯色劑顯色，獲得球腔菌素純品300mg。
[0053] 3)制備球腔締胺:取純品球腔菌素200mg，于Ξ頸瓶中，冰鹽浴中至0°C，通入氨氣 反應30分鐘，樣品濃縮至干，取濃縮后的樣品7克用甲醇溶解，加14g硅膠拌樣上柱，加入洗 脫劑為石油酸:氯仿：甲醇=18:4:1，200-300目硅膠柱層析分離，獲得新化合物球腔締胺 150mg。
[0054] 實施例四：化合物(2)球腔締胺(-)mycousunine amide的免疫抑制活性測定：
[0化日]實驗方法如下：
[0056] 1、供試品化合物（2) (-)mycousnine enamine配制：化合物（2) (-)mycousnine enamine純度>99%。化合物（2)先WDMS0溶解為50mM濃度，-20°C冷凍保存。臨用前再采用 RPMI1640細胞培養液稀釋至相應濃度。稀釋液中DMS0的含量^ 0.2 %，對細胞的生物活性沒 有影響。
[0057] 2、細胞株和實驗動物來源:PANC-1和A549細胞購自中國科學院上海細胞庫。培養 于含10%滅活胎牛血清，10011]/1111^青霉素、1004肖/1111^鏈霉素的0161培養基（011化6(3(3〇'8 modified eagle medium)中；放置于37°C，5%C02的細胞培養箱中培養。待細胞生長80% W 上融合程度時，用0.25 %膜酶消化傳代。雌性SPF級巧7BL/6小鼠，6周齡，18-22g，購于上海 西普爾-必凱實驗動物有限公司，實驗動物購得后飼養一周，適應環境后再進行實驗。實驗 動物的處理程序按照浙江省醫學科學院實驗動物福利倫理委員會的規定執行。
[005引3、單個脾細胞懸液制備：小鼠無菌取脾，研磨后，加適量化nk's液混懸，W40皿孔 間細胞濾網濾過，150化pm離屯、5分鐘，棄上清，力陽ank ' S液重復洗涂2次。收集脾細胞，加 RPMI1640完全培養液混懸制成單個脾細胞懸液。W0.4 %臺酪藍拒染法記數，活細胞數不少 于95%。
[0059] 4、Con A誘導的T細胞增殖和LPS誘導的B細胞增殖實驗測定：于96孔平底培養板 中，每孔加100化脾細胞懸液(5X10 6cell/ml)，并加入50μ1 Con A溶液(2μg/ml)或WS溶 液(2μg/ml)，最后加入不同濃度(0、2、10、50、250nM)供試藥物的稀釋液50μ1，每個濃度重復 4孔，另設正常細胞對照孔。37°C，5 %C〇2培養44小時后，各孔加入ΜΤΤ溶液(2mg/ml)50μ1，繼 續培養4h。離屯、（1800巧m，5min)，棄去各孔上清，分別加酸性DMS0溶液(4%lmol/lHCl)150y 1，避光振蕩15min，測定0D490nm，W絲裂原作用孔(藥物濃度0)的增殖率計為100%，計算藥 物作用后的相對細胞增殖率。MTT是一種粉末狀化學試劑，全稱為3-(4,5)- dimethylthiahiazo(-z-yl )-3,5-di-phenytetrazoliumromide，漢語化學名為 3-(4,5-二 甲基嚷挫-2) -2，5-二苯基四氮挫漠鹽，商品名：嚷挫藍，是一種黃顏色的染料。MTT法的檢測 原理為活細胞線粒體中的班巧酸脫氨酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍紫色結晶甲瑣 巧ormazan)并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。二甲基亞諷(DMSO)能溶解細胞中的甲瑣， 用酶標儀在490nm波長處測定其光吸收值，在一定細胞數范圍內，MTT結晶形成的量與細胞 數成正比。根據測得的吸光度值(0D值），來判斷活細胞增殖數量，0D值越大，細胞活性越強， 增值率越高。
[0060] 5、PANC-1和A549細胞增殖實驗測定:取對數生長期的細胞，調整濃度至1 X 105個/ mL，接種于96孔細胞培養板中10化17孔。培養24小時后，加入ZJLQ129稀釋液至總體積為200 化，繼續培養48小時后，采用上述MTT法測定細胞增殖率。
[0061] 6、細胞毒性測定：于96孔平底培養板中，每孔加1(Κ)化脾細胞懸液(5X10 6cell/ ml),并加入50μ1不同濃度供試藥物的稀釋液，再加入RPMI1640培養液50μ1，復4孔，37°C， 5 % C02培養48小時，按前述MTT法測定細胞存活率。
[0062] 7、CD3 + T細胞比例測定：于24孔平底培養板中，每孔加1ml脾細胞懸液（5X10 6cell/ml)，并加入Con A溶液(2μg/ml)和不同濃度的供試藥物溶液各0.5ml，各濃度復3孔。 置37°C，5%C02分別培養24小時和48小時后，收集細胞，WFITC-anti-CD3標記。PBS洗涂去 除未結合的巧光抗體，置流式細胞儀測定巧光標記細胞的比例。
[0063] 8、細胞因子的生產測定：于24孔平底培養板中，每孔加1ml脾細胞懸液（5 X 106cell/ml)，并加入Con A溶液(2μg/ml)和不同濃度的供試藥物溶液各0.5ml，各濃度復3 孔。置37°C，5%C〇2培養24和48小時后，收集培養上清液，按化ISA試劑盒檢測細胞因子IL-2 和IFN-丫的含量。
[0064] 上述實驗結果表明：
[0065] 觀察化合物(2)對Con A誘導T細胞增殖的影響。結果如圖4A所示，與CsA-樣，化合 物(2)在極低濃度(2nM)即能顯著抑制T細胞的增殖，在aiM濃度下球腔締胺(-)mycousunine amide對刀豆蛋白A(Con A)誘導的T細胞增殖的免疫抑制率為32.4±6.2%。在受試濃度范 圍內（2~250nM)呈較好的濃度依賴關系。化合物（2)的半數有效濃度化巧0)為26.97 ± 6.00碰，〔34的6〔50為18.27±4.60碰。但在該濃度范圍內，化合物(2)和034對1?5誘導的6細 胞增殖卻沒有任何影響（圖4B)。甚至在提高濃度100倍W后(25μΜ)，化合物(2)對人膜腺癌 細胞PANC-1和肺癌細胞Α549的增殖均沒有任何影響（圖4C)。
[0066] 化合物(2)對脾細胞的細胞毒性測定表明（圖5C)，化合物(2)在6.25μΜ時開始表現 微弱的細胞毒性(細胞存活抑制率為8.5%)，半數毒性濃度(雌〇)為120.37±17.9741斯八 在6.25μΜ時細胞存活抑制率為43.7%，TC5Q為16.17±4.80μΜ。根據上述獲得的ECsq值，依次 設定3、30、300ηΜΞ個濃度，對T細胞的特定表面抗原CD3分子進行FITC標記，采用流式細胞 技術進一步觀察化合物(2)對Τ細胞增殖的影響。結果顯示（圖5Α、Β):化合物(2)能明顯抑制 Con A引起的脾細胞中Τ細胞比例的增加，并呈現較好的濃度依賴關系和時間依賴關系。
[0067] 化-2和IFN-丫是T細胞活化產生的主要細胞因子，也是T細胞活化的主要標志。進 一步測定比-2和IFN-丫的細胞分泌情況發現，化合物2在3nMW上即能濃度依賴性地顯著降 低Con A引起的IL-巧PIFN-丫分泌。
[0068] W上結果充分表明：化合物2在極低濃度即能選擇性地抑制T細胞增殖和活化，其 活性并非其細胞毒性引起。雖然抑制T細胞增殖的作用強度不如CsA，但細胞毒性明顯弱于 CsAdZ化Q129的治療指數（Therapeutic index,ΤΙ,TCso/ECso)(4463.5)遠大于CsA(885.0)。 因此，化合物2具有高效、低毒、高選擇性的特征，具有較好的研究開發前景。
[0069]最后，還需要注意的是，W上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。顯然，本發 明不限于W上實施例，還可W有許多變形。本領域的普通技術人員能從本發明公開的內容 直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種新化合物球腔烯胺的制備方法，其特征是:包括以下步驟： 1) 制備ZJLQ129發酵液:將直徑為0.5厘米的ZJLQ129菌餅共10個接入500ml PDB中于25 °C，200轉搖床上培養10天得到菌絲液，菌絲液在無菌條件下粉碎;在500ml PDB接入菌絲液 25ml，室溫下靜置培養2周后過濾分別獲得發酵液與菌絲體。 2) 制備球腔菌素:發酵液用乙酸乙酯萃3次后萃取液濃縮得浸膏A，重1.72g，菌絲體用 丙酮浸泡過夜后濃縮至小體積，獲得浸膏B，重1.76g;合并二部分得浸膏C，重3.5g;取浸膏C 3.5g加15g硅膠拌樣，旋轉蒸發儀蒸干，200-300硅膠950克干法裝柱，將拌樣后的樣品上樣 后進行柱層析分離，依次用石油醚：乙酸乙酯體積比4:1，石油醚：乙酸乙酯體積比3:2,石油 醚：乙酸乙酯體積比3:7,乙酸乙酯：甲醇體積比4:1分別進行梯度洗脫分離，硅膠薄層層析 和茴香醛顯色劑顯色，合并Rf值為0.46且茴香醛顯色為藍色的組分;該組分1.70g用凝膠柱 層析分離純化，以氯仿：甲醇體積比1:1為洗脫劑洗脫分離，硅膠薄層層析和茴香醛顯色劑 顯色，獲得球腔菌素純品300mg。 3) 制備球腔烯胺：取純品球腔菌素200mg，于三頸瓶中，冰鹽浴中至0°C，通入氨氣反應 30分鐘，樣品濃縮至干，取濃縮后的樣品7克用甲醇溶解，加14g硅膠拌樣上柱，加入洗脫劑 為石油醚:氯仿：甲醇=18:4:1，200-300目硅膠柱層析分離，獲得新化合物球腔烯胺150mg。2. 根據權利要求1所述的新化合物球腔烯胺的制備方法，其特征是:所述的球腔烯胺具 有免疫抑制活性。3. 根據權利要求2所述的新化合物球腔烯胺的制備方法，其特征是:所述的球腔烯胺在 2nM濃度下對刀豆蛋白A誘導的T細胞增殖的免疫抑制率為32.4±6.2%。4. 根據權利要求2所述的新化合物球腔烯胺的制備方法，其特征是:所述的球腔菌素具 有免疫抑制活性。5. 根據權利要求4所述的新化合物球腔烯胺的制備方法，其特征是:所述的球腔菌素在 ΙΟμΜ濃度下的免疫抑制率為51.28%。
【文檔編號】C12R1/01GK106011193SQ201610348903
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月23日
【發明人】章初龍, 林福呈, 馮曉曉, 王麗薇, 王國平
【申請人】浙江大學