一種通用型慢病毒載體及其制備方法
【專利摘要】一種通用型慢病毒載體及其制備方法，涉及一種慢病毒載體及其其制備方法。本發明是要解決目前CAR?T制備中過程中載體構建步驟煩瑣、耗時過長，慢病毒載體無法通用，成本高的問題。該慢病毒載體以pCDH?CMV?MCS?EF1?Puro質粒為骨架，向質粒骨架的多克隆位點MCS處插入以下元件：CD8α Leader DNA序列、CD8α鉸鏈區、CD28跨膜區?胞內區、CD137胞內區和CD3ζ。方法：一、引物設計；二、外周血單個核細胞的獲得、激活；三、mRNA的提取及RT反應；四、重組質粒制備；五、合成單鏈CD8α Leader DNA序列；六、將線性載體、目的基因片段及CD8α Leader片段連接，即得到通用型慢病毒載體。本發明用于制備慢病毒載體。
【專利說明】
-種通用型慢病毒載體及其制備方法
技術領域
[0001 ]本發明設及一種慢病毒載體及其其制備方法。
【背景技術】
[0002] T淋己細胞是腫瘤細胞的天敵，在腫瘤免疫應答中起主要作用，對腫瘤細胞有極強 的殺傷作用。但是，使用內源性T細胞進行腫瘤免疫治療時，祀抗原需經過加工處理后才能 和祀細胞表面的主要組織相容性復合物(main histocompatibility complex,MHC)作用， 也就是存在我們常說的"ΜΗ邱良制性"。然而，腫瘤免疫編輯的過程會使MHC在腫瘤細胞表面 表達下降，破壞抗原加工過程，降低膚段免疫原性。運樣長期形成的免疫逃逸機制，能使腫 瘤細胞成功躲避T細胞攻擊，腫瘤快速增殖。
[0003] 過繼性細胞免疫治療(adoptive cellular immunotherapy, ACI)是目前較為有效 的惡性腫瘤的治療方法之一。隨著技術的日趨成熟，已在多種實體瘤和血液腫瘤的臨床治 療中取得較好療效。其中，嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor,CAR)T細胞技術是 近年來發展非常迅速的一種細胞治療技術。通過基因改造技術，效應Τ細胞的祀向性、殺傷 活性和持久性均較常規應用的免疫細胞高，并可克服腫瘤局部免疫抑制微環境和打破宿主 免疫耐受狀態。
[0004] 目前，大多數嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor，CAR)由胞外抗原結合 區（由來源于單克隆抗體的輕鏈(VL)和重鏈(VH)組成，中間由帶初性的較鏈區連接形成單 鏈抗體（single chain fragment variable,scFv)、跨膜區域和胞內信號轉導區組成。CAR 的信號域已從第一代的單一信號分子發展為包含CD28、4-1BB等共刺激分子的多信號結構 域(第二、Ξ代），其可W提高T細胞的細胞毒性、增殖活性，維持T細胞應答，延長T細胞存活 時間等;雙特異性嵌合抗原受體(tan-CAR)有兩種抗原識別區，它們連接在同一個信號轉導 受體上，可W同時作用于腫瘤微環境中的腫瘤細胞和元件，從而增強T細胞活性，增加親和 力。
[0005] 慢病毒化entivirus)載體是WHIV-1(人類免疫缺陷I型病毒)為基礎發展起來的 基因治療載體。它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，可用于感染難轉染的細胞，如 原代細胞、神經元細胞、干細胞、不分化細胞、屯、肌細胞、血液細胞等，且可裝載高達化bDNA 片段，使目的基因進入到宿主細胞之后，經過反轉錄，整合到基因組，形成穩定遺傳物質，使 得目的基因在細胞中可穩定長期表達。病毒載體顆粒通過包裝元件和含病毒基因組質粒共 轉染包裝細胞系，目前比較廣泛采用的第Ξ代包裝系統--四質粒系統只含有HIV-1共9個基 因中的3個，即gag、pol、rev。由于HIV-1基因組成分中60%被去除，因此父代病毒無法復制， 是目前重組系數最低的一個慢病毒包裝系統，至今未見重組報道。
[0006] 目前，CAR-T研究及應用中廣泛使用慢病毒作為CAR基因載體，大多數嵌合抗原受 體(CAR)由胞外抗原結合區（scFv)、跨膜區域和胞內信號轉導區組成，也有一些研究將胞外 抗原結合區設計為具有雙特異性的單鏈雙特異性抗體(scBsAb)，且胞外抗原結合區前需加 一條具有分泌功能的信號序列，W保證CAR基因所對應的蛋白序列能夠具有分泌功能，由于 不同種類的癌癥具有不同腫瘤相關抗原（tumor-associated antigen,ΤΑΑ)和腫瘤特異性 抗原(tumor specific antigenJSA)，所W每種CAR需加入不同的抗體序列，每種腫瘤都進 行CAR基因整體克隆成本相對較高，且載體構建時間會相對延長，因此構建出通用型載體是 非常必要的。
【發明內容】
[0007]本發明是要解決目前CAR-T制備中過程中載體構建步驟煩瑣、耗時過長，慢病毒載 體無法通用，成本高的問題，提供一種通用型慢病毒載體、其制備方法及應用。
[000引本發明通用型慢病毒載體WpCDH-CMV-MCS-EFl-Puro質粒為骨架，向質粒骨架的 多克隆位點MCS處插入W下元件:CD8化eader DNA序列、CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、 CD137胞內區和CD3C;其中CDSaLeader DNA序列如序列表中SEQ ID N0:1所示，CD8a較鏈區 如序列表中569 10^:2所示，〔028跨膜區-胞內區如序列表中569 10^):3所示，〔0137胞 內區如序列表中SEQ ID N0:4所示，CD3C如序列表中SEQ ID N0:5所示。
[0009] pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 質粒為購買得到，編號為 CD510B-1。
[0010] 本發明通用型慢病毒載體的制備方法，選擇的基因為人CD8a引導鏈序列、CD8a較 鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C，具體構建步驟如下：
[00川一、引物設計：
[0012] 設計CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C的上游引物和下游引 物，分別命名為：CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3CF/CD3CR。
[0013] 引物具體要求為：
[0014] a.CDSa較鏈區上游引物添加 EcoR I酶切位點，CD3C下游添加 Not I酶切位點；
[0015] b.CDSa較鏈區下游引物與CD28跨膜區-胞內區上游引物應有一部分可W互補結合 的重疊序列；
[0016] C.CD28跨膜區-胞內區下游引物與CD137胞內區上游引物應有一部分可W互補結 合的重疊序列；
[0017] d.CD137胞內區下游引物與CD3C上游引物應有一部分可W互補結合的重疊序列。 [001引引物序列如下：
[0019] CD8aF:5 '-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3'
[0020] CD8aR:5 '-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3，
[0021] CD28F:5 '-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3，
[00。] CD28R:5 '-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3，
[OOU ] CD137F:5 '-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3，
[0024] CD137R:5 '-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3'
[002引 CD化F:5 '-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3，
[0026] CD化R:5 '-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3，
[0027] 二、外周血單個核細胞的獲得、激活：
[00%] a.用肝素鋼抗凝管采集成人外周血10ml，緩慢將其加入到事先分裝好的Ficoll溶 液中（體積比約為2:1)，2000巧m離屯、20min;
[0029] b.移液管緩慢吸去上層血漿后，收取白膜層細胞PBMC，10ml生理鹽水，150化pm離 屯、5min，重復洗涂一次并計數；
[0030] C.將PBMC用含 10%FBS、1000IU/ml 化-2的RPMI1640培養基重懸并稀釋至 1X10*V ml-1.5 X lOVml，取2ml稀釋液加入至事先用包被液包被好的6孔板中（所述包被液為0.5ml PBS，其中含有化g/ml 0KT3、2000U/mlIFN- 丫和lOOOU/ml比-化），刺激20-2化。
[0031] S、mRNA的提取及RT反應：
[0032] 取步驟二激活后的PBMC 150化pm離屯、5min后棄上清，用1ml預冷的化izol冰上裂 解細胞，抽提RNA，并進行反轉錄成cDNA。
[0033] 四、WcDNA為模板，用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3CF/ CD3鄒分別進行PCR擴增，獲得CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C基因， 膠回收純化后依次進行重疊延伸PCR(overlap extension PCR)W獲得含CD8a較鏈區、CD28 跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C基因的拼接基因序列，將得到的拼接基因進行純化與 PMD19-T simple載體進行連接，并將連接產物轉化大腸桿菌D冊α感受態細胞，經擴增后提 取質粒進行基因測序，測序正確的質粒命名為CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple,進 行保存備用。
[0034] 五、在CD8a信號膚基因上游添加 kozak序列W增加目的基因的表達量，同時在 kozak序列前加入Nhe I酶切位點，在CD8a信號膚基因下游依次加入BamH I和EcoRI酶切位 點，合成得到單鏈CDSaLeader DNA序列；
[0035] 六、用限制性內切酶Nhe巧日Not I對pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro載體進行雙酶切， 1 %瓊脂糖凝膠回收線性載體；
[0036] 用限制性內切酶EcoR巧日Not I對質粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple進 行雙酶切，膠回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段；
[0037] 將步驟五合成的單鏈CDSaLeader DNA序列進行退火形成雙鏈，退火條件為95°C 5min、62°C10min，退火緩沖液為annealing bufferdOmM t;ris,50mM 化抓TA)，退 火后進行純化，得到CDSaLeader雙鏈DM序列，兩端分別為含粘性末端的化e巧蛇coRI的酶 切位點。
[0038] 屯、將步驟六獲得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 線性載體、CD8 地 inge-CD28-CD137- CD3C片段及CDSaLeader片段利用T4DNA連接酶進行Ξ段式連接，載體與片段的摩爾比為1: (3-10)，D8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段與CDSaLeader片段的摩爾比為1:1，經鑒定正確后 4°C保存備用，即得到用于表達嵌合抗原受體及雙特異性嵌合抗原受體的通用型慢病毒載 體。
[0039] 本發明的有益效果：
[0040] 本發明成功制備CD8a信號膚、CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及 CD3C胞內區基因，并通過overlapPCR的方法將其進行拼接，拼接后的基因連入慢病毒表達 載體。該載體加入運些嵌合抗原受體(CAR)所需元件后，針對不同腫瘤類型只需在此基礎上 克隆不同抗原的抗體序列并插入其中即可獲得嵌合抗原受體(CAR)。
[0041] 1.本發明是將設計好的基因插入到慢病毒表達載體中，利用293T細胞在輔助質粒 的作用下，進行慢病毒顆粒的包裝，基因插入后未影響載體的復制，且慢病毒依然可W正常 包裝。
[0042] 2.本發明所包裝的慢病毒在M0I值為300時可W成功感染T淋己細胞，并且目的基 因可W在τ細胞中穩定的表達。
[0043] 3.本發明所制備的通用性載體可W通過BamH I和EcoRI酶切位點及其相應的同尾 酶進行多種單鏈抗體序列（ScFv)和雙特異性抗體序列(Bi sFv)的連接，從而構建出多種特 異性CAR及化n-CAR。
[0044] 4、啟動子為CMV啟動子，是公認的啟動真核基因表達的最有力量的啟動子，被廣泛 應用于構建高效真核表達載體，用于基因工程、基因治療和DNA免疫。
[0045] 5、載體上引入的化ro抗性基因可W使感染的細胞具有嚷嶺霉素抗性，而陰性細胞 貝阿被嚷嶺霉素殺死，從而實現了感染后陽性CAR-T細胞的篩選，此篩選方法快速、安全、利 于應用。
[0046] 6、載體本身所含有的5/LTR和^LTR可W使目的基因整合到宿主細胞的基因組內， 跟隨宿主細胞的基因復制而進行復制，從而實現目的基因的穩定表達。
【附圖說明】
[0047] 圖1為實施例1中制備好的最終質粒中目的基因 PCR鑒定結果；
[0048] 圖2為實施例1中感染后的T細胞中目的基因表達情況檢測。
【具體實施方式】
[0049] 本發明技術方案不局限于W下所列舉【具體實施方式】，還包括各【具體實施方式】間的 任意組合。
[0050]
【具體實施方式】一:本實施方式通用型慢病毒載體WpCDH-CMV-MCS-EFl-Puro質粒 為骨架，向質粒骨架的多克隆位點MCS處插入W下元件:CDSaLeader DNA序列、CD8a較鏈區、 CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區和CD3C;其中CDSaLeader DNA序列如序列表中SEQ ID N0:1所示，CD8a較鏈區如序列表中SEQ ID N0:2所示，CD28跨膜區-胞內區如序列表中SEQ ID N0:3所示，CD137胞內區如序列表中沈Q ID N0:4所示，CD3C如序列表中沈Q ID N0:5所 /J、- 〇
[0051] 本實施方式構建含信號序列、胞外較鏈區、膜結合區和胞內信號轉導區，胞內信號 轉導區含有CD3C序列和共刺激分子信號序列（costimulato巧molecule,CM)序列，將它們 同時連接到pCDH_Vector的MCS，構建出可W連接不同抗體序列，且具有分泌表達功能的通 用型載體，方便了多種CAR及化n-CAR的研究及應用。
【具體實施方式】 [0052] 二:本實施方式通用型慢病毒載體的制備方法，具體步驟如下：
[005；3] -、引物設計：
[0054] 設計CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C的上游引物和下游引 物，分別命名為：CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3CF/CD3CR;
[0055] 二、外周血單個核細胞的獲得、激活：
[0056] 采集成人外周血，提取外周血單個核細胞，將外周血單個核細胞(PBMC)用含10% FBS和lOOOIU/ml比-2的RPMI1640培養基重懸并稀釋至1 X 106/πα-1.5 X lOVml，取2ml稀釋 液加入至事先用包被液包被好的6孔板中，刺激20-2化。
[0化7] S、mRNA的提取及RT反應：
[0058]提取步驟二激活后的PBMC的RNA，并進行反轉錄成cDNA;
[0059]四、WcDNA為模板，用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3CF/ CD3鄒分別進行PCR擴增，獲得CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C基因， 膠回收純化后依次進行重疊延伸PCRW獲得含CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內 區及CD3C基因的拼接基因序列，將得到的拼接基因進行純化與PMD19-T simple載體進行連 接，并將連接產物轉化大腸桿菌D冊α感受態細胞，經擴增后提取質粒進行基因測序，測序正 確的質粒命名為CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-Tsimple，進行保存備用；
[0060] 五、在CD8a信號膚基因上游添加 kozak序列W增加目的基因的表達量，同時在 kozak序列前加入Nhe I酶切位點，在CD8a信號膚基因下游依次加入BamH I和EcoRI酶切位 點，合成得到單鏈CDSaLeader DNA序列；
[0061 ] 六、用限制性內切酶Nhe巧日Not I對pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro載體進行雙酶切， 1 %瓊脂糖凝膠回收線性載體；
[0062] 用限制性內切酶EcoR 巧日Not I對質粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple進 行雙酶切，膠回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段；
[0063] 將步驟五合成的單鏈CDSaLeader DNA序列進行退火形成雙鏈，退火后進行純化， 得到CDSaLeader雙鏈DNA序列；
[0064] 屯、將步驟六獲得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 線性載體、CD8 地 inge-CD28-CD137- CD3C片段及CDSaLeader片段利用T4DNA連接酶進行Ξ段式連接，經鑒定正確后4°C保存備 用，即得到用于表達嵌合抗原受體及雙特異性嵌合抗原受體的通用型慢病毒載體。
【具體實施方式】 [0065] Ξ:本實施方式與二不同的是:步驟一中引物CD8aF序 列為：5 ' - CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3 '，引物CD8aF序列為：5'- ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3'。其它與二相同。
【具體實施方式】 [0066] 四：本實施方式與二或Ξ不同的是：步驟一中引物 CD28F序列為：5'-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3' ;引物CD28R序列為：5'- CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3'。其它與二或Ξ相同。
【具體實施方式】 [0067] 五:本實施方式與二至四之一不同的是：步驟一中引 物CD137F序列為：5'-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3' ；引物CD137R序列為： 5 ' -GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3 '。其它與二至四之一相 同。
【具體實施方式】 [0068] 六:本實施方式與二至五之一不同的是：步驟一中引 物CD化F序列為：5 ' -GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3 ' ；引物CD化R序列為： 5' -ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3'。其它與二至五之一相同。
【具體實施方式】 [0069] 屯:本實施方式與二至六之一不同的是：步驟二所述 包被液為含有化g/ml 0KT3、2000U/mlIFN-丫和lOOOU/ml比-化的PBS緩沖液。其它與具體實 施方式二至六之一相同。
【具體實施方式】 [0070] 八:本實施方式與二至屯之一不同的是：步驟二所述 提取外周血單個核細胞的方法具體為：
[0071 ] a.將10ml成人外周血加入到事先分裝好的Ficoll溶液中，200化pm離屯、20min;其 中外周血與Ficoll溶液的體積比為2:1;
[0072] b .移液管吸去上層血漿后，收取白膜層細胞PBMC，10ml生理鹽水，150化pm離屯、 5min，重復洗涂一次并計數。其它與【具體實施方式】二至屯之一相同。
【具體實施方式】 [0073] 九:本實施方式與二至八之一不同的是：步驟六所述 退火條件為95°C5miη、62°C lOmin，退火緩沖液為annealing buffer(lOmM tris , 50mM Nacl，ImM邸TA)。其它與二至八之一相同。
【具體實施方式】 [0074] 十:本實施方式與二至九之一不同的是：步驟屯中載 體與片段的摩爾比為1: (3-10)，所述片段為CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段和CD8a Leader片段的混合物，其中D8地inge-CD28-CD137-CD3C片段與CDSaLeader片段的摩爾比為 1:1。其它與二至九之一相同。
[0075] 為驗證本發明的有益效果，進行W下試驗：
[0076] 實施例1:
[0077] 本實施例通用型慢病毒載體的制備方法，選擇的基因為人CD8a引導鏈序列、CD8a 較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C，具體構建步驟如下：
[007引一、引物設計：
[0079] 設計CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C的上游引物和下游引 物，分別命名為：CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3CF/CD3CR。
[0080] 引物具體要求為：
[0081 ] a.CDSa較鏈區上游引物添加 EcoR I酶切位點，CD3C下游添加 Not I酶切位點；
[0082] b.CDSa較鏈區下游引物與CD28跨膜區-胞內區上游引物應有一部分可W互補結合 的重疊序列；
[0083] C.CD28跨膜區-胞內區下游引物與CD137胞內區上游引物應有一部分可W互補結 合的重疊序列；
[0084] d.CD137胞內區下游引物與CD3C上游引物應有一部分可W互補結合的重疊序列。 [00化]引物序列如下：
[00 化]CD8aF:5 '-CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3'
[0087] CD8aR:5 '-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3，
[0088] CD28F:5，-GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3，
[0089] CD28R:5 '-CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3，
[0090] CD137F:5 '-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3，
[0091] CD137R:5 '-GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3 '
[009。 CD化F:5 '-GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3，
[00巧]CD化R:5 '-ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3，
[0094] 二、外周血單個核細胞的獲得、激活：
[0095] a.用肝素鋼抗凝管采集成人外周血10ml，緩慢將其加入到事先分裝好的Ficoll溶 液中（體積比為2:1) ,2000巧m離屯、20min;
[0096] b.移液管緩慢吸去上層血漿后，收取白膜層細胞PBMC，10ml生理鹽水，150化pm離 屯、5min，重復洗涂一次并計數；
[0097] C.將PBMC用含 10%FBS、1000IU/ml 化-2的RPMI1640培養基重懸并稀釋至 1X10*V ml-1.5 X lOVml，取2ml稀釋液加入至事先用包被液包被好的6孔板中（所述包被液為0.5ml PBS，其中含有化g/ml 0KT3、2000U/mlIFN- 丫和lOOOU/ml比-化），刺激20-2化。
[0098] S、mRNA的提取及RT反應：
[0099] 取步驟二激活后的PBMC 150化pm離屯、5min后棄上清，用1ml預冷的化izol冰上裂 解細胞，抽提RNA，并進行反轉錄成cDNA。
[0100] 四、WcDNA為模板，用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3CF/ CD3鄒分別進行PCR擴增，獲得CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C基因， 膠回收純化后依次進行重疊延伸PCR(overlap extension PCR)W獲得含CD8a較鏈區、CD28 跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C基因的拼接基因序列，將得到的拼接基因進行純化與 PMD19-T simple載體進行連接，并將連接產物轉化大腸桿菌D冊α感受態細胞，經擴增后提 取質粒進行基因測序，測序正確的質粒命名為CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple,進 行保存備用。
[0101] 1、利用〔08〇。/〔08〇3、〔028。/〔0281?、〔0137。/〔01371?、〔03巧/〔03鄒引物，^?81〔3 cDNA為模板，分別PCR擴增CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及CD3C胞內區基 因，其PCR擴增體系為： PBMC cDNA 2 μΙ_. I 〇χPC民 buffer 2 μL^ lOir.M dNTP 1 μL^
[0102] ΙΟμιη i：游引物 1 ]iL Ι Ομιη下游引物 1睞 Extaq 酶 0.2 μL., d(JH2〇 12.8 μι.
[0103] PCR 擴增條件為：95。[5111111，95。[4536。，60。[306。3,72。[3036。，35個循環，72。[ 7min0
[0104] 2、0ver-lap PC則尋CD8a較鏈區基因與CD28跨膜區-胞內區基因融合：
[0105] 將PCR反應獲得的CD8a較鏈區基因與CD28跨膜區-胞內區基因片段進行2%的瓊脂 糖凝膠分析并純化回收后進行基因融合，體系如下： 10XPCR buffer 5 μΙ> lOmM clNTP 5 μL CD8a較鏈區基因 3.3 yL (50唯） CD28跨膜區-胞內區基因 2.7yL (50ng)
[0106] lOpmCDSaF 引物 2 陣 10,LimCD28民引物 2 故Taq 酶 0.5 加 Η?0 29.5 μL
[0107]混勻后進行 PCR 擴增。循環參數為：95°C7min，95°C45sec，60°C30ecs，72°C45sec， 15個循環，72°C7min。擴增結束后，將PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠分析并純化回收后與 CD137胞內區基因融合。
[010引3、CD8a較鏈區-CD28跨膜區-胞內區基因與CD137胞內區基因融合具體參數及反應 條件同步驟2。
[0109] 4、CD8a較鏈區-CD28跨膜區-胞內區-CD137胞內區基因與CD3C胞內區基因融合具 體參數及反應條件同步驟2。
[0110] 五、在CD8a信號膚基因上游添加 kozak序列W增加目的基因的表達量，同時在 kozak序列前加入化e I酶切位點，在CD8a信號膚基因下游依次加入BamH I和EcoR I酶切位 點，合成得到單鏈CDSaLeader DNA序列；
[0111] 六、用限制性內切酶Nhe巧日Not I對pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro載體進行雙酶切， 1 %瓊脂糖凝膠回收線性載體；
[0112] 用限制性內切酶EcoR 巧日Not I對質粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple進 行雙酶切，膠回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段；
[0113] 將步驟五合成的單鏈CDSaLeader DNA序列進行退火形成雙鏈，退火條件為95°C 5min、62°C10min，退火緩沖液為annealing bufferdOmM t;ris,50mM 化抓TA)，退 火后進行純化，得到CDSaLeader雙鏈DNA序列，兩端分別為含粘性末端的Nhe巧此coR I的 酶切位點。
[0114] 屯、將步驟六獲得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 線性載體、CD8 地 inge-CD28-CD137- CD3C片段及CDSaLeader片段利用T4DNA連接酶進行Ξ段式連接，載體與兩個片段的摩爾比 為1:6，D8地inge-CD28-CD137-CD3C片段與CDSaLeader片段的摩爾比為1:1，經鑒定正確后4 °(：保存備用，即得到用于表達嵌合抗原受體及雙特異性嵌合抗原受體的通用型慢病毒載 體。
[0115] 八、慢病毒的包裝及T淋己細胞的感染
[0116] 將密度為lX105cells/ml 2ml的293T細胞接種于6孔板，18-2地后用脂質體進行 轉染，轉染后48h收獲慢病毒，具體步驟為:a.約23加1化ti-MEM稀釋2.7ug pCDH-CMV-MCS- EFl-Puro-目的基因+ 1.76ug pMDL(Gal/Pol)+0.95ug pVSVG+0.68ug pREV至250ul; b.235ul Opti-MEM稀釋 15ul lipofectamine2000;c.5min后，將a、b步溶液混合，室溫靜止 30min; d.從6孔板中吸出1ml培養基，然后滴加入500ul質粒和脂質體混合物，6-1化后，移除 含有DNA-脂質體復合物的培養基，代之W正常培養液DMED+10%FBS(從此刻開始算時間）， 4化后收級含有慢病毒的培養上清；
[0117] 慢病毒濃縮及滴度測定:a.用0.45皿濾器過濾上清液于過濾杯中，將過濾杯插到 濾過液收集管中，4000 X g離屯、10-15min，將病毒濃縮液移出，分裝后，-80°C保存;b.取其中 一支進行病毒生物學滴度測定。具體操作為:將慢病毒依次10倍稀釋后加入到事先準備的 293T細胞中，感染4她后加入扣g/ml的puromycin，繼續培養2天，通過計算感染后的活細胞 數量來判斷滴度數值。
[011引 T淋己細胞的感染及目的基因的表達:a.取10ml-20ml外周血，用Ficol分離PBMC， 將PBMCWl-2X10シml的密度接種于T75培養瓶中，第0天加入2000IU/mL的IFN-r刺激，第l 天加入400ng/ml anti-CD3及4000IU/mL比-2使T細胞激活;b.激活培養2-3天后離屯、收集T 細胞，PBS洗涂兩次后用500-1000IU/mL化-2培養基稀釋到5*l0Vml，接種于6孔板，每孔 2ml; c.向Τ細胞中加入慢病毒，（MOI值為300)，用封口膜封好6孔板邊緣，900g離屯、化后，37 °C5%C02培養感染4小時，置換新鮮培液并繼續37Γ培養;d.收獲未感染的T細胞及感染后 培養4她、14d的T細胞，提取RNA進行表達情況檢測。
[0119] 圖1為制備好的最終質粒中目的基因 PCR鑒定結果；
[0120] 圖2為感染后的T細胞中目的基因表達情況檢測。其中Μ為Makera為未感染的T細 胞，2為感染后48h的T細胞，3為感染后14d的T細胞。
[0121] 圖2中可見，未感染的T細胞不能表達目的基因，感染4她后可W表達目的基因，說 明感染成功;感染14d后還可W檢測到目的基因的表達，說明基因可W整合至I"細胞基因組， 能夠穩定表達。
[0122] 本方法成功制備CD8a信號膚、CD8a較鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及 CD3C胞內區基因，并通過overlapPCR的方法將其進行拼接，拼接后的基因連入慢病毒表達 載體。該載體加入運些嵌合抗原受體(CAR)所需元件后，針對不同腫瘤類型只需在此基礎上 克隆不同抗原的抗體序列并插入其中即可獲得嵌合抗原受體。構建出可W連接不同抗體序 列，且具有分泌表達功能的通用型載體，方便了多種CAR及化n-CAR的研究及應用。
【主權項】
1. 一種通用型慢病毒載體，其特征在于該慢病毒載體以pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro質粒 為骨架，向質粒骨架的多克隆位點MCS處插入以下元件:⑶8aLeader DNA序列、⑶8α鉸鏈區、 CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區和0)3ζ;其中CD8aLeader DNA序列如序列表中SEQ ID N0:1所示，CD8a鉸鏈區如序列表中SEQ ID N0:2所示，CD28跨膜區-胞內區如序列表中SEQ ID N0:3所示，CD137胞內區如序列表中SEQ ID N0:4所示，0)3ζ如序列表中SEQ ID N0:5所 不。2. 如權利要求1所述的通用型慢病毒載體的制備方法，其特征在于該方法 具體步驟如下： 一、 引物設計： 設計⑶8a鉸鏈區、⑶28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及⑶3ζ的上游引物和下游引物，分 別命名為：CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD 137F/CD137R、CD3GF/CD3GR; 二、 外周血單個核細胞的獲得、激活： 采集成人外周血，提取外周血單個核細胞，將外周血單個核細胞用含10 %FBS和 1000IU/ml IL-2的RPMI1640培養基重懸并稀釋至1 X 106/ml-l. 5 X 106/ml，取2ml稀釋液加 入至事先用包被液包被好的6孔板中，刺激20-28h。 三、 mRNA的提取及RT反應： 提取步驟二激活后的PBMC的RNA，并進行反轉錄成cDNA; 四、 以cDNA為模板，用引物CD8aF/CD8aR、CD28F/CD28R、CD137F/CD137R和CD3GF/CD3GR 分別進行PCR擴增，獲得⑶8a鉸鏈區、⑶28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及⑶3ζ基因，膠回收 純化后依次進行重疊延伸PCR以獲得含⑶8α鉸鏈區、CD28跨膜區-胞內區、CD137胞內區及 ⑶3ζ基因的拼接基因序列，將得到的拼接基因進行純化與PMD19-T simple載體進行連接， 并將連接產物轉化大腸桿菌DH5a感受態細胞，經擴增后提取質粒進行基因測序，測序正確 的質粒命名為CD8aHinge-CD28-CD137-CD3G-Tsimple，進行保存備用； 五、 在⑶8a信號肽基因上游添加 kozak序列以增加目的基因的表達量，同時在kozak序 列前加入Nhe I酶切位點，在⑶8α信號肽基因下游依次加入BamH I和EcoR I酶切位點，合成 得到單鏈⑶8aLeader DNA序列； 六、 用限制性內切酶Nhe I和Not I對pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro載體進行雙酶切，1 %瓊 脂糖凝膠回收線性載體； 用限制性內切酶EcoR I和Not I對質粒CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C-T simple進行雙 酶切，膠回收CD8aHinge-CD28-CD137-CD3G 片段； 將步驟五合成的單鏈⑶SaLeader DNA序列進行退火形成雙鏈，退火后進行純化，得到 CD8aLeader 雙鏈 DNA 序列； 七、 將步驟六獲得的 pCDH-CMV-MCS-EFl-Puro 線性載體、CD8aHinge-CD28-CDl 37-〇)3ζ 片段及⑶SaLeader片段利用T4DNA連接酶進行三段式連接，經鑒定正確后4°C保存備用，即 得到用于表達嵌合抗原受體及雙特異性嵌合抗原受體的通用型慢病毒載體。3. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟一中引物CD8aF序列為：5'_ CCGGAATTCACCACGACGCCAGCGCCGC-3,，引物CD8aF序列為 i-ACCAGCACCCAAAAATCACAGGCGAAGTCCAGCCCCCT-3，。4. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟一中引物CD28F序列為：5'_ GACTTCGCCTGTGATTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGG-3 ' ；引物CD28R序列為：5 ' -CTTTCTGCCCCGTTTGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCGC-3 '。5. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟一中引物CD137F序列為：5'-GCAGCCTATCGCTCCAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCT-3 ' ；引物CD137R序列為：5 ' -GCTGAACTTCACTCTCAGTTCACATCCTCCTTCTTCTTC-3 '。6. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟一中引物CD3GF序列為：5'_ GGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAG-3 ' ；引物CD3GR序列為：5 ' -ATTTGCGGCCGCTTAGCGAGGGGGCAGGGCCT-3 ' 〇7. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟二所述包被液為含有lμg/mlOKT3、 2000U/mlIFN- γ 和 1000U/mlIL-la的PBS緩沖液。8. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟二所述提取外周血單個核細胞的 方法具體為： a. 將10ml成人外周血加入到事先分裝好的Ficoll溶液中，2000rpm離心20min;其中外 周血與Ficoll溶液的體積比為2:1; b. 移液管吸去上層血漿后，收取白膜層細胞PBMC，10ml生理鹽水，1500rpm離心5min，重 復洗滌一次并計數。9. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟六所述退火條件為95°C5min、62°C lOmin，退火緩沖液為annealing buffer。10. 根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟七中載體與片段的摩爾比為1: (3-10)，所述片段為CD8aHinge-CD28-CD137-CD3C片段和CD8aLeader片段的混合物，其中D8 aHinge-CD28-CD137-CD3C 片段與 CD8aLeader 片段的摩爾比為1:1。
【文檔編號】C12N15/867GK106011174SQ201610594668
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月26日
【發明人】劉春香, 張怡, 蘆慧穎, 石佳寧, 劉艷青
【申請人】黑龍江天晴干細胞股份有限公司