鑒定大豆疫霉無毒基因PsAvr1k的特異性分子標記引物及方法
【專利摘要】本發明屬于生物技術領域，公開了一種鑒定大豆疫霉無毒基因PsAvr1k的特異性分子標記引物及方法，該特異性分子標記引物對的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。通過該分子標記進行PCR擴增可以快速、高效檢測田間大豆疫霉菌株是PsAvr1k毒性菌株還是無毒菌株。本研究不僅可以用于研究PsAvr1k無毒基因在田間的分布情況，還能夠揭示大豆疫霉菌PsAvr1k在田間的致病型分化變異特點，而且為制定抗性品種選用策略提供依據。
【專利說明】
鑒定大豆疫霉無毒基因 PsAvMk的特異性分子標巧引物及 方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物技術領域，公開了一種鑒定大豆疫霉無毒基因 PsAvrlk的特異性 分子標記引物及方法，本發明通過特異性分子標記的方法能夠在大豆疫霉中快速有效檢測 大豆疫霉無毒基因 PsAvrlk。
【背景技術】
[0002] 大豆疫霉菌引起的大豆根腐病是世界范圍內大豆生產上的一種毀滅性病害，大豆 疫霉隸屬于卵菌，該類病原菌雖然在形態上與真菌相似，但在進化上卻和娃藻及藍藻關系 較近，為茸鞭生物界，因此一般真菌殺菌劑往往對大豆疫霉和其它卵菌無效。植物抗病品種 的應用，由于克服了藥害W及環境污染等問題，成為農業生產上實現抗病的重要手段。但是 自然界中由病原菌效應子介導的病原菌快速進化使得抗病品種很快就會被新病原菌克服， 因此抗病品種的應用也面臨著一定的挑戰。了解自然界中大豆疫霉無毒基因在不同菌株中 的分布情況，為農業生產上制定正確的抗病品種應用策略提供依據。
[0003] 植物與病原菌的長期協同進化過程中，病原菌為了成功侵染植物，會分泌大量效 應子作用于植物的不同細胞部位來干擾植物的免疫反應。植物為了抑制病原菌的侵染進化 出抗病蛋白來識別運些效應子，觸發植物的免疫反應，運類效應子又被稱為無毒基因。大豆 疫霉分泌的無毒基因與抗病基因的識別直接決定著卵菌病害的發生。而無毒基因在進化過 程中又通過堿基突變，氨基酸缺失，堿基插入導致移碼突變等策略，來逃避寄主抗病蛋白的 識別。因此了解毒性菌株和無毒菌株中無毒基因的序列特點對于了解無毒基因的毒力變 化、了解無毒基因在田間的分布規律、制定抗病品種使用策略具有重要的意義。
[0004] 本專利基于分子標記的策略，設計針對無毒菌株的特異性引物標記，為檢測田間 大豆疫霉菌株對于相應的抗病品種為毒性菌株還是無毒菌株提供有效手段。
【發明內容】
[0005] 為了解決農業生產中制定抗病品種選育策略的難題，本發明的目的在于提供一種 檢測大豆疫霉菌株中無毒基因 PsAvrlk的特異性分子標記引物、試劑盒及其應用。
[0006] 本發明的另一目的在于提供一種快速、簡便鑒定大豆疫霉無毒基因 PsAvrlk的方 法。
[0007] 本發明的目的可W通過W下技術方案實現：
[000引一種用于擴增大豆疫霉不同菌株中PsAvrlk全長序列的引物對，上游引物核巧酸 序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物核巧酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009] -種檢測大豆疫霉菌株中無毒基因 PsAvrlk的特異性分子標記引物對，上游引物 核巧酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核巧酸序列如SEQ ID No.4所示。
[0010] -種用于檢測大豆疫霉菌株中無毒基因 PsAvrlk特異性分子標記的試劑盒，包含 如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示的引物對。
[0011] -種用于擴增大豆疫霉不同菌株中PsAvrlk全長序列的試劑盒，包含如SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2所示的引物對。
[0012] 如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示的引物對或包含該引物對的試劑盒在擴增待 測大豆疫霉菌株PsAvrlk全長序列中的應用。
[0013] 如SEQ ID No. 3和SEQ ID No.4所示的引物對或包含該引物對的試劑盒在在檢測 大豆疫霉菌株中無毒基因 PsAvrlk特異性分子標記或檢測大豆疫霉菌株毒性中的應用。
[0014] 一種檢測大豆疫霉菌株毒性的方法，W大豆疫霉菌株基因組DNA為模板，WSEQ ID No.l和SEQ ID齡.2為引物進行?0?擴增獲得?34￥'化全長序列，^所述?34￥'化全長序列為 模板，^560 10齡.3和560 10齡.4為引物進行口〇?擴增，如果能夠擴增出5046口的片段，貝。 表明該大豆疫霉菌株為PsAvrlk無毒菌株，如果不能夠擴增出504bp的片段，則表明該大豆 疫霉菌株為PsAvrlk毒性菌株。
[0015] 本發明的技術方案具體是通過分子標記鑒定大豆疫霉菌株中無毒基因 PsAvr化的 序列及其多態性，其上游引物為化斗(569 10齡.1)，下游引物為化-3(569 10齡.2)。根據 大豆疫霉菌株無毒菌株和毒性菌株中PsAvrlk的序列的差異，設計無毒菌株特異的引物標 記（5了5)，上游引物為5尸斗(569 10齡.3)，下游引物為5尸-3(569 10齡.4)。如果該特異引 物能夠擴增出504bp的片段即為無毒菌株，如果不能擴增出504bp的片段，則為毒性菌株。
[0016] 本發明利用所述引物鑒定大豆疫霉無毒基因 PsAvdk的方法，具體包括W下步驟：
[0017] (1)提取不同菌株大豆疫霉基因組DNA;
[001引 （2)w大豆疫霉基因組DNA為模板，用所述的引物化-F/R(SEQ ID No.l和SEQ ID 齡.2)進行?0?擴增；
[0019](3)回收擴增片段，用所述特異性引物5。斗/3(569 10齡.3和569 10齡.4)進行 PCR擴增;若得到大小為504bp的片段，則表明所述大豆疫霉是無毒菌株，若無法得到504bp 的片段，則表明所述大豆疫霉為毒性菌株。
[0020] 本發明優點和積極效果表現在：
[0021] 利用本發明所述的引物W及方法能夠快速、簡便、精確鑒定大豆疫霉菌株是毒性 菌株還是無毒菌株。本發明人前期的研究表明PsAvrlk是與大豆抗病基因化S化對應的無毒 基因，含有PsAvrlk無毒基因的大豆疫霉無毒菌株能夠觸發含有化S化的大豆品種所介導的 抗性。本發明不僅可W研究該無毒基因在自然群體中的分布情況，掲示大豆疫霉菌在田間 發生致病型分化變異的特點，為我們在農業生產上通過監測無毒基因的分布W及變化來制 定抗病策略、控制病害提供有力指導。
【附圖說明】
[0022] 圖1大豆疫霉不同小種中擴增PsAvr化全長基因
[0023] 圖2大豆疫霉無毒菌株和毒性菌株中PsAvr化全長序列比對
[0024] 圖3大豆疫霉菌株中擴增PsAvr化無毒菌株特異的PsAvr化片段
【具體實施方式】
[0025] 實施例1大豆疫霉不同菌株中PsAvr化序列多態性檢測
[0026] 1.供試菌株
[0027] 大豆疫霉不同毒力菌株由化ett Μ.Tyler教授(美國Virginia生物信息研究室)饋 贈，該菌株是本領域技術人員所公知的，由南京農業大學植病系植物與疫霉互作實驗室保 存。菌株保存于10 % V8固體培養基，保存溫度為10°C。
[0028] 2.供試大豆幼苗的準備
[00巧]鑒別寄主大豆播種于裝有賠石（2-4mm)的塑料花盆(d= 10cm)里，每盆種15粒種 子，放到14h光照（強光照射)/10h黑暗的溫室中生長，7天后兩片真葉長出后留10顆苗用于 接種。所用鑒別寄主為Wi 11 iams82。感病品種為Wi 11 iams。
[0030] 3.大豆疫霉菌株致病型測定
[0031] 本研究采用下胚軸創傷接種法測定大豆疫霉菌株對鑒別寄主的毒性。大豆疫霉菌 株在V8平板上生長3天后，用手術刀在菌落邊緣挑取1cm長的菌絲體；用手術刀在大豆下胚 軸(子葉下大約1cm處）向下劃約0.5cm的傷口，然后將菌絲體接種到該傷口中。接種后的大 豆放到1地光照(強光照射)/10h黑暗的溫室中生長，2d后統計發病情況。W植株死亡率作為 抗感分類標準，植株死亡率《30%，記為抗病(A);植株死亡率>70 %，記為感病(V);植株死 亡率在30%-70%之間，記為中間類型(M)。試驗重復3次。
[0032] 4.大豆疫霉基因組提取
[0033] 本研究采用CTAB法提取大豆疫霉基因組DNA，具體操作如下：
[0034] (1)取大約50mg冷凍干燥的菌絲粉于1.5ml EP管中，加入90化L CTAB(十六烷基Ξ 甲基漠化錠）提取液（2%CTAB(w/v，g/ml);100mMTrisHCl，pH = 8.0;20mM抓TA;1.4M NaCl)和90化10%SDS(十二烷基苯橫酸鋼）(w/v)后縱滿震蕩儀上充分震蕩混勻；
[0035] (2) 5 5-60 °C水浴化，每15m i η振蕩混勻一次；
[0036] (3) 12000rpm/min離屯、lOmin，吸取上清，加入等體積的酪/氯仿/異戊醇（25:24:1) (v/v)抽提1次；
[0037] (4)1200化9111/1]1；[]1離屯、1〇1]1；[]1，吸取上清，加入等體積氯仿抽提1次；
[003引 （5)12000rpm/min離屯、lOmin，吸取上清，加入0.1倍體積的3M NaAc溶液和2倍體積 的無水乙醇過夜沉淀DNA;
[0039] (6)用預冷的70%乙醇洗涂兩次，室溫干燥；
[0040] (7)干燥后的DNA用40化的d地2〇(含50yg/mL RNase)溶解，37°C降解RNA比。
[0041 ]取化L提取的DNA樣品在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，紫外分光光度計檢測DNA濃度和 純度。DNA樣品最終稀釋至約25ngAiL后保存于在-20°C冰箱中。
[00創 5.設計擴增無毒基因 PsAvr化的引物
[0043] 根據無毒菌株Race 2(P6497)中無毒基因 PsAvr化的序列設計擴增PsAvrlk的引物 (化-F/R)，分別從Race l、Race 2、Race ll、Race 6、Race 7、Racel9、Race 25和Race 30菌 株中擴增PsAvrlk的全長序列。
[0044] 6.PCR 擴增
[0045] PCR反應體系為：2.5化10XPCR反應緩沖液；1.5化1.5mMMgCl2;0.化L2.5mM dNTPs;0.2化1 Taq DM聚合酶(5. OU/yL);0.5化引物;0.5化模板;無菌水補足至2如L。
[0046] PCR 反應參數:95°C 變性 5min;(95°C 變性 30S，58°C 退火 30s，72°C 延伸 Imin)共 33 個 循環；72 °C 延伸 1 Omin; 4°C 1 Omin; PCR在TaKaRa PCR儀上反應。
[0047] 電泳:PCR產物用1 %瓊脂糖凝膠電泳，120V電泳20-30min，用0.5yg/血漠化乙錠溶 液染色，用Bio-rad凝膠成像系統觀察（圖1)。
[004引 7.PCR產物回收與測序
[0049] PsAvr化的PCR產物通過TaKaRa凝膠回收試劑盒回收，并送金斯瑞公司進行測序。
[(K)加 ]8.PCR產物測序比對
[0051] 無毒菌株和毒性菌株中PsAvrlk的序列進行比對分析，找出毒性菌株和無毒菌株 的PsAvrlk序列差異(圖2)。
[0052] 實施例2大豆疫霉PsAvr化無毒菌株中特異性引物標記鑒定無毒菌株
[0053] 1.設計特異性擴增無毒菌株中PsAvr化的標記引物
[0054] 根據無毒菌株和毒性菌株的特異性區段設計引物(表1)(圖2KPsAvrlk基因在不 同菌株中的序列差異參見SEQ ID No.5-12
[0055] 表1PsAvr化全長引物W及無毒菌株的特異性標記引物
[0化6]
[0化7] 2.PCR擴增與產物驗證
[0化引利用PsAvr化全長的PCR產物為模板，W針對無毒菌株PsAvrlk特異性引物(SEQ ID No.3和SEQ ID No.4)進行PCR擴增。PCR產物用1%的瓊脂糖凝膠進行驗證。如果能夠擴增出 504bp的片段，則表明該菌株為PsAvdk無毒菌株;如果不能擴增出相應大小的片段，則表明 該菌株為PsAvrlk毒性菌株(圖3)。
【主權項】
1. 一種用于擴增大豆疫霉不同菌株中PsAvrlk全長序列的引物對，其特征在于:上游引 物核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2. -種用于檢測大豆疫霉菌株中無毒基因 PsAvrlk的特異性分子標記引物對，其特征 在于:上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.4所示。3. -種檢測大豆疫霉菌株中無毒基因 PsAvrlk特異性分子標記的試劑盒，其特征在于： 包含權利要求2所述的引物對。4. 一種用于擴增大豆疫霉不同菌株中PsAvrlk全長序列的試劑盒，其特征在于:包含權 利要求1所述的引物對。5. 權利要求1所述的引物對或權利要求4所述的試劑盒在擴增待測大豆疫霉菌株 PsAvrlk全長序列中的應用。6. 權利要求2所述的引物對或權利要求3所述的試劑盒在檢測大豆疫霉菌株中無毒基 因 PsAvrlk特異性分子標記或檢測大豆疫霉菌株毒性中的應用。7. -種檢測大豆疫霉菌株毒性的方法，其特征在于：以大豆疫霉菌株基因組為模板，以 SEQ ID No. 1和SEQ ID No.2為引物進行PCR擴增獲得PsAvrlk全長序列，以所述PsAvrlk全 長序列為模板，以SEQ ID No.3和SEQ ID如.4為引物進行？0財廣增，如果能夠擴增出50仙？ 的片段，則表明該大豆疫霉菌株為PsAvrlk無毒菌株，如果不能夠擴增出504bp的片段，則表 明該大豆疫霉菌株為PsAvrlk毒性菌株。
【文檔編號】C12N15/11GK106011137SQ201610625218
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月30日
【發明人】竇道龍, 宋天巧
【申請人】南京農業大學