一種紅色糖多孢菌工業生產菌株的接合轉移方法
【專利摘要】本發明公開了一種紅色糖多孢菌工業生產菌株的接合轉移方法。該方法選擇成熟的紅色糖多孢菌孢子經前處理后放于含有Mg2+的TSB液體培養基中，在靜止水浴中萌發后經清洗、懸浮處理得受體菌；將供體菌與受體菌孢子混合，在涂布2CMY固體接合轉移平板培養基中培養即可生長出接合轉移子。該方法操作方便，簡單易行，且紅色糖多孢菌的接合轉移效率可達到2×10-5，可以很好地克服目前紅色糖多孢菌工業生產菌株遺傳操作困難的局面，為紅色糖多孢菌工業菌株的定向遺傳改造及基因功能研究提供了便利條件。
【專利說明】
-種紅色糖多抱菌工業生產菌株的接合轉移方法
技術領域
[0001] 本發明設及微生物領域，具體設及一種紅色糖多抱菌工業生產菌株的接合轉移方 法。
【背景技術】
[0002] 紅色糖多抱菌（Saccharopolyspora e巧thraea)最初是由Me加 ire等人于1952年 從±壤中分離得到的，是一種革蘭氏陽性放線菌，屬糖多抱菌屬，與鏈霉菌具有較高的生物 同源性。最近幾年來，因其用于工業規模的紅霉素生產而受到廣泛關注和深入研究。2007 年，Markiyan Oliynyk在《化ture》上刊登了紅色糖多抱菌模式菌株NRI?L23338的全基因組 測序信息，為紅色糖多抱菌基因功能研究創造了條件，但迄今仍有大量的紅色糖多抱菌基 因功能未知，尤其是與紅霉素合成相關的調控基因方面，知之甚少。
[0003] 為了研究紅色糖多抱菌中相關未知功能基因，進一步闡明相關代謝產物的合成機 理，方便于構建基因工程菌株，首先需要建立一個合理高效的遺傳操作系統。雖然有報道過 使用原生質體轉化的方法巧IJ惠等，《軍事醫學科學院院刊》2009年第33卷第4期），但其只適 合用于基因失活，對于基因功能研究有一定局限性，而且未見相關遺傳轉化效率報道。
[0004] 由于紅色糖多抱菌與鏈霉菌高度同源，因此，接合轉移方法仍是目前嘗試最多的 遺傳操作方式。不過，在紅色糖多抱菌中，其染色體上缺失或變異了被私1整合酶識別的特 異性位點attBQiequn Wu,A卵1 .Environ.Microbiol. 2011 ,ρ. 7508-7516)，導致使用整合 型的穿梭載體接合效率非常低;再加上其也是一個高度分化的菌屬，不同的紅色糖多抱菌 的接合轉移效率不同，屬間的基因水平轉移(接合轉移)受很多因素影響，例如，受體菌抱子 是否成熟、供體菌的選擇、穿梭質粒的選擇、抱子萌發條件、供受比、接合轉移培養基的選擇 和培養溫度等等，運些因素都會影響接合轉移的發生或者影響接合轉移的效率。目前，紅色 糖多抱菌的遺傳操作方式沒有一種高效統一的方法，尤其對工業生產菌株而言，存在更多 不可預知因素，接合轉移效率普遍效率比較低。因此，需要提供一種能夠明顯提高紅色糖多 抱菌工業生產菌株接合轉移效率的方法。
[0005] 目前，通過接合轉移方法對紅色糖多抱菌株建立遺傳操作系統的報道很多，其中 相對比較成熟的方法主要有兩種，Bierman Μ公開了一種用于紅色糖多抱菌的接合轉移方 法，采用的是鏈霉菌屬中常規的接合轉移條件(Bierman M，et al.Gene,1992,116(1 ):43- 49)，雖然報道該結合轉移方法能夠成功，但是接合轉移效率非常低，不適合用于建立紅色 糖多抱菌的遺傳操作系統，對于體內研究基因功能有一定局限性;Yun化en公開了一種利 用溫敏型的穿梭質粒進行接合轉移的方法(化en,化n,et al.Applied and enviremmen化1 microbiology,2008,74(6) :1820-1828),并將其應用于紅色糖多抱菌株的遺傳改造，不過 其接合轉移效率未見報道，而且僅限于使用溫敏型的穿梭載體，對于其它載體，如整合型、 自殺型穿梭質粒并不適用，在一定程度上限制了該方法的應用。因此，要想進一步的推進紅 色糖多抱菌工業菌株進行定向遺傳改造及基因功能研究，需要繼續優化接合轉移的方法， 提高接合轉移的轉移率。
【發明內容】
[0006] 為了克服現有技術的缺陷和不足，本發明的目的在于提供一種紅色糖多抱菌工業 生產菌株接合轉移的優化方法，該方法簡單易行，操作方便，具有較高的紅色糖多抱菌接合 轉移效率。
[0007] 本發明的技術方案提供了一種紅色糖多抱菌工業生產菌株接合轉移的優化方法， 包括W下步驟：
[000引1)選擇成熟的紅色糖多抱菌抱子經前處理后懸浮于含有Mgh的TSB液體培養基中， 在靜止水浴中萌發后經清洗、懸浮處理得受體菌；
[0009] 2)將處理好的供體菌與受體菌抱子混合，在涂布2CMY固體接合轉移平板培養基中 培養即可生長出接合轉移子。
[0010] 根據上述技術方案提供的方法，優化的TSB液體培養基中Mgh的濃度為8~12mM。
[0011] 根據上述技術方案提供的方法，TSB液體培養基的組分為1.5g/100mL膜蛋白腺、 0.5g/100mL大豆蛋白腺、0.5g/100mL氯化鋼和0.2g/100mL氯化儀，用水配制而成。
[0012] 根據上述技術方案提供的方法，萌發的溫度為37°C，萌發時間為3~化。
[0013] 根據上述技術方案提供的方法，供體菌和受體菌抱子的細胞數量比為3~7:1。
[0014] 根據上述技術方案提供的方法，步驟2)中的培養是先在33Γ培養22~26h，用糞晚 酬酸和安普霉素覆蓋后，再繼續于30~34°C下培養7~8天。
[0015] 根據上述技術方案提供的方法，糞晚酬酸和安普霉素的終濃度分別為50yg/mL和 50μ邑/mL。
[0016] 根據上述技術方案提供的方法，供體菌與受體菌細胞數量比為4~7:1。
[0017] 根據上述技術方案提供的方法，前處理是指經LB清洗、在TES Buffer懸浮、50°C下 熱激處理。
[0018] 根據上述技術方案提供的方法，供體菌是經過離屯、、LB漂洗和懸浮處理后的菌株。
[0019] 根據上述技術方案提供的方法，接合轉移效率可達到2.0Χ10-5。
[0020] 根據上述技術方案提供的方法，供體菌為大腸桿菌S17-1，所述受體菌的成熟抱子 為紅色糖多抱菌工業生產菌株抱子。
[0021 ]在本發明的一些水實施方式中，所述的水為蒸饋水。
[0022] 本發明中所述的"2CMY固體接合轉移平板培養基"是指組成為"可溶性淀粉lOg，膜 蛋白腺2g，NaCl lg，（NH4)2S〇4 2g，K2冊〇4，CaC〇3 2g，無機鹽溶液 1ml，瓊脂20g，蒸饋水 1000ml，pH7.2;其中無機鹽溶液為一升溶液中含有FeS04·7H20 1g，MgCl·6H20 1g， 化S04'7出0 Ig"的培養基。
[0023] 本發明中所述的"LB培養基"是指"Luria-Bertani培養基"，其基本組成為:膜蛋白 腺10g，酵母抽提物5g，化C15g，葡萄糖lg，蒸饋水加至1000ml，pH7.3左右(滅菌后第一次 用時還要調一次）。
[0024] 本發明的有益效果為：
[0025] 本發明根據紅色糖多抱菌屬的生長發育特點，通過大量摸索實驗，首次發現儀離 子在接合轉移過程中的抱子萌發階段發揮著關鍵作用，有利于接合轉移的進行；
[0026] 本發明中2CMY培養基的創新性嘗試使用，對紅色糖多抱菌屬說我接合轉移效率有 明顯的提局；
[0027] 本發明通過在接合轉移過程中抱子萌發階段的萌發培養基中添加適量儀離子，并 控制抱子萌發的溫度、時間和培養方式等條件，及在平板生長階段，控制受體菌和供體菌的 比例，選擇2CMY培養基和優化后的具有適宜培養溫度的培養基中培養數天后，可明顯看見 平板培養基上長有大量的接合子.較大的提高了紅色糖多抱菌工業生產菌株的接合轉移效 率，其轉移率相對于目前較為成熟的兩種接合轉移方法提高了 25倍，有利于對紅色糖多抱 菌工業菌株進行定向遺傳改造及基因功能研究。
【具體實施方式】
[0028] 本發明實施例公開了一種紅色糖多抱菌工業生產菌株接合轉移的優化方法。本領 域技術人員可W借鑒本文內容，適當改進工藝參數實現。特別需要指出的是，所有類似的替 換和改動對本領域技術人員來說是顯而易見的，它們都被視為包括在本發明。本發明的方 法已經通過較佳實施例進行了描述，相關人員明顯能在不脫離本
【發明內容】
、精神和范圍內 對本文所述的產品及方法進行改動或適當變更與組合，來實現和應用本發明技術。
[00巧]實施例1
[0030] 將大腸桿菌S17-1 (含PSET152穿梭質粒)作為供體菌，過夜培養至ODsgg為0.4~ 0.6，離屯、收集25mL菌體，用等體積無菌的LB漂洗菌體兩次，0.1倍體積的LB懸浮備用。取約1 X108個紅色糖多抱菌工業生產菌株抱子用LB洗兩次，再用50化L TES Buffer懸浮，50°C熱 激lOmin，然后加等體積優化后的TSB液體培養基(Mgh的濃度為8mM)，37°C靜止水浴萌發化。 用LB清洗兩次，最后懸浮在ImL LB中，作為受體菌。根據供體菌和受體菌細胞數量比約3:1， 取適量進行混勻，涂布2CMY固體平板培養基，30°C過夜培養22h后，用糞晚酬酸(終濃度為50 yg/mU和安普霉素(終濃度為50yg/mL)覆蓋。7~8天后即可生長出接合轉移子。
[0031] 結合轉移效率：
[0032] 通過統計出結合平板上長出的陽性結合轉移子的數目、受體菌落形成單位數，根 據兩者的比值計算出結合轉移效率。
[0033] 計算本次接合轉移效率為2.1 Xl〇-6。
[0034] 實施例2
[00巧]將大腸桿菌S17-1 (含PSET152穿梭質粒）作為供體菌，過夜培養至0D6日日為0.4~ 0.6，離屯、收集25mL菌體，用等體積無菌的LB漂洗菌體兩次，0.1倍體積的LB懸浮備用。取約1 X108個紅色糖多抱菌工業生產菌株抱子用LB洗兩次，再用50化L TES Buffer懸浮，50°C熱 激lOmin，然后加等體積優化后的TSB液體培養基(Mgh的濃度為12mM)，37°C靜止水浴分別萌 發化。用LB清洗兩次，最后懸浮在ImL LB中，作為受體菌。根據供體菌和受體菌細胞數量比 約7:1，取適量進行混勻，涂布2CMY固體平板培養基，34Γ過夜培養22h后，用糞晚酬酸(終濃 度為50yg/mL)和安普霉素(終濃度為50yg/mL)覆蓋。7~8天后即可生長出接合轉移子，結合 轉移效率的計算方法同實施例1，測得接合轉移效率為10.3 X 10-6。
[0036] 實施例3
[0037] 將大腸桿菌S17-1 (含PSET152穿梭質粒)作為供體菌，過夜培養至ODsgg為0.4~ 0.6，離屯、收集25mL菌體，用等體積無菌的LB漂洗菌體兩次，0.1倍體積的LB懸浮備用。取約1 X108個紅色糖多抱菌工業生產菌株抱子用LB洗兩次，再用50化L TES Buffer懸浮，50°C熱 激lOmin，然后加等體積優化后的TSB液體培養基(Mg2+的濃度為10mM)，37°C靜止水浴培養 祉。用LB清洗兩次，最后懸浮在ImL LB中，作為受體菌。根據供體菌和受體菌細胞數量比約 5:1，取適量進行混勻，涂布2CMY固體平板培養基，32 °C過夜培養24h后，用糞晚酬酸(終濃度 為50yg/mL)和安普霉素(終濃度為50yg/mL)覆蓋。7~8天后即可生長出接合轉移子，結合轉 移效率的計算方法同實施例1，測得接合轉移效率可達到3.1 X 10-6。
[003引實施例4
[0039] 將大腸桿菌S17-1 (含PSET152穿梭質粒)作為供體菌，過夜培養至ODsgg為0.4~ 0.6，離屯、收集25mL菌體，用等體積無菌的LB漂洗菌體兩次，0.1倍體積的LB懸浮備用。取約1 X108個紅色糖多抱菌工業生產菌株抱子用LB洗兩次，再用50化L TES Buffer懸浮，50°C熱 激lOmin，然后加等體積優化后的TSB液體培養基(Mgh的濃度為10mM)，37°C搖床動態培養萌 發化后。用LB清洗兩次，最后懸浮在ImL LB中，作為受體菌。根據供體菌和受體菌細胞數量 比分別約為5:1，取適量進行混勻，涂布2CMY固體平板培養基，32 °C過夜培養2加后，用糞晚 酬酸(終濃度為50yg/mL)和安普霉素(終濃度為50yg/mL)覆蓋。7~8天后即可生長出接合轉 移子，結合轉移效率的計算方法同實施例1，測得接合轉移效率為9.1 X 10-6。
[0040] 實施例5
[0041 ]將大腸桿菌S17-1 (含PSET152穿梭質粒)作為供體菌，過夜培養至ODsgg為0.4~ 0.6，離屯、收集25mL菌體，用等體積無菌的LB漂洗菌體兩次，0.1倍體積的LB懸浮備用。取約1 X108個紅色糖多抱菌工業生產菌株抱子用LB洗兩次，再用50化L TES Buffer懸浮，50°C熱 激lOmin，然后加等體積優化后的TSB液體培養基(Mgh的濃度為10mM)，37°C靜止水浴萌發化 后。用LB清洗兩次，最后懸浮在ImL LB中，作為受體菌。根據供體菌和受體菌細胞數量比約 為5:1，取適量進行混勻，涂布2CMY固體平板培養基，分別在33°C過夜培養24h后，用糞晚酬 酸(終濃度為50yg/mL)和安普霉素(終濃度為50yg/mL)覆蓋。7~8天后即可生長出接合轉移 子，結合轉移效率的計算方法同實施例1，測得接合轉移的轉移效率為20.3Χ10-6。
【主權項】
1. 一種紅色糖多孢菌工業生產菌株的接合轉移方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 選擇成熟的紅色糖多孢菌孢子經前處理后懸浮于含有Mg2+的TSB液體培養基中，在靜 止水浴中萌發后經清洗、懸浮處理得受體菌； 2) 將供體菌與受體菌孢子混合，在涂布2CMY固體接合轉移平板培養基中培養即可生長 出接合轉移子。2. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述優化的TSB液體培養基中Mg2+的濃度為8 ~12mM〇3. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述優化的TSB液體培養基的組分為1.5g/ lOOmL胰蛋白胨、0 · 5g/100mL大豆蛋白胨、0 · 5g/100mL氯化鈉和0 · 2g/100mL氯化鎂，用水配 制而成。4. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述萌發的溫度為37°C，萌發時間為3~6h。5. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2)中供體菌和受體菌孢子的細胞數量比 為3~7:1〇6. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟2)中的培養是先在30~34°C培養22~ 26h，用萘啶酮酸和安普霉素覆蓋后，再繼續于30-34°C下培養7~8天。7. 根據權利要求6所述方法，其特征在于，所述萘啶酮酸和安普霉素的終濃度分別為50 lig/mL 矛口 50iig/mL。8. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述前處理包括用LB清洗、在TES Buffer中 懸浮處理和50 °C下熱激處理。9. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述供體菌是經過離心、LB漂洗和懸浮處理 后的菌株。10. 根據權利要求1所述方法，其特征在于，所述供體菌為大腸桿菌S17-1，所述受體菌 的成熟孢子為紅色糖多孢菌工業生產菌株孢子。
【文檔編號】C12N15/03GK106011128SQ201610158588
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年3月17日
【發明人】趙裕棟, 鮑素敏
【申請人】廣東東陽光藥業有限公司