植酸酶突變體YkAPPA-L162V及其編碼基因和應用
【專利摘要】本發明涉及基因工程領域，具體涉及植酸酶突變體YkAPPA?L162V及其編碼基因和應用。通過將氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的植酸酶的第162位的亮氨酸突變為纈氨酸獲得所述植酸酶突變體YkAPPA?L162V。相比于野生型，本發明的兩個植酸酶YkAPPA突變體YkAPPA?L162V的最適溫度較55℃提高了5℃，耐酸性和蛋白酶抗性及在60℃下30min的熱穩定性明顯改良，在發展節約環保型飼料酶工業上具有潛在的應用價值。
【專利說明】
植酸酶突變體YkAPPA-L162V及其編碼基因和應用
技術領域
[0001] 本發明設及基因工程領域，具體設及植酸酶突變體YkAPPA-L162V及其編碼基因和 應用。
【背景技術】
[0002] 豆類、谷類等作物種子中有80% W上的憐W植酸形式存在。植酸酶廣泛分布在± 壤、植物W及微生物分泌物中，對自然環境中憐代謝有著重要的作用。植酸酶，又叫肌醇六 憐酸水解酶，能夠水解植酸的憐酸單醋鍵釋放無機憐。單胃動物飼料中添加植酸酶能夠可 有效地提高植酸憐的利用效率、降低動物養殖區的憐排放對環境的污染。
[0003] 盡管從自然界中獲得了大量植酸酶基因，但沒有一個植酸酶可W同時滿足工業應 用的所有需求。目前科學家們通過蛋白質工程技術手段獲得具有優良物理化學性質的植酸 酶，W適應動物消化道內pH條件的變化、增加蛋白酶抗性、減少飼料制粒過程中的損失。對 具有良好酸穩定性和高最適溫度植酸酶的需求，促進了新酶資源的開發W及酶學性質改良 研究。新型優質植酸酶的獲得將大大擴展其實際應用空間，也正是目前急需解決的問題和 執占。 "、、'、、、〇
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供一種最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶。
[0005] 本發明另一目的是提供編碼上述最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶基因。
[0006] 本發明的另一目的是提供包含上述最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶基因的 重組載體。
[0007] 本發明的另一目的是提供包含上述最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶基因的 重組菌株。
[000引本發明的另一目的是提供上述最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶基因的應用。
[0009] 本發明對克氏耶爾森氏菌(Yersinia kristensenii)來源植酸酶YkAPPA基因進行 定點突變，該植酸酶YkAPPA的成熟蛋白具有如SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列，該成熟蛋白 是由如SEQ ID NO.2所示的核巧酸序列編碼的。
[0010] SEQ ID N0.1
[0011] MTIAKE 化化 SILTLVLSSFTLSAAPLAAQSTGYTLERVVILS 畑 GVRSPTKQTQLMNDVTPDKWPQWPVKAGYLTP RGAGLVTLMGGFYGDYFRSYG化PAGCPADESIYVQADVDQRTRLTGQAFU)GIAPDCGLKVHYQADLKKIDPLFHT VEAGVCKLDP邸 THQAV 邸化 GG化肥 LSQRYAKPFALMGE化 NFSASPYCNSLQQKGKTCDFATFAANEIEVNKEG TKV化SGPLALSSTLGEIF化QNSQAMPDVAWNRLSG邸NWIS1XSLHNAQ抑LMAKTPYIA畑KGTP1XQQIDTAL YLQRDAQGQ化PLSPQTKLLFLGG皿TNIANIAGMLGANWQLPQQPDNTPPGGGLVFELWQNPDNHQRYVAVKMFYQ TMEQLRNADKLDLKNNPARIVPIAIEGCENEGDNKLCQLETFQKKVAQVIEPACHI.
[0012]沈Q ID NO.2
[0013]
[0014] 本發明采用定點突變的方法，獲得了最適溫度提高且耐酸性改良的突變體，命名 為YkAPPA-L162V，即YkAPPA的第162位的亮氨酸突變為鄉氨酸。
[0015] 因此根據本發明的最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶突變體YkAPPA-L162V，其 氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示
[0016] 沈Q ID NO.3
[0017]
[0018] 本發明還提供了編碼上述最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶突變體化APPA- L162V的基因序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO.4所示。
[0019] 沈Q ID NO.4
[0020]
[0021] 將上述編碼最適溫度提高且耐酸性改良的植酸酶突變體YkAPPA-L162V的cDNA分 子W合適的取向和正確的讀碼框插入到所述載體的限制性酶切位點之間，使其核巧酸序列 可操作的與表達調控序列相連接。本發明優選的載體為祀T-22M + )，使改造的植酸酶基因 插入到質粒祀T-22M + )上的EcoRI和Notl限制性酶切位點之間，使該核巧酸序列位于T7啟 動子的下游并受其調控，得到各突變體的重組原核表達質粒。本發明優選的宿主菌為化21 (DE3)。相比于野生型，本發明的兩個植酸酶YkAPPA突變體YkAPPA-L162V的最適溫度較55°C 提高了5°C，耐酸性和蛋白酶抗性及在60°C下30min的熱穩定性明顯改良，在發展節約環保 型飼料酶工業上具有潛在的應用價值。
【附圖說明】
[0022] 圖1突變酶YkAPPA-Ll 62V與野生酶YkAPPA的耐酸性比較；
[0023] 圖2突變酶YkAPPA-L162V與野生酶YkAPPA的蛋白酶抗性比較。
【具體實施方式】
[0024] 實驗材料
[00巧]原核表達載體祀T-22K + )購自Novagen公司。大腸桿菌TYansl-tl和化21(DE3)細 胞購自天根，分別作為質粒擴增及原核表達宿主菌。DNA純化試劑盒購自TaKaRa。押U DNA聚 合酶、限制性內切酶、T4DNA連接酶購自天根。植酸鋼和胃蛋白酶(P0685)購自Sigma。由上海 英俊生物技術有限公司合成核巧酸引物。
[0026] 實施例1:突變基因的獲得
[0027] W克氏耶爾森氏菌(Yersinia kristeensenii)來源的植酸酶YkAPPA的基因序列 (SEQ IDN0.2)進行改造，通過Over lap PCR的方式引入突變，并對其進行測序，獲得突變基 因。該方法W含有野生植酸酶基因化APPA的祀ASY-T3-YkAPPA重組質粒為模板，通過兩輪 PCR反應引入突變。其中使用四條引物，包括擴增突變基因完整編碼序列的分別帶有EcoR I 和Not I識另ll序列的上下游引物（YkAPPA Forward : 5 ' - cgcgaattcgcaccgcttgcagcacaatctac-3 ' 和YkAPPA Reverse:5'- gatgcggccgcttaaatatggcaggctggctcG-3'）及在特定位置引入突變的上下游引物（YkAPPA L162V化抓日'(1:5'-邑1日1邑1日日日邑1邑邑日(3(3。日邑日邑日日日日(31：(3-3'和^ΑΡΡΑ L162V Reverse:5'- gagttttctctgggtccactttacatac-3'）。所需的突變基因連接到載體pEASY-T3載體上并經 DNA測序證實。
[0028]實施例2:改造前后的植酸酶的原核表達載體的構建及其在大腸桿菌中的表達與 純化
[00巧]野生植酸酶YkAPPA和突變體YkAPPA-L162V分別編碼441個氨基酸和一個終止密碼 子，N端23個氨基酸為信號膚序列，成熟蛋白理論分子量為48.6kDa。野生型植酸酶及其突變 體去除信號膚后的編碼區序列插入到原核表達載體祀T-22K + )的EcoRI和Notl酶切位點之 間，并轉化到大腸桿菌化2UDE3)細胞中，加入終濃度2mM的IPTG(異丙基-β-D-半乳糖巧)在 24°C和22化pm的搖床中振蕩培養化誘導目的蛋白表達。粗酶液經儀-次氮基Ξ乙酸（Ni- NTA)柱和二乙基氨基乙基化EAE)柱進行層析純化。野生酶和突變酶經10%SDS-PAGE電泳檢 測為一條約46kDa的特異性表達條帶。
[0030] 實施例3:突變植酸酶與野生酶的酶學性質比較
[0031] 使用硫酸亞鐵鋼藍法測定野生型和突變型酶的活性。將50化適當濃度酶液加入到 950μΙ 1.5mmol/L植酸鋼底物（用抑4.5和0.25M的NaAc-HAc緩沖液配制）中，在37°C水浴鍋 中反應30min，加入ImL 10%Ξ氯乙酸終止反應，最后加入2mL顯色液（1 %四水合鋼酸錠， 3.2%濃硫酸，7.32硫酸亞鐵)進行顯色。在700納米下測定吸光度值衡量釋放的無機憐酸鹽 的量。一個植酸酶活性單位定義為在測定條件下，每分鐘釋放1微摩爾的憐酸鹽所需的酶 量。所有反應重復Ξ次。
[0032] (1)最適溫度和熱穩定性
[0033] 突變酶與野生酶在不同溫度（30-80°C)下處理30min，確定最適溫度。熱穩定性測 定是在一定溫度下將酶液分別處理0，2，5，10，20，30，60min后進行測定，結果如表1。突變酶 的最適溫度為60°C，較野生型提高了 5°C。突變酶在60°C下處理30min較野生酶有更好的熱 穩定性，可保持30.5 %酶活，而野生酶保持16.1 %的酶活。因此，植酸酶YkAPPA的第162位的 亮氨酸突變為鄉氨酸提高了植酸酶的最適溫度和熱穩定性。
[0034] 表1pH和溫度對改造前后的植酸酶的酶活和穩定性的影響的比較
[0035]
[0036] (2)最適抑和抑穩定性
[0037] 改造前后的植酸酶在不同抑(1-12)和37°C下進行酶促反應30min，測定最適抑。酶 液在抑1-9和37 °C下處理化或抑1-4下37 °C處理化，研究酶的pH穩定性。所用的緩沖液為： 0 . Imol/L甘氨酸-鹽酸緩沖液，pHl-3 ; 0 . Imol/L醋酸鋼-醋酸緩沖液，PH3-6 ; 0 . Imol/L Tris-鹽酸緩沖液，P冊-8; 0.1mol/L甘氨酸-氨氧化鋼緩沖液，P冊-12。
[0038] 改造前后的植酸酶的pH值特性比較如表1。突變酶的最適pH類似于野生型，為pH 4.5。突變酶在抑3.0-9.0下處理比與野生型具有相似的穩定性;pH值為1下處理化，突變酶 可保持83.5%活性，而野生酶只能保持在30.5%活性。當抑1下處理時間延長至化，突變酶 可保持74.8%的酶活性，而野生酶僅保持58.4%的酶活性（圖1)。因此突變酶比野生酶具有 較高的酸穩定性。
[0039] (3)蛋白酶抗性
[0040] 突變酶與野生酶分別用胃蛋白酶（0.25M甘氨酸鹽酸，pH2)和膜蛋白酶（0.25M Tris-HCl，抑7)在37°C下處理化，蛋白酶和植酸酶的比例在1/1000到1/20范圍之間。對蛋白 酶處理后的樣品用最適抑緩沖液稀釋，在37°C和最適抑件下研究蛋白酶對植酸酶活性的影 響。
[0041] 突變酶與野生酶經不同濃度的胃蛋白酶和膜蛋白酶處理后的蛋白酶抗性結果見 圖2。野生酶對膜蛋白酶具有高度抗性，在膜蛋白酶與植酸酶的比例從1/1000升至1/20時， 野生酶的酶活基本不變。而野生酶對胃蛋白敏感，當用1/20高濃度的胃蛋白處理化后，其酶 活基本消失。突變酶與野生酶相比其胃蛋白酶抗性明顯提高，在1/20高濃度胃蛋白處理下 突變酶可保持33.3 %的酶活。植酸酶YkAPPA的第162位的亮氨酸突變為鄉氨酸后，沒有改變 其膜蛋白酶抗性。
【主權項】
1. 植酸酶突變體YkAPPA-L162V，其特征在于，通過將氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示的 植酸酶的第162位的亮氨酸突變為纈氨酸獲得所述植酸酶突變體YkAPPA-Ll 62V。2. 植酸酶基因 YkAPPA-L162V，其特征在于，其編碼權利要求1所述的植酸酶突變體 YkAPPA-Ll62V。3. 根據權利要求2所述的植酸酶基因 YkAPPA-L162V，其特征在于，所述基因的核苷酸序 列如SEQ ID NO.4所示。4. 包含權利要求2所述的植酸酶基因 YkAPPA-L 162V的重組載體。5. 包含權利要求2所述的植酸酶基因 YkAPPA-L162V的重組菌株。6. -種制備穩定性改良的植酸酶突變體的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 用權利要求4的重組載體轉化宿主細胞，得重組菌株； 2) 培養重組菌株，誘導重組的植酸酶表達；以及 3) 回收并純化所表達的植酸酶突變體YkAPPA-L162V。7. 權利要求1所述的植酸酶突變體YkAPPA-L162V用于水解植酸鈉的應用。
【文檔編號】A23K20/189GK106011101SQ201610526087
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】楊培龍, 牛燦芳, 姚斌, 聞治國, 李秀梅, 王亞茹, 羅會穎, 馬銳
【申請人】中國農業科學院飼料研究所