粗裂地錢氧甲基轉移酶及其編碼基因與應用
【專利摘要】本發明公開了一種粗裂地錢氧甲基轉移酶及其編碼基因與應用。該粗裂地錢氧甲基轉移酶，其氨基酸序列為以下之一：(1)SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；或(2)將SEQ ID No.1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。本發明提供的MpaOMT1基因是首次發現的在粗裂地錢中能夠表達氧甲基轉移酶的基因，其編碼的氧甲基轉移酶具有廣譜的催化活性，能夠用于制備生產甲基化的苯丙素、香豆素或黃酮等多類化合物，其中對槲皮素、楊梅素及木犀草素等化合物的催化效率較高，可用于生物合成這些化合物的甲基化產物，具有較高的應用價值和廣闊的應用前景。
【專利說明】
粗裂地錢氧甲基轉移酶及其編碼基因與應用
技術領域
[0001] 本發明設及基因工程技術領域，具體設及一種粗裂地錢氧甲基轉移酶及其編碼基 因與應用。
【背景技術】
[0002] 植物體內含有豐富的次生代謝產物，例如黃酬、苯丙素、香豆素和祗類等。運些化 合物在植物體內參與生長發育過程、響應生物和非生物脅迫、氧化應激的調節及植物激素 的調節等。在適應從水生到陸生的環境變化過程中，苔類植物積累了各種類型的化合物，許 多新骨架成分及新藥也從苔類植物中被發現。次生代謝產物的后修飾需要氧甲基轉移酶的 參與，W生成多種苯環上含氧甲基的產物，改變了含芳香類化合物的生理特性和化學活性， 擴大了代謝產物的多樣性，對于開發植物源藥用成分意義重大。
[0003] 目前已研究的氧甲基轉移酶多數來源于含有維管組織的高等植物，而苔薛植物中 的氧甲基轉移酶極少被鑒定。
[0004] 粗裂地錢(Marchantia paleacea)為地錢科(Macrhantineae)-種苔類植物的葉 狀體，屬于苔薛植物中的一種，廣泛分布于各地，多生于陰暗潮濕的地方。我國苔薛植物資 源十分豐富，已報道的約有3000多種。但目前對于粗裂地錢運一植物資源的研究還相對較 少，已有的研究多集中于粗裂地錢中化學成分的分離純化，而從粗裂地錢中分離鑒定出具 有廣譜催化活性的氧甲基轉移酶還未見報道。
【發明內容】
[0005] 針對上述現有技術，本發明的目的是提供一個來源于粗裂地錢的氧甲基轉移酶及 其編碼基因與應用。
[0006] 為實現上述目的，本發明采用下述技術方案：
[0007] 本發明提供的一種粗裂地錢氧甲基轉移酶，其氨基酸序列為W下之一：
[000引 （l)SEQ ID No.l所示的氨基酸序列;或
[0009] (2)將SEQ ID No.l所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加且功能相同的蛋白質。
[0010] 上述粗裂地錢氧甲基轉移酶的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。
[0011] 上述編碼基因(MpaOMTl)中，其核巧酸序列為W下之一：
[0012] (l)SEQ ID No.2所示的核巧酸序列;或
[0013] (2)與SEQ ID No. 2所示的核巧酸序列具有90% W上同源性且編碼相同功能蛋白 質的核巧酸序列。
[0014] 進一步的，本發明還提供了含有上述編碼基因的表達載體。
[0015] 上述表達載體為重組原核表達載體或重組植物表達載體。
[0016] 在本發明的一個【具體實施方式】中，所述重組原核表達載體為:在表達載體祀T32a 中插入上述編碼基因。
[0017] 在本發明的一個【具體實施方式】中，所述重組植物表達載體為:在表達載體pGWB5中 插入上述編碼基因。
[0018] 本發明還提供了含有上述表達載體的重組細胞、轉化體。
[0019] 優選的，所述重組細胞為含有上述表達載體的細胞化21 (DE3)或細胞EHA105。
[0020] 本發明還提供用于擴增上述編碼基因的引物對，其核巧酸序列分別如SEQ ID No.3和沈Q ID No.4所示。
[0021 ]上述粗裂地錢氧甲基轉移酶在制備生產甲基化的苯丙素、香豆素或黃酬類化合物 中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0022] 本發明的有益效果：
[0023] 本發明提供的MpaOMTl基因是首次發現的在粗裂地錢中能夠表達氧甲基轉移酶的 基因，本發明利用PCR技術從cDNA獲得了其全長序列，通過構建GFP定位載體，用煙草瞬時轉 化法發現該基因定位于細胞質和細胞核。構建該基因的原核表達載體，IPTG誘導蛋白表達。 結果發現其編碼的氧甲基轉移酶具有廣譜的催化活性，能夠用于制備生產甲基化的苯丙 素、香豆素或黃酬等多類化合物，其中對搬皮素、楊梅素及木犀草素等化合物的催化效率較 高，可用于生物合成運些化合物的甲基化產物，具有較高的應用價值和廣闊的應用前景。
【附圖說明】
[0024] 圖1:表達基因 MpaOMTl擴增產物電泳圖，其中，A:從cDNA中擴增MpaOMTl全長結果， B: MpaOMTlORF 擴增結果。
[0025] 圖 2:Mpa0MTl 蛋白 SDS-PAGE電泳圖；
[0026] 其中：泳道l:Mpa0MTl的上清液；
[0027] 泳道 2: MpaOMTl 的沉淀；
[0028] 泳道3:Mpa0MTl的純化蛋白。
[0029] 圖3:咖啡酷輔酶A、輔酶A、咖啡酸紫外吸收示意圖。
[0030] 圖4:MpaOMTl的底物及反應產物。
[0031] 圖5:Mpa0MTl的亞細胞定位。
【具體實施方式】
[0032] 結合實施例對本發明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發明，并不對其內容進行限定。
[0033] 下述實施例中，所使用的實驗方法，未做具體說明的，均為常規方法，例如可W參 考《分子克隆實驗指南》（5日11113'〇〇4和咖33日11，2001)。
[0034] 下述實施例中，所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0035] 實施例1.表達基因 MpaOMTl的克隆
[0036] 1.1 CTAB-PVP法提取粗裂地錢總RNA
[0037] (1)取新鮮粗裂地錢植物材料，洗凈后用濾紙吸干多余水分。加液氮研磨材料，反 復2-3次至材料成粉末狀，取少量至提前預冷的離屯、管中。
[0038] (2)加1ml 65°C預熱的CTAB-PVP提取液，振蕩緩和均勻。
[0039] 上述CTAB-PVP提取緩沖液配制方法：100mM Tris ·肥 1(抑 8.0)，2%CTAB(w/v)， 2%PVP(w/v)，25mM EDTA，2M NaCl，高壓蒸汽滅菌之后琉基乙醇加至0.2%;W上溶液用 DEPC處理過的dd出0配制，高壓滅菌后備用。
[0040] (3)65°C 溫浴 30min，期間每隔 6-lOmin 振蕩一下。
[0041 ] (4)冷卻后加入60化1氯仿，振蕩混合均勻。
[0042] (5)4°C13,000rpm 離屯、lOmin。
[0043] (6)取上清轉移至新離屯、管，加入60化1氯仿，振蕩混合均勻后4°C13,000巧m離屯、 10min〇
[0044] (7)重復上步（即用氯仿抽提Ξ次）。
[0045] (8)小屯、吸取上清轉移至新的1.51111離屯、管中，加入1/^3體積的81 ^(：1，-20°(：靜置 化W上(或4Γ靜置過夜）。
[0046] (9)4°C13,000巧m 離屯、lOmin，棄上清。
[0047] (10)加入80化1 75%乙醇洗涂沉淀。離屯、棄上清后揮干剩余乙醇。
[004引 （11)加入40μ1 Proteinase K處理后的滅菌水溶解RNA，制得總RNA。使用 Bio化otometer plus核酸蛋白測定儀測定提取的RNA濃度及質量。
[0049] 1.2 cDNA的合成
[00加 ]W提取的粗裂地錢的總RNA為模板，WPrimeScript RT Master Mix逆轉錄體系通 過PCR技術獲得cDNA模板鏈。將下列各組分加入進口 PCR管中，輕輕混勻，離屯、，使混合液集 中于PCR管底部。
[0化1 ]
[0化2] 在PCR儀中逆轉錄程序如下：37°c，15min;85°c，15s;4°c保溫。逆轉錄產物保存于- 2(rc，使用前稀釋10倍。
[0化3] 1.3 MpaOMTl全長基因的克隆
[0054] W稀釋的粗裂地錢cDNA為模板，WMpaOMTl F1/R1為引物，采用PrimeSTAR DNA polymerase體系擴增MpaOMTl目的片段。
[0055] MpaOMTl F1：GCAAGCAGCAGCAGCATAT；(SEQ ID No.3)
[0056] MpaOMTl R1：TTTCTCACCAACCTCGGAC；(SEQ ID No.4)
[0化7] 體系如下：
[0化引
[0059] 將W上組分加入進口 PCR管混合均勻后，低轉速離屯、，按照W下程序擴增：
[0060] ① 94°C，3min;
[0061] ② 94°C，10S;
[0062] ③ 52°C，15S;
[0063] ④ 72°C，30S;
[0064] ?Go to②，33times;
[00化]⑥ 72°C，10min。
[0066] PCR結果同樣進行瓊脂糖凝膠電泳檢測（結果見圖1-A)，將目的條帶切膠回收，方 法如下。
[0067] 將上述酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳（1.5%，W/V)，并用OMEGA膠回收試劑盒回收 目的片段。步驟如下：
[0068] (1)電泳結束后漠化乙錠化thidium bromide，EB)染色5min，于紫外燈下快速切下 含有目的條帶的膠塊，將膠塊放入1.5mL離屯、管。
[0069] (2)加入500μΙ Binding Buffer(XP2)，55°C溫浴5min至膠塊完全溶解。期間每隔 2-3min顛倒震蕩離屯、管一次。
[0070] (3)將化Bind DNA column置于2mL的收集管中，然后將上述溶膠液轉移至化Bind DNA column,室溫 12,000巧111離屯、1111；[]1。
[0071] (4)棄掉收集管中的濾液，HiBind DNA column中加入300μΙ Binding Buffer (XP2)。室溫12,000巧m離屯、Imin，棄掉收集管中的濾液。
[0072] (5)加入700μΙ SPW Wash Buffer,室溫 12,000巧m離屯、Imin。
[0073] (6)重復上步一次。
[0074] (7)棄掉濾液，空HiBind DNA column室溫12,000巧111離屯、2111；[]1揮干剩余乙醇。
[0075] (8)將HiBind DNA column置于新的1.5mL離屯、管中。在柱子膜中央加入30化 d地2〇，室溫靜置2min，12，000巧m離屯、Imin。
[0076] (9)測定回收率:使用Biophotometer plus核酸蛋白測定儀測定樣品濃度及質量， 回收片段立即使用或-20°C保存。
[0077] 1.4目的片段T載體連接
[0078] 上述膠回收產物依次進行加 A連T實驗，
[00巧]加 A體系：
[0080]
[0081 ] 各組分混勻后甩一下，按如下PCR程序:72°C，40min;4°C，10min。然后將加 A產物與 T載體(購自化kara公司）進行連接，反應體系如下：
[0082]
[0083] 將各組分輕輕混勻，16°C放置2-化。
[0084] 1.5 轉化
[0085] -80°C取出大腸桿菌D冊α感受態細胞(5化L)置于冰上解凍，加入10化連接產物，輕 柔吹打混勻，冰上靜置30min;42°C水浴中熱擊90s后迅速置于冰上，待2min后加入60化L LB 培養基，37°C振蕩培養比，待其復蘇后取2(Κ)化轉化液涂于LB固體培養基(含l(K)yg/mL Amp) 上，37°C靜置培養12-1化。
[0086] LB培養基組分（1L):酵母提取物5g、膜蛋白腺lOg、化C1 lOg，加水溶解后，調pH至 7.0，定容。固體培養基加入瓊脂(12g/L)后，高壓蒸汽滅菌。
[0087] 1.6重組子陽性克隆鑒定
[0088] 隨機挑選10個單克隆于200UL培養基，37°C振蕩培養4h，W菌液為模板進行菌落 PCR。體系如下：
[0089]
[0090] 擴增程序：
[0091] ① 94°C，5min;
[0092] ② 94°C，30S;
[0093] ③ 56°C，30S;
[0094] ④ 72 °C，60S;
[0095] 這)Go to②，33times;
[0096] ⑥ 72°C，10min。
[0097] 菌落PCR后進行瓊脂糖凝膠電泳，能擴增出目的片段大小條帶的為陽性克隆，將能 擴增出大小合適條帶的克隆送博尚生物技術有限公司測序。陽性克隆存菌：菌液93化L加 DMS0 7化L，混和均勻后于-80°C保存。
[0098] 實施例2、原核表達分析
[0099] 2.1 提取 Mpa0MTl-pMD19-T 質粒
[0100] 分別用質粒小量提取試劑盒(OMEGA)提取質粒：
[0101] (1)將Mpa0MTl-pMD19-T-D冊α劃LB板(含lOOyg/mL Amp),將單克隆挑到4mL抗性LB 培養基中，37°C200巧m培養lOh，
[0102] (2)取菌液室溫10,000 X g離屯、Imin，棄上清，收集菌體，盡可能倒干上清。
[0103] (3)加25化L溶液1(含RNase A)，滿縱震蕩至菌體完全懸浮。
[0104] (4)加入250化溶液II，溫和顛倒離屯、管4~6次，得到澄清的裂解液。室溫解育 2min〇
[0105] (5)加入35化L溶液III，立即溫和顛倒數次混合，至出現白色絮狀沉淀。
[0106] (6)室溫13,000g離屯、lOmin。小屯、吸取上清，移至吸附柱(裝配好容積2mL收集管） 中。室溫13，OOOg離屯、Imin，棄濾過液。
[0107] (7)加50化L Buffer皿，13,000g離屯、Imin，清洗吸收柱W除去殘余蛋白質，棄濾 過液。
[0108] (8)加700μΙ Wash Buffer清洗吸收柱，13,000g離屯、Imin，棄濾過液。
[0109] (9)重復步驟8-次。
[0110] (10)空柱13，OOOg離屯、Imin，室溫放置3min，除去殘留乙醇。
[0111] (11)將吸收柱放入干凈1.5mL離屯、管，在濾膜中央加30-5化L無菌去離子水，室溫 靜置2minJ0000g離屯、Imin洗脫質粒，立即實驗或者-20°C保存。
[0112] (12)使用BioPhotometer plus核酸蛋白測定儀測定提取的DNA濃度及質量。
[011引注意：
[0114] a)使用前，將試劑盒中的RNA酶全部加入溶液I，4°C保存。
[0115] b)Wash Buffer中加入80mL乙醇，室溫保存。
[0116] C)溶液II和ΠI使用前檢查是否有鹽析出，若析出，37°C加熱使溶解。
[0117] 2.2 擴增 MpaOMTlORF
[0118] WMpa0MTl-pMD19-T質粒為模板，用引物對MpaOMTl-F/R和PrimeSTAR Max DNA聚 合酶分別擴增了 MpaOMTl的ORF。
[0119] MpaOMTl-F:CGGGATCCATGGCGACCGAAGCCGCTGT(沈Q ID No.5);
[0120] MpaOMTl-R：CCCTCGAGTCATACCACTCTGCGGCAAA(SEQ ID No.6)；
[0121] 體系如1.3。將組分加入進口 PCR管混合均勻后，按照W下程序擴增：
[0122] ① 94°C，3min;
[0123] ② 94°C，10S;
[0124] ③ 55°C，15S;
[0125] ④ 72°C，30S;
[0126] ?Go to②，33times;
[0127] ⑥ 72°C，10min。
[01%] PCR產物經凝膠電泳分離后，切下目的片段并回收(結果見圖1-B)。
[0129] 2.3 酶切
[0130] 用限制性內切酶BamH I和化0 I分別消化MpaOMTl的擴增產物和載體祀T32a，體系 如下：
[0131]
[0132] 將W上組分混合均勻后，37°C反應化，然后用凝膠電泳進行分離，切膠并回收酶切 產物。
[0133] 2.4連接、轉化及陽性驗證
[0134] 用T4 DNA連接酶連接目的片段與載體：
[0135]
[0136] 上述各組分混合均勻后，16°C連接過夜;連接產物轉化大腸桿菌D冊α，將單克隆驗 證陽性并送測序，取測序正確的單克隆存菌并提取質粒。
[0137] 2.5 MpaOMTl蛋白表達 [013引 2.5.1原核表達
[0139] (1)將構建好的Mpa0MTl-pET3^和空載體pET32a用熱激法轉入表達型大腸桿菌 BL2UDE3)感受態細胞中，篩選陽性克隆。
[0140] (2)挑取陽性單克隆接種于4血含Amp抗性的LB培養基中，37 °C震蕩培養過夜，轉速 為200巧m。
[0141] (3)取菌液按1:100的比例接種到200血含Amp抗性的LB培養基中，37 °C震蕩培養至 00600^0.5，加入1M的IPTG使其終濃度為0.5mM。
[0142] (4)18°C繼續培養1她誘導蛋白表達。
[0143] (5)將菌液分幾次加入到50mL離屯、管中，5,000巧m離屯、5min后棄上清，收集菌體。
[0144] 2.5.2蛋白的分離純化
[0145] (1)洗涂菌體:收集的菌體用適量結合緩沖液(Binding buffer)重懸，5,000rpm離 屯、5min，棄上清。洗涂兩次。
[0146] Binding buffer(pH 8.0):20mM Tris-HCl,500mM NaCl,5mM imidazole〇
[0147] (2)重懸菌體:稱重，按每克力日5-lOmL的比例加入Binding buffer。
[0148] (3)機械裂解:菌液置于冰水混合物中，超聲波均質裂解菌體。超聲條件:3s破碎， 5s停，破碎時間3min。
[0149] (4)裂解產物離屯、:4°C下12,000巧m離屯、20min。收集上清液進行純化，留部分上清 液和沉淀備電泳。
[0150] (5)過柱純化:豎直固定好柱子并用10血Binding buffer平衡柱子。加入上清液， 先用lOmL Binding buffer洗脫掉雜蛋白，再用4mL稀釋過的Elution buffer(咪挫濃度為 250mM)洗脫，收集饋分。
[0151] Elution buffer(pH 8.0):20mM Tris-HCl，500mM NaCl，500mM imdazole。
[0152] (6)蛋白換液濃縮:干燥超濾管中加入適量Ξ蒸水，冰浴預冷幾分鐘。倒掉水加入 收集液，4,000g離屯、lOmin，離屯、加速度調至最低。總蛋白液濃縮至1血時，加入4mL Binding buff er再濃縮至ImL左右，連續兩次。整個過程都應在較低溫度下進行。最后，輕輕插入槍頭 輕輕吹打混勻蛋白液，吸取濃縮液，測定蛋白濃度，并留樣電泳。
[0153] (7)蛋白保存:立即使用或者加入適量80%甘油使甘油終濃度為20%，將蛋白分裝 成20化/管。
[0154] (8)處理超濾管：用Ξ蒸水輕輕洗幾遍，加入0.2M的化0H溶液，室溫放置20min，5， OOOg離屯、lOmin。倒出殘留液，將管忍浸入裝有化Ξ蒸水的燒杯中，放置幾小時，再換新的 水，如此幾次不斷稀釋NaOH的濃度。最后管忍和收集管中都加滿Ξ蒸水，4°C保存。
[0155] 2.5.3蛋白的濃度測定
[0156] 采用化a壯ord蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白質濃度。
[0157] (1)完全溶解蛋白標準品BSA，取10化用0.9%化(：1稀釋至10041^，使終濃度為 0.5mg/mL作為標準品。
[015引 （2)將標準品按0，1，2,4,8，12，16,20化加到96孔板中，加 0.9%化(：1補足到20化。 各做Ξ個平行。
[0159] (3)用0.9%NaCl適當稀釋留取的蛋白樣品，同樣加20化。各做3個平行。
[0160] (4)各孔加入20化1 G250染色液，室溫放置3-5min。
[0161] (5)用酶標儀測定595nm處的吸光值(A595)，根據標準品蛋白濃度和對應的吸光度 繪制標準曲線，根據標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。
[0162] 2.5.4蛋白電泳
[0163] 目的蛋白的表達及分離純化情況用變性的聚丙締酷胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electro地oresis,SDS-PAGE)進行檢測。
[0164] (1)采用垂直板式電泳。將玻璃板固定到膠架上。
[0165] (2)配分離膠:按照下表中的比例配制12%分離膠，加水封閉，靜置直至凝固。
[0166] (3)配濃縮膠:倒出上層水并用濾紙吸盡多余的水。配制5%的濃縮膠，混勻后立即 倒入，將梳子插入到玻璃板間，注意不要產生氣泡，凝固后拔出梳子。
[0167] SDS-PAGE分離膠和濃縮膠的配制溶液及比例如下：
[016 引
[0169] (4)樣品處理及上樣:將蛋白上清液和純化的蛋白分別與5X loading buffer按比 例混合，沸水煮5min，12,00化pm離屯、lOmin，取上清20化上樣。同時吸取蛋白Marker 5化點 樣。
[0170] (5)電泳：向電泳槽中加入電泳緩沖液，加樣后120V恒壓電泳，約化漠酪藍至膠的 下沿，停止電泳。
[0171] (6)染色:取下膠，置于考馬斯亮藍R-250染色液浸泡，室溫下輕搖染色化。
[0172] (7)脫色：用蒸饋水沖洗掉膠表面的染色液，然后置于脫色液中脫色1-化，其間更 換脫色液數次，至背景干凈。
[0173] (8)觀測結果:照相保存并分析，見圖2。
[0174] 實施例3、蛋白體外活性分析
[0175] 3.1咖啡酷輔酶A的合成
[0176] 蛋白MpaOMTl的底物咖啡酷輔酶A無市售，參考文獻并結合4-香豆酷輔酶A連接酶 (4-coumarate CoA ligase，4化)的催化特征，W酶法催化獲得，過程如下：
[0177]
[0178] 按上述體系30°C反應過夜后，煮沸2分鐘，待溫度降至室溫時加 ImL 6N HC1，混勻 后用等體積乙酸乙醋萃取Ξ次除去咖啡酸，待乙酸乙醋揮發完后，加44%醋酸錠至4% (W/ V)，5000rpm離屯、5分鐘，將上清加到預處理的lOOOmg LC-18 S陽柱（Supelco ,Bellefonte, USA)中。
[0179] 先加 lOmL 4%的乙酸錠除去CoA(至紫外分光光度計檢測流出的濾液無 CoA)，再用 Ξ蒸水將咖啡酷輔酶A沖下(每管接1ml液體，沖洗速度《5ml/min)，邊接邊檢測，棄掉第1管 (含大量CoA及微量的咖啡酷輔酶A)，將含咖啡酷輔酶A的2-10管依次合并到玻璃瓶中，-80 °C預凍后凍干;將凍干后的粉末用Ξ蒸水溶解后，紫外分光光度計檢測最大吸收波長處的 吸光度，應用郎伯-比爾定律公式計算咖啡酷輔酶A的濃度:Α= εα(Α:吸光度;ε :吸光系數， Caf f eoyl-CoA 6 346nm= 18000M-icm-i; C:樣品濃度；U光程）。將咖啡酷輔酶A溶液稀釋到 364nm處的吸光度為0.3-0.7，根據稀釋倍數和吸光度計算咖啡酷輔酶A的濃度。圖3為咖啡 酷輔酶A、CoA、咖啡酸紫外吸收曲線。
[0180] 附；
[0181] (ULC-18 S陽柱預處理:依次用5個柱體積(約用10ml)的甲醇/乙臘、蒸饋水、4% 醋酸錠沖洗。
[0182] (2)SPE柱用完后依次用Ξ蒸水，50%的甲醇，純甲醇沖洗。
[0183] 3.2體外酶活
[0184] 測定MpaOMTl的體外酶活功能，W加入pET32a蛋白的反應體系為對照組。底物包 括:咖啡酷輔酶A、咖啡酸、咖啡醒、咖啡醇、5-徑基阿魏酸、5-徑基松柏醒、5-徑基松柏醇、秦 皮乙素、木犀草素、搬皮素、圣草酪、山奈酪、二氨山奈酪、楊梅素、甘草素、抽皮素。體系如 下：
[0185]
[0186] 將上述組分混勻后，最后加蛋白開始計時，37 °C解育1.化，加入C出CN( 100化)終止 反應。當W咖啡酷輔酶A為底物時，加5M化0H( 1化L)終止反應，40°C解育20min水解咖啡酷 輔酶A的硫醋鍵；用6M HC1 (2祉L)中和后，等體積的乙酸乙醋萃取咖啡酸和阿魏酸，乙酸乙 醋揮發后加甲醇(5化L)重溶。
[0187] Mgh依賴性試驗是在上述反應體系的基礎上用相同濃度的抓TA二鋼替換MgCl2進 行。
[0188] 3.3酶活產物分析
[0189] 反應產物用反向HPLC鑒定，分析柱為:Z0RBAX SB-C18，5皿，4.6 X 150mm(Agilent) 色譜柱;流速l.OmL/min;進樣量20化;檢測波長包含254nm、280皿、320皿、346皿;流動相如 下：
[0190] a.苯丙素類化合物及秦皮乙素的分析條件
[0191]
[0192] b.黃酬類化合物的分析條件(木犀草素、搬皮素、圣草酪、山奈酪、二氨山奈酪、楊 梅素、甘草素、抽皮素）
[0193]
[0194]
[0195] 結果顯示MpaOMTl對山奈酪、二氨山奈酪、甘草素、抽皮素不含有鄰苯二酪結構的 黃酬沒有催化活性，對咖啡醒活性極小，可催化的底物及生成的產物見圖4,催化效率見表 1〇
[0196] 表1 MpaOMTl對部分底物的催化效率
[0197]
[0198] 3.4 W楊梅素為底物時催化產物制備及結構鑒定
[0199] W楊梅素為底物，PaOMTl為催化劑，將酶活體系擴大到200mL，37 °C反應4h，依次用 200mL乙酸乙醋、160mL乙酸乙醋加40mL石油酸、120mL乙酸乙醋加80mL石油酸萃取，將乙酸 乙醋和石油酸減壓蒸干，用甲醇重溶，過0.22皿的濾膜，HPLC制備。制備柱:Z0RB0X SB C18， 5皿，9.4X250mm(Agilent)色譜柱；57%的甲醇化0)，流速1.5血/min;進樣量70μレ檢測波 長為370nm。分離得到產物1和2的混合物、產物3、產物4。將產物1和2的混合物蒸干后用相同 的制備柱二次制備：50%的甲醇化2〇)，流速1.5mL/min;進樣量35化。分離得到產物1、產物 2。取微量測質譜，剩余部分用気代丙酬重新溶解后檢測核磁數據，W確定產物結構，產物結 構及測試方法如表2所示。
[0200] 表 2
[0201]
[0202] 實施例4基因亞細胞定位
[0203] 4.1 MpaOMTl定位載體的構建
[0204] 用Gateway 構建 MpaOMTl 的定位載體 Mpa0MTl-pGWB5-GFP:
[0205] (1)擴增：WMpa0MTl-pET32a為模板，MPaOMTl-GFP-F/R為引物；
[0206] MpaOMTl-GFP-F：GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTAACCATGGCGACCGA AGCCGCTGT；(SEQ ID No.7)
[0207] MpaOMT1-GFP-R:GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTACCACTCTGCGGCAAAGTG。（沈Q ID No.8)
[020引（2)BP 反應：
[0209]
[0210] 混勻后，25°C解育比，加 0.5化Proteinase Κ solution終止反應，輕輕滿旋后，37 。(:水浴 lOmin;
[0211] (3)反應產物轉化D冊a(Gent lOOyg/mL);
[0212] (4)驗證陽性，送測序；
[0213] (5)LR 反應：
[0214]
[0215] 25Γ解育化后，加 0.5化 Proteinase K solution終止反應，37Γ培養lOmin;
[0216] (6)轉化D冊α化an lOOyg/mL)，陽性鑒定。
[0217] 4.2農桿菌感受態制備
[0218] (1)取凍存于-80°C的農桿菌EHA105(購自Invihogen公司）劃含利福平10化g/mL 的YEP固體培養基，30°C靜置培養36h;
[0219] YEP固體培養基:酵母提取物lOg，蛋白腺lOg，化Cl 5g，加水定容至1L。分裝后加瓊 脂至2%，高壓蒸汽滅菌。
[0220] (2)挑單克隆于Rif抗性的液體YEP培養基中，30°C，搖過夜，制得培養液；
[0221] YEP液體培養基:酵母提取物lOg，蛋白腺lOg，化C1 5g，加水定容至1L。高壓蒸汽滅 -tt： 園〇
[0222] (3)將步驟(2)制得的培養液按體積比1:50的比例接種至50mL Rif抗性的液體YEP 培養基中，繼續培養至〇〇6日日為0.4~0.6;
[0223] (4)菌液冰浴30min后，4°C5,000巧m離屯、5min，棄掉上清；
[0224] (5川欠集的菌體重懸于6mL預冷的0.15M氯化鋼溶液中，4°C5,00化pm離屯、5min，棄 上清；
[0225] (6)收集的菌體再次用60化1 20mM預冷的氯化巧溶液重懸，分裝成10化17管，制得 農桿菌感受態細胞，液氮速凍后-80°C保存備用。
[02%] 4.3凍融法轉化農桿菌
[0227] (1)取出農桿菌感受態細胞，冰上融化，分別加入化L質粒Mpa0MTl-pGWB5用移液槍 輕柔地吹打混勻，冰上放置25min;
[0228] (2)液氮速凍60s，然后于37 °C水浴保溫3min;
[02巧](3)加入40化L無抗性YEP液體培養基，30 Γ振蕩培養地；
[0230] (4)待其復蘇后，取20化L菌液涂于含利福平10化g/mL，含卡那霉素 50yg/mL的YEP 固體培養基上。30°C靜置培養36h;
[0231] (5)挑取長出的單克隆進行小量振蕩培養，菌落PCR鑒定其陽性，制得攜帶質粒 Mpa0MTl-pGWB5 的農桿菌 EHA105。
[0232] 4.4亞細胞定位
[0233] 應用煙草瞬時轉化法確定目的基因的亞細胞定位：
[0234] (1)目的基因重組載體用熱激發轉入根癌農桿菌EHA105中；
[0235] (2)將陽性的EHA105菌株和P19分別接種到lOmL的YEP液體培養基化an lOOyg/血， Rif 50yg/mL)中，28°C 180巧m培養至00600 = 0.5;
[0236] (3)400化pm，25°C離屯、20min收集菌體，然后用等體積的轉化液洗涂；
[0237] (4)菌體用少量轉化液重懸，使0D600=1;分別取ImL的P19和EHA105混合，置于室 溫下放置2-化；
[0238] (5)用ImL的注射器將農桿菌滲透到煙草葉片的下表皮細胞中；
[0239] (6)3化后，取經農桿菌滲透的葉片在激光共聚焦顯微鏡上檢測下表皮細胞的巧光 信號（設置488nm的氣激發光，GFP信號的發射光波長495-570nm，葉綠體發出的信號波長 650-760nm)。結果見圖 5。
[0240] 上述雖然結合附圖對本發明的【具體實施方式】進行了描述，但并非對本發明保護范 圍的限制，所屬領域技術人員應該明白，在本發明的技術方案的基礎上，本領域技術人員不 需要付出創造性勞動即可做出的各種修改或變形仍在本發明的保護范圍W內。
【主權項】
1. 一種粗裂地錢氧甲基轉移酶，其氨基酸序列為以下之一： (1) SEQ ID No.l所示的氨基酸序列；或 (2) 將SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失 和/或添加且功能相同的蛋白質。2. 權利要求1所述粗裂地錢氧甲基轉移酶的編碼基因。3. 如權利要求2所述的編碼基因，其特征在于，其核苷酸序列為以下之一： (1) SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或 (2) 與SEQ ID No.2所示的核苷酸序列具有90%以上同源性且編碼相同功能蛋白質的 核苷酸序列。4. 含有權利要求2或3所述編碼基因的表達載體。5. 如權利要求4所述的表達載體，其特征在于，所述表達載體為重組原核表達載體或重 組植物表達載體。6. 如權利要求5所述的表達載體，其特征在于，所述重組原核表達載體為：在表達載體 pET32a中插入權利要求2或3所述編碼基因； 所述重組植物表達載體為:在表達載體PGWB5中插入權利要求2或3所述編碼基因。7. 含有權利要求4、5或6所述表達載體的重組細胞、轉化體或轉基因細胞系。8. 如權利要求7所述的重組細胞、轉化體或轉基因細胞系，其特征在于，所述重組細胞 為含有權利要求4、5或6所述表達載體的細胞BL21或細胞EHA105。9. 用于擴增權利要求2或3所述編碼基因的引物對，其核苷酸序列分別如SEQ ID No.3 和SEQ ID No.4所示。10. 權利要求1所述的粗裂地錢氧甲基轉移酶在制備生產甲基化的苯丙素、香豆素或黃 酮類化合物中的應用。
【文檔編號】C12N15/82GK106011097SQ201610334622
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月19日
【發明人】程愛霞, 許瑞雪, 劉慧
【申請人】山東大學