工程化酮還原酶多肽及其用于制備(s)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法
【專利摘要】本發明公開了一種工程化酮還原酶多肽及其用于制備(S)?3?(二甲胺基)?1?(噻吩?2?基)?1?丙醇的方法，與現有技術相比，在制備(S)?3?(二甲胺基)?1?(噻吩?2?基)?1?丙醇的過程中采用了本發明的工程化酮還原酶多肽，使得整個反應過程酶量用量低、反應時間短、底物濃度高，更加適合產業化應用。
【專利說明】
工程化酬還原酶多化及其用于制備(S)-3-(二甲胺基)-1-(喔 吩-2-基)-1-丙醇的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物制藥和生物轉化領域，具體設及一種工程化酬還原酶多膚及其用 于制備(S)-3-(二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇的方法。
【背景技術】
[0002] 度洛西汀(Duloxetine)是一種低副作用的，能夠有效治療精神素亂和代謝素亂的 藥物化S patent 5,023,269)。合成度洛西汀的關鍵是獲得含有手性中屯、的中間體(S)-3- (二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇(DMM)。不對稱還原3-(二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1- 丙酬(DMK)得到該中間體是目前最有效、研究最多的方法，其反應過程如下所示：
[0003]
[0004] 化學方法還原的經濟性、安全性和環境友好性較低。生物酶法還原得如美國專利 US patent 2010/01515%等報道，公開了一種利用酬還原酶化RED)生產（S)-3-(二甲胺 基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇的方法，該方法酶量較高(0.6%)，反應時間長(3化），底物濃度 低(15%)。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種工程化酬還原酶多膚及其用于制 備(S)-3-(二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇的方法。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用的技術方案是：一種能夠將底物3-(二甲胺基)-1- (嚷吩-2-基)-1-丙酬還原成產物(S)-3-(二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇的工程化酬還 原酶多膚，所述的酬還原酶多膚的氨基酸序列與序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、 26、28、30、32、34、36、38、40、42及44中的任一序列具有至少90%的同源性。其中，序列2為來 自Candida magnoliae的野生型酬還原酶，其他的序列通過易錯PCR等隨機突變和活性位點 盒式突變(CASTing)等定點突變方法獲得，突變體獲得增強的活性和穩定性，可W通過高通 量篩選化TS)等方法探知，上述的改變氨基酸序列和篩選突變體庫方法，均為本領域內的常 規技術。
[0007] 本發明提供了一種編碼多膚的多核巧酸。優選地，所述的多核巧酸選自序列1、3、 5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。
[000引本發明還提供了一種表達載體，包含與適合指導在宿主細胞中表達的控制序列可 操作地連接的所述的多核巧酸。優選地，該多核巧酸的序列為SEQ ID N0:43。該表達載體為 pET30a0
[0009]本發明還提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含上述的表達載體，如大腸桿菌、 枯草芽抱桿菌、地衣芽抱桿、黑曲霉、釀酒酵母和畢赤酵母等。優選地，該宿主細胞為大腸桿 困。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種使用上述酬還原酶多膚生物催化制備(S)-3-(二 甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇的方法，所述方法W3-(二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙 酬為底物，在適于將其不對稱還原為(S)-3-(二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇的反應條 件下與上述酬還原酶多膚接觸。
[0011] 優選地，所述反應是在輔酶和輔酶再生系統的存在下，在pH為6.0~8.0、溫度為25 °C~35°C的緩沖溶液中進行的，其中，所述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統為葡萄糖和 葡萄糖脫氨酶。常見的輔因子再生系統包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脫氨酶、甲酸和甲酸 脫氨酶、葡萄糖-6-憐酸和葡萄糖-6-憐酸脫氨酶、仲醇(如異丙醇)和仲醇脫氨酶、亞憐酸和 亞憐酸脫氨酶、分子氨和氨化酶W及電化學等方法。
[0012] 優選地，所述葡萄糖脫氨酶為購自蘇州漢酶生物技術有限公司生產的牌號為 EW002的葡萄糖脫氨酶。
[0013] 由于上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：在制備（S)-3- (二甲胺基)-1-(嚷吩-2-基)-1-丙醇的過程中，采用了本發明的工程化酬還原酶多膚，與現 有技術相比，其酶量用量低(0.3 % )，反應時間短（1化），底物濃度高（20 % )，更加適合產業 化應用。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于W下實施 例。實施例中采用的實施條件可W根據具體使用的不同要求做進一步調整，未注明的實施 條件為常規實驗中的條件。
[001引實施例1(酬還原酶的制備）
[0016] 采用常規方法制備獲得了酬還原酶催化劑:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43的基因片段由蘇州金唯智生物科技有限公司 合成，與祀T30a(Novagen)質粒的酶切產物連接，轉入感受態E. CO1 i BL21 (DE3)菌株，篩選 得到陽性克隆子，接種到含有抗性的液體LB培養基中，于37°C培養至0D600至0.8,加入誘導 劑IPTG，繼續培養16小時，離屯、收集沉淀，加入憐酸鹽緩沖液懸浮，冰水浴中超聲波破碎10 分鐘，離屯、取上清，冷凍得到酬還原酶酶粉。
[0017] 實施例2(酬還原酶的篩選）
[001 引 由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43在 大腸桿菌中表達獲得的酬還原酶2mg，G畑(采購自蘇州漢酶生物技術有限公司，牌號EW002) 2mg，NADP Img，底物DMAK 50mg、葡萄糖50mg加至裝有2mL 0.05ΜΞ乙醇胺緩沖液的5血反應 器中，30°C 1000巧m攬拌，化后取樣HPLC檢測，序列43的轉化率和ee均為>99%，因此采用序 列43作為進一步研究對象。
[0019] 實施例3(酶催化反應）
[0020] 向50mL反應Ξ口瓶中依次加入2.0g底物DMAK，3g葡萄糖，9mL 0.05M pH 7.0Ξ乙 醇胺緩沖液，溫度調節至30°C，900r/min攬拌，W濃度為15%的化2〇)3溶液維持反應體系抑 至7.0,向反應瓶中加入含有6mg酬還原酶（由序列43在大腸桿菌中表達獲得），6mg葡萄糖脫 氨酶(采購自蘇州漢酶生物技術有限公司，牌號EW002)和0.5mg NADP的Ξ乙醇胺緩沖液，反 應12h，HPLC檢測轉化率99%，加熱濃縮至體積lOmL，過濾取濾液，采用濃度為25%的NaO田容 液調節抑至12.0-12.5之間，冰水浴降溫至0°C，保溫12h，過濾得到產品1.7g，含量95%。 [0021]上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人 ±能夠了解本發明的內容并據W實施，并不能W此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明 精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種能夠將底物3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮還原成產物(S)-3-(二甲胺 基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的工程化酮還原酶多肽，其特征在于，所述的酮還原酶多肽的 氨基酸序列與序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42及44 中的任一序列具有至少90%的同源性。2. 編碼如權利要求1所述的多肽的多核苷酸。3. 根據權利要求2所述的多核苷酸，其選自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43中的任一序列。4. 一種表達載體，包含與適合指導在宿主細胞中表達的控制序列可操作地連接的權利 要求3所述的多核苷酸。5. 根據權利要求4所述的表達載體，其為pET30a。6. -種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求4所述的表達載體。7. 根據權利要求6所述的宿主細胞，其為大腸桿菌。8. -種使用權利要求1中所述的酮還原酶多肽生物催化制備(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻 吩-2-基)-1_丙醇的方法，其特征在于，所述方法以3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙酮 為底物，在適于將其不對稱還原為(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的反應條件 下與權利要求1所述的酮還原酶多肽接觸。9. 根據權利要求8所述的制備(S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，其特 征在于，所述反應是在輔酶和輔酶再生系統的存在下，在pH為6.0~8.0、溫度為25°035°C的 緩沖溶液中進行的，其中，所述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統為葡萄糖和葡萄糖脫氫 酶。10. 根據權利要求8所述的制備（S)-3-(二甲胺基)-1-(噻吩-2-基)-1-丙醇的方法，其 特征在于，所述葡萄糖脫氫酶為購自蘇州漢酶生物技術有限公司生產的牌號為EW002的葡 萄糖脫氫酶。
【文檔編號】C12N1/21GK106011096SQ201610597311
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月27日
【發明人】付敏杰, 張濤
【申請人】蘇州漢酶生物技術有限公司