工程化酮還原酶多肽及使用其制備依替米貝中間體的方法
【專利摘要】本發明公開了一種工程化酮還原酶多肽及使用其制備依替米貝中間體的方法，在制備依替米貝中間體的過程中，采用本發明的工程化酮還原酶多肽，與現有技術相比，酶用量低、反應時間短、底物濃度高，更加適合產業化應用。
【專利說明】
工程化酬還原酶多化及使用其制備依替米貝中間體的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物制藥和生物轉化領域，具體設及一種工程化酬還原酶多膚及使用 其制備依替米貝中間體的方法。
【背景技術】
[0002] 依替米貝化zetimibe)是一種新型選擇性膽固醇吸收抑制劑，由于與現有的他汀 類降血脂藥物有不同的作用機制，因此具有穩定的市場份額。制備其中間體(S)-3-((S)-5- (4-氣苯基)-5-?基戊酷基)-4-苯基-2-酬基-嗯挫燒(2)的方法有重要的應用價值。可W通 過由還原(S)-1-(4-氣苯基)-5-(2-酬-4苯基嗯挫燒-3-基)-1,5-二酬戊燒(1)的反應獲得：
[0003]
[0004] 化學法還原如專利CN 103965089、CN 104402790和文獻Journal of Labelled Compounds&Radio地armaceuticals,45(2), 145-155;2002等報道，采用棚燒等高危試劑和 極端反應條件，存在應用風險。生物法如專利W0 2010025085和文獻化em. Commun .，2015， 51,12328-12331報道，采用醇脫氨酶和酬還原酶催化反應。目前生物法中存在的問題是方 法存在酶量較高(2.3%)，反應時間長（1化），底物濃度低（13%)和有機溶劑用量(25%)較 局等問題。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種工程化酬還原酶多膚及使用其制 備依替米貝中間體的方法。
[0006] 為達到上述目的，本發明采用的技術方案是:一種能夠將底物(S)-1-(4-氣苯基)- 5-(2-酬-4苯基嗯挫燒-3-基)-1,5-二酬戊燒轉化為產物(S)-3-((S)-5-(4-氣苯基)-5-徑 基戊酷基)-4-苯基-2-酬基-嗯挫燒的工程化酬還原酶多膚，所述的酬還原酶多膚的氨基酸 序列與序列2、4、6、10、12、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46中的 任一序列具有至少90%的同源性。其中，序列2為來自化11山(13 1]1曰旨]1〇11曰6的野生型酬還原 酶，其他的序列通過易錯PCR等隨機突變和活性位點盒式突變(CASTing)等定點突變方法獲 得，突變體獲得增強的活性和穩定性，可W通過高通量篩選化TS)等方法探知，上述的改變 氨基酸序列和篩選突變體庫方法，均為本領域內的常規技術。
[0007] 本發明提供了一種編碼多膚的多核巧酸。優選地，所述的多核巧酸，其選自序列1、 3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45中的任一序列。
[000引本發明提供了一種表達載體所述表達載體包含與適合指導在宿主細胞中表達的 控制序列可操作地連接的多核巧酸。優選地，該多核巧酸的序列為SEQ ID NO:45。該表達載 體為祀T30a。
[0009] 本發明還提供了一種宿主細胞，所述宿主細胞包含上述表達載體，如大腸桿菌、枯 草芽抱桿菌、地衣芽抱桿、黑曲霉、釀酒酵母和畢赤酵母等。優選地，該宿主細胞為大腸桿 困。
[0010] 本發明的另一個目的是提供一種所述的酬還原酶多膚生物催化制備依替米貝中 間體的方法，所述方法W化合物1為底物，在適于將其還原為化合物2的反應條件下與上述 的酬還原酶多膚接觸，其中：
[0011] 所述化合物1的結構式為：
[0012]
[0013] 所述化合物2的結構式為：
[0014]
〇
[0015] 優選地，所述反應在輔酶和輔酶再生系統的存在下，在抑為6.0~8.0、溫度為25°C ~30°C的緩沖溶液中進行，其中，所述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統為葡萄糖和葡萄 糖脫氨酶。常見的輔因子再生系統包括但不限于葡萄糖和葡萄糖脫氨酶、甲酸和甲酸脫氨 酶、葡萄糖-6-憐酸和葡萄糖-6-憐酸脫氨酶、仲醇(如異丙醇)和仲醇脫氨酶、亞憐酸和亞憐 酸脫氨酶、分子氨和氨化酶W及電化學等方法。
[0016] 進一步優選地，所述的葡萄糖脫氨酶為購自蘇州漢酶生物技術有限公司生產的牌 號為EW002的葡萄糖脫氨酶。
[0017] 優選地，所述的還原反應在助溶劑條件下進行，所述的助溶劑為甲苯。
[0018] 由于上述技術方案的運用，本發明與現有技術相比具有下列優點：在制備依替米 貝中間體的過程中，采用了工程化酬還原酶，克服了現有技術中采用化學法制備中所存在 的應用風險;采用生物法制備過程中存在的酶用量高、反應時間長、底物濃度低、有機溶劑 用量高的問題，本發明采用了工程化酬還原酶作為生物催化劑，使得整個制備過程中，酶用 量低（1 % )、反應時間短（1化），底物濃度高，可達15 %，更加適合產業化應用。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合具體實施例對本發明做進一步詳細的說明，但本發明并不限于W下實施 例。實施例中采用的實施條件可W根據具體使用的不同要求做進一步調整，未注明的實施 條件為常規實驗中的條件。
[0020] 實施例1(酬還原酶的制備）：
[0021] 采用常規方法制備獲得了酬還原酶催化劑:序列表中1、3、5、7、9、11、13、15、17、 19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45的基因片段是由蘇州金唯智生物科技有限 公司合成，與祀T30a(Novagen)質粒的酶切產物連接，轉入感受態E.coli BL2UDE3)菌株， 篩選得到陽性克隆子，接種到含有抗性的液體LB培養基中，于37°C培養至0D600至0.8,加入 誘導劑IPTG，繼續培養16小時，離屯、收集沉淀，加入憐酸鹽緩沖液懸浮，冰水浴中超聲波破 碎10分鐘，離屯、取上清，冷凍得到酬還原酶酶粉。
[0022] 實施例2(酬還原酶的篩選）
[0023] 由序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45 分別在大腸桿菌中表達獲得的酬還原酶2mg，葡萄糖脫氨酶(采購自蘇州漢酶生物技術有限 公司，牌號EW002)2mg，NADP Img，底物(S)-1-(4-氣苯基)-5-(2-酬-4苯基嗯挫燒-3-基)-1， 5-二酬戊燒50mg、葡萄糖50mg加至裝有2mL 0.05ΜΞ乙醇胺緩沖液的5mL反應器中，30°C lOOOrpm攬拌，比后取樣，HPLC檢測，序列45的轉化率和ee均為>99%。因此，采用序列45作為 進一步研究對象。
[0024] 實施例3(酶催化反應）：
[0025] 向50mL反應Ξ口瓶中依次加入50mg酬還原酶（由序列45在大腸桿菌中表達獲得）， lOmg葡萄糖脫氨酶(采購自蘇州漢酶生物技術有限公司，牌號EW002)和4mg NADP的Ξ乙醇 胺緩沖液，5g底物(S)-1-(4-氣苯基)-5-(2-酬-4苯基嗯挫燒-3-基)-1,5-二酬戊燒，3.5g葡 萄糖，27mL0.05MpH7.0Ξ乙醇胺緩沖液，6mL甲苯，溫度調節至3(rC，900r/min攬拌，15% 化2〇)3溶液維持抑至7.0，反應12h，HPLC檢測轉化率99%，等體積乙酸乙醋萃取3次，合并有 機相，旋蒸得到產品4.8g，含量98%。
[0026] 上述實施例只為說明本發明的技術構思及特點，其目的在于讓熟悉此項技術的人 ±能夠了解本發明的內容并據W實施，并不能W此限制本發明的保護范圍。凡根據本發明 精神實質所作的等效變化或修飾，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種能夠將底物(S)-1-(4-氟苯基)-5-(2-酮-4苯基噁唑烷-3-基)-1，5_二酮戊烷轉 化為產物(S)-3-((S)-5-(4-氟苯基)-5-羥基戊酰基)-4-苯基-2-酮基-噁唑烷的工程化酮 還原酶多肽，以其特征在于，所述的酮還原酶多肽的氨基酸序列與序列2、4、6、10、12、14、 16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46 中的任一序列具有至少 90% 的同源 性。2. -種編碼如權利要求1所述的多肽的多核苷酸。3. 根據權利要求2所述的多核苷酸，其選自序列1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45中的任一序列。4. 一種表達載體，所述表達載體包含與適合指導在宿主細胞中表達的控制序列可操作 地連接的權利要求3所述的多核苷酸。5. -種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求4所述的表達載體。6. 根據權利要求5所述的宿主細胞，其為大腸桿菌。7. -種使用權利要求1中所述的酮還原酶多肽生物催化制備依替米貝中間體的方法， 其特征在于，所述方法以化合物1為底物，在適于將其還原為化合物2的反應條件下與權利 要求1所述的酮還原酶多肽接觸，其中： 所述化合物1的結構式為： 所述化合物2的結構式38. 根據權利要求7所述的制備依替米貝中間體的方法，其特征在于，所述反應在輔酶和 輔酶再生系統的存在下，在PH為6.0~8.0、溫度為25°C~30°C的緩沖溶液中進行，其中，所 述的輔酶為NADP，所述的輔酶再生系統為葡萄糖和葡萄糖脫氫酶。9. 根據權利要求8所述的制備依替米貝中間體的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脫氫 酶為購自蘇州漢酶生物技術有限公司生產的牌號為EW002的葡萄糖脫氫酶。10. 根據權利要求7所述的制備依替米貝中間體的方法，其特征在于，所述的還原反應 在助溶劑條件下進行，所述的助溶劑為甲苯。
【文檔編號】C12N15/53GK106011095SQ201610596717
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月27日
【發明人】付敏杰, 魏喜換
【申請人】蘇州漢酶生物技術有限公司