一種酶活性提高的葡萄糖氧化酶突變體god-m01及其表達載體和應用
【專利摘要】本發明提供了一種酶活性提高的葡萄糖氧化酶突變體GOD?M01及其表達載體和應用。本發明以根據巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）的密碼子偏好性進行過優化的葡萄糖氧化酶為基礎，使用易錯PCR 方法對該酶基因進行突變，再通過高通量篩選方法挑選出正突變，獲得了酶活提高的葡萄糖氧化酶突變體GOD?M01，與原始基因產生的酶活相比，其酶活提高了47%，從而有利于實現其在工業化生產中降低生產成本的目的，本發明所提供的葡萄糖氧化酶突變體GOD?M01具有良好的市場應用前景和工業價值。
【專利說明】
-種酶活性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01及其表達載 體和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于基因工程和酶工程領域，具體內容設及一種酶活性提高的葡萄糖氧化 酶突變體G0D-M01及其表達載體和應用。
【背景技術】
[0002] 葡萄糖氧化酶(glucose oxidase, E.C.1.1.3.4, GOD)有氧條件下能專一性地 催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和過氧化氨，在工業領域具有重要的應用價值，目前已經在 食品工業、畜牧養殖和醫療檢測等領域中得到廣泛應用。葡萄糖氧化酶廣泛分布于動植物 和微生物體內，微生物是其主要來源，主要生產菌株為黑曲霉和青霉。產自特異青霉和黑曲 霉的葡萄糖氧化酶已被列入農業部《飼料添加劑品種目錄(2013)》第4大類酶制劑。隨著葡 萄糖氧化酶越來越多的被應用于各個領域，工業上尤其是飼料工業對其現有性能有了越來 越高的要求，其中葡萄糖氧化酶的催化效率決定了其應用成本，只有具有較高的酶活的葡 萄糖氧化酶才能有效控制成本，從而適應大規模工業化生產的要求，實現產品市場化和商 業化。篩選高酶活的天然葡萄糖氧化酶是一條重要途徑，而使用蛋白質工程手段對天然葡 萄糖氧化酶的人工改造也越來越廣泛地被應用。
[0003] 易錯PCR(e;r;ro;r-p;rone PCR)技術是在利用化q酶進行PCR擴增目的基因時，通過調 整反應條件(如提高酶離子濃度，改變體系中4種dNTP的濃度等），改變化q酶的突變頻率，從 而向目的基因中W-定頻率引入突變，構建突變庫，然后選擇或篩選需要的突變體。為了獲 得更好的突變效果，可W使用連續易錯PCR (sequential error prone PCR)策略，即將一 次PCR擴增得到的正突變基因作為下一次PCR擴增的模板，連續反復地進行隨機誘變，使每 一次擴增得到的正向突變累積而產生重要的有益突變。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是提供了一種酶活性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01及其表達 載體和應用。本發明通過對來源于黑曲霉Uwer扣7扣S nigwO的葡萄糖氧化酶進行蛋白 質工程改造，使用易錯PCR方法對葡萄糖氧化酶糖酶G0D-1基因進行突變，再通過高通量篩 選方法將正突變檢出，獲得了突變體蛋白，與野生型相比，突變體G0D-M01的酶活性得到顯 著提高。
[0005] 為實現上述發明目的，本發明采用W下技術方案予W實現： 本發明提供了一種酶活性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01，所述的葡萄糖氧化酶 突變體G0D-M01的氨基酸序列如SEQ ID ^):3所示，所述的突變體600-101由氨基酸序列為 SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由蘇氨酸變為鄉氨酸獲得。
[0006] 本發明還提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01的葡萄糖氧化酶編碼基因。
[0007] 進一步的，所述的葡萄糖氧化酶編碼基因具有如SEQ ID N0:4所示的核巧酸序列。 [000引本發明還提供了含有所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組表達載體。
[0009] 進一步的，所述重組表達載體為重組酵母表達質粒PPIC9K- GOD-MOl。
[0010] 本發明還提供了含有所述的重組表達載體的重組菌株。
[0011] 進一步的，所述重組菌株為重組畢赤酵母。
[0012] 本發明還提供了所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01在用于制備動物飼料添加劑 中的應用。
[0013] 進一步的：將所述的葡萄糖氧化酶編碼基因與表達載體連接構建重組表達載體， 將重組表達載體轉化到宿主細胞中，獲得重組宿主菌株，培養重組宿主菌株并誘導重組葡 萄糖氧化酶的表達，獲得葡萄糖氧化酶。
[0014] 進一步的:所述宿主細胞為畢赤酵母。
[0015] 本發明的優點和技術效果是：本發明首先合成了葡萄糖氧化酶G0D-1全基因序 列，同時根據己斯德畢赤酵母密碼子偏好性對其DNA序列進行優化獲得優化的基因，并采 用易錯PCR方法對其進行隨機突變，W祀T 28a( + )載體構建高效突變庫，再將含有突變基 因的質粒轉入表達宿主中，挑選單克隆表達蛋白，同時每個孔板接種野生型基因表達菌株 作為對照。離屯、重懸后，取部分菌液測定酶活性。活性高于對照的菌株轉接到新的培養板 中，進行重復篩選。將篩選得到的酶活性高于對照的菌株，送基因測序公司測序，獲得突變 體G0D-M01的DNA序列。獲得的酶活提高的突變體G0D-M01，與原始基因產生的酶活相比，其 酶活提高了47%，從而有利于實現其在工業化生產中降低生產成本的目的，本發明所提供的 葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01具有良好的市場應用前景和工業價值。
【附圖說明】
[0016] 圖1為葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01與野生型氨基酸序列比較結果； 圖2為葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01與野生型的酶活比較測定結果。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合附圖和具體實施例對本發明的技術方案做進一步詳細的說明。W下結合 實施實例對本發明做進一步說明，需要指出的是，本實施例僅用于解釋本發明，而非對本發 明范圍的限制。
[0018] 實施例1:易錯PCR(error-prone PCR)方法構建葡萄糖氧化酶G0D-1突變文庫 來源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶G0D-1由589個氨基酸組成(見SEQ ID NO: 1)。為迅速得 至化0D-1全基因序列W利于對G0D-1酶分子的改造，根據已報道的G0D-1基因序列信息， 采用全基因合成方法合成了葡萄糖氧化酶G0D-1全基因序列（如Genbank ID KJ774107.1 所示），合成的基因兩端還帶有EcoR I和Not I酶切位點。同時根據己斯德畢赤酵母密碼子 偏好性對其DNA序列進行優化獲得優化后的葡萄糖氧化酶基因 G0D-1 (見SEQ ID N0:2)， 采用W優化后的GOD-1為模板擴增葡萄糖氧化酶糖酶GOD-1基因，使用GeneMorph II隨機 突變PCR試劑盒（Stratagene)隨機引入突變。
[0019]所用引物為： 5^-GCGCGAATTCTTGCCACATTACATTAGATCCAACGGTAT -3^(沈Q ID No:5)， 5'-TAAAGCGGCCGCTTATTGCATAGAAGCGTAATCTTCCAAAATAGC-3^(沈Q ID No:6); 下劃線處分別為EcoR I和Not I酶切位點。
[0020] 反應條件為：94° C預變性lOmin，94° C變性60s，58° C退火60s和72。C延伸 2min，共30個循環,1%瓊脂糖電泳，試劑盒回收目的基因片段。
[0021] 將目的片段用EcoR I和Not I雙酶切消化后，與經過相同酶切的pET 21a( + )載 體(氨節抗性基因）用Ligase進行連接反應。將連接好的片段轉化至大腸桿菌化21-DE3,涂 布含有氨節青霉素的LB平板，37Γ倒置培養，待平板上出現轉化子后，挑取單克隆至96孔 板，每孔中含有150uL LB培養基(含有ImM IPTG，50ng/mL氨節青霉素），同時每個孔板接種 野生型基因表達菌株作為對照，30°C 22化pm震蕩培養12h，將孔板置于-20°C，反復凍融破 壁，獲得含有葡萄糖氧化酶的粗酶液。取出5uL粗酶液至新的96孔板，加入含有鄰聯茵香胺 甲醇緩沖液、葡萄糖緩沖液、辣根過氧化物酶溶液的顯色液共14加 L，37°C反應3min后加入 100uL2M硫酸終止反應，根據顯色反應測定酶活。
[0022] 取酶活力比野生型G0D-1高的菌株到新的96孔培養板中，進行重復篩選。篩選到 其中一個突變體為G0D-M01，酶活力是野生型對照的1-2倍，挑取單克隆送基因測序公司測 序。
[0023] 巧崎結果顯示，如圖1所示，本輪易錯PCR獲得了一個含T173V單點突變的突變體 G0D-M01(其氨基酸序列為SEQ ID N0:3)，編碼產生突變體G0D-M01的葡萄糖氧化酶基因序 列如SEQ ID No:4所示。
[0024] 600-]\?)1:]\1111曰^〇11:1731'一￥(569 10齡：4與沈9 10齡：2相比，其0魁序列中第 173為氨基酸對應的核巧酸序列由ACT變為GTT，其余堿基序列相同）。
[0025] 實施例2:畢赤酵母工程菌株的構建 使用實施例1中所述引物，W實施例1獲得的突變體作為模板進行PCR擴增，得到了3條 兩端帶有EcoR I和Not I酶切位點的葡萄糖氧化酶突變體基因。PCR反應條件為:94°C變性 5min;94°C 變性 30s，56°C 復性 30s，72°C 延伸 2min，30 個循環，72°C 延伸 lOmin。
[0026] 將上述克隆得到的葡萄糖氧化酶突變體基因片段和原始葡萄糖氧化酶GOD-1的基 因片段，通過EcoR I和Not I位點與表達載體PPIC9K相連接，構建表達載體PPIC9K- G0D- M01和PPIC9K- G0D-1。
[0027] 將W上表達載體用Sail進行線性化，線性化片段用片段純化試劑盒（TaKaRa Mini邸ST DNA Fragment Purifibation Kit)純化收集后，通過電轉化方法轉化畢赤酵母 GS115，涂布MD平板。將在MD平板上生長出的菌落涂布到濃度依次逐漸升高（Img/mL，2mg/ mL，4mg/mL，8mg/mL)的遺傳霉素的YTO平板上篩選多拷貝的陽性轉化子，得到畢赤酵母重組 困株。
[002引獲得的轉化子命名為畢赤酵母G0D-M01 (仍cAia仍sioris G0D-M01)和畢赤酵母 G0D-1(仍cAia G0D-1)，分別挑取兩個基因的轉化子轉接于BMGY培養基中，30°C， 22化pm振蕩培養1她后，離屯、獲得菌體，將適量菌體轉入BMMY培養基中，使菌體濃度達到 00600=1，30°C，220巧m繼續振蕩培養，每2地添加培養體積1%的甲醇。誘導表達4d后，將培養 液離屯、獲得上清，將上清液進行葡萄糖氧化酶活力測定。 葡萄糖氧化酶酶活力檢測方法： 取鄰聯茵香胺緩沖液2.5血(0.1 mLl%鄰聯茵香胺甲醇儲備液加入到12血0.1M PH6.0 憐酸緩沖液配成），18%葡萄糖溶液0.3mL，0.03%過氧化物酶溶液0.1 mL，加入到比色管中37 。(:保溫5 min，再加入0.1 mL葡萄糖氧化酶酶液(空白管加入0.1血蒸饋水），反應3min后，加 入2M硫酸2mL，混勻W終止反應。W標準空白樣為空白對照，在540 nm波長處測定空白（Ao) 和試樣溶液(Ai)的吸光值。得出ΔΑ= A廣Ao 試樣酶活力計算： X=( AAXnX3)/(11.3XtX0.1) Τ-測定時間，min 0.1 -樣品體積，血 11.3-消光系數 N-稀釋倍數 3-反應液體積，mL 酶活單位與定義:在抑5.5、37°C的條件下，每分鐘能把Ι.Ομ mol的β-D-葡萄糖氧化成葡 萄糖酸和出化的酶量為一個單位。
[0029] 酶活測定結果：如圖2所示，按照上述方法測定得到畢赤酵母G0D-1發酵上清液的 酶活為53 U/mL，而畢赤酵母G0D-M01發酵上清液的酶活為78 U/mL，酶活水平提高了47%。
[0030] 實施例3:葡萄糖氧化酶的養殖應用實驗 3.1實驗設計 實驗過程選擇體況相似、健康無病的羅斯308肉維雞160000只，分為對照組和實驗組， 每組80000只，每組設置4個重復，每個重復20000只雞，1、3、5、7棟雞舍為實驗組，2、4、6、8棟 雞舍為對照組，其中實驗組在日糧中添加本發明提供的葡萄糖氧化酶G0D-M01，飼養期40 天，具體分組見表1。
[0031] 表1:實驗分組設計
3.2生產性能的測定 實驗開始第1天和第21、40天清晨對各組雞空腹稱重，記錄初始重和末重。飼養過程中， 觀察記錄各組雞的健康狀況(采食、飲水、精神狀態等），并詳細記錄每周每籠采食量，統計 實驗期內的平均日增重、平均日采食量和料重比。平均日采食量(g/d)=實驗期每組采食量/ 實驗天數?每組雞數;平均日增重(g/d)=實驗期每組增重/(實驗天數?每組雞數）；料重比 =飼料消耗量/增重。
[0032] 3.3數據統計與分析 實驗數據采用SPSS17.0統計軟件進行AN0VA分析，并進行Duncan多重性比較，代0.05為 差異顯著。數據W平均值±標準差(Mean±SE)表示。
[0033] 3.4實驗結果與分析 3.4.1平均日增重 肉雞各階段平均日增重見表2，肉雞的平均日增重在1-21日齡和22-40日齡實驗組較之 對照組都有不同程度的改善，分別提高了 0.90%和6.29%。在1-40日齡整個飼養周期，實驗組 可提高平均日增重3.8P/0。
[0034] 表2:肉雞各階段平均日增重(克）
3.4.2平均日采食量 肉雞各階段平均日采食量見表3，在整養殖過程，實驗組與對照組肉雞日采食量差異不 顯著(A0.05)，且對照組和實驗組日采食量基本一致。
[00巧]表3:肉雞各階段平均日采食量(克）
3.4.3料重比 肉雞各階段料重比見表4,在1-21日齡和22-40日齡實驗組較之對照組都有不同程度的 改善，分別降低了 7.90%和5.03%。從全期（1 -40日齡)來看，實驗組FCR較對照組降低了 6.06% (A0.05)。
[0036] 表4:肉雞各階段料肉比(FCR) _^^
從W上實驗結果可W看出，添加了葡萄糖氧化酶G0D-M01的實驗組與對照組相比，在采 食量一致的情況下，平均日增重有所增加，而料重比有所下降，在日糧中添加葡萄糖氧化酶 的情況下，可W有效提高飼料轉化率，增加養殖效益。
[0037] 本實施例3為了便于體現本發明所述的葡萄糖氧化酶的應用，并不限于肉雞的應 用，因為所述的葡萄糖氧化酶可W添加到基礎日糧中，可W用于其他畜禽類的飼喂。通常可 W在豬、兔和奶牛等養殖過程中在其配合飼料中添加。
[0038] W上實施例僅用W說明本發明的技術方案，而非對其進行限制；盡管參照前述實 施例對本發明進行了詳細的說明，對于本領域的普通技術人員來說，依然可W對前述實施 例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分技術特征進行等同替換;而運些修改或替 換，并不使相應技術方案的本質脫離本發明所要求保護的技術方案的精神和范圍。
【主權項】
1. 一種酶活性提高的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01，其特征在于，所述的葡萄糖氧化酶 突變體G0D-M01的氨基酸序列如SEQ ID如:3所示，所述的突變體600-101由氨基酸序列為 SEQ ID NO: 1的葡萄糖氧化酶的第173位氨基酸由蘇氨酸變為纈氨酸獲得。2. 權利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01的葡萄糖氧化酶編碼基因。3. 根據權利要求2所述的葡萄糖氧化酶編碼基因，其特征在于其具有如SEQ ID N0:4所 示的核苷酸序列。4. 含有權利要求2所述的葡萄糖氧化酶編碼基因的重組表達載體。5. 根據權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于所述重組表達載體為重組酵母表 達質粒PPIC9K- G0D-M01。6. 含有權利要求4所述的重組表達載體的重組菌株。7. 根據權利要求6所述的重組菌株，其特征在于所述重組菌株為重組畢赤酵母。8. 權利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01在用于制備動物飼料添加劑中的應 用。9. 根據權利要求8所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01在用于制備動物飼料添加劑中 的應用，其特征在于:將所述的葡萄糖氧化酶編碼基因與表達載體連接構建重組表達載體， 將重組表達載體轉化到宿主細胞中，獲得重組宿主菌株，培養重組宿主菌株并誘導重組葡 萄糖氧化酶的表達，獲得葡萄糖氧化酶。10. 根據權利要求9所述的葡萄糖氧化酶突變體G0D-M01在用于制備動物飼料添加劑中 的應用，其特征在于:所述宿主細胞為畢赤酵母。
【文檔編號】A23K20/189GK106011093SQ201610525903
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月6日
【發明人】肖志壯, 張穩
【申請人】青島紅櫻桃生物技術有限公司