人類羊膜間充質細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞方法

人類羊膜間充質細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞方法
【專利摘要】本發明提出一種將人類羊膜間充質細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞的方法，其步驟包括：原代細胞的分離培養；原代細胞的純化；原代細胞流式細胞儀鑒定；2-巰基乙醇，B27，bFGF，煙酰胺誘導；誘導后細胞形態功能鑒定。本發明為體外將人類羊膜間充質細胞誘導分化形成胰島素分泌細胞的方法，誘導人類羊膜間充質細胞分化為巢蛋白陽性細胞，誘導巢蛋白陽性細胞擴增并分化為前體細胞，誘導胰島素分泌細胞成熟證實羊膜間充質細胞在特定環境下有向胰島素分泌細胞轉化的可能性，由于羊膜間充質細胞來源廣泛，且無倫理學方面的障礙，這為臨床干細胞移植提供了新的思路。
【專利說明】
人類羊膜間充質細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞方法
技術領域
[0001]本發明涉及生物技術領域，特別涉及人類羊膜間充質細胞體外定向分化為胰島素分泌細胞的方法。
【背景技術】
[0002]羊膜位于胎兒絨毛膜的表面，為光滑、無血管、無神經、無淋巴的透明薄膜。羊膜組織主要由外胚層的羊膜上皮細胞(Amn1tic epithelial cells，AECs)和中胚層的羊膜間充質細胞(Amn1tic mesenchyme cells，AMCs)兩類細胞組成。羊膜上皮細胞(AECs)具有向三胚層細胞分化的潛能，但AECS不表達端粒酶基因，不能稱之為嚴格定義上的干細胞，不具有長期自我更新和產生單個細胞克隆的能力，因而也就沒有致瘤性(Tosh1，et al, 2005) 0羊膜上皮細胞取材方便且來源豐富、其多能干細胞性、低免疫原性與胚胎干細胞不同，不涉及倫理道德問題，有望成為再生醫學一種可靠的細胞來源。同樣，羊膜間充質細胞具有BMSCs特性，可以多向分化，并且擴增能力更強而免疫原性較低(Kubo，etal, 2001),也為MSCs的獲取提供了新的來源。

【發明內容】

[0003]本發明將取選用剖宮產后的人羊膜，大小約15*15cm，分離、去除殘留的絨毛膜，PBS (Gibco BRL公司)，洗盡血跡后用0.125%胰酶，37 °C消化1min,重復4次，100rpm,離心6min收集，接種在含10% FBS的RPMI1640培養皿中，然后通過免疫吸附法對細胞進行純化，流式細胞儀鑒定細胞表型，最后對細胞進行轉化誘導實驗，并對分化細胞進行組織化學細胞染色鑒定。
[0004]具體的方法步驟包括:
[0005]S1:原代細胞的分離培養:無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤(經家屬同意)，將羊膜與絨毛層鈍性分離，置于含有雙抗(100U/ML青霉素、100UG/ML鏈霉素)的D-HANKS液反復沖洗。將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約1*1_碎塊，加入2.5G/L胰蛋白酶37°C消化lOmin，加入含5%小牛血清的RPMI1640培養基終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，過濾后的羊膜組織中加入1.0g/L II型膠原酶消化液，37°C消化0.5h，再次用5%小牛血清的RPMI1640終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞，1000r/min離心5min，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞密度為1*106接種到25cm2培養瓶，加入含1%青鏈霉素，10ng/mlbFGF和10 % FBS的RPMI1640培養基。置于37°C，飽和濕度，體積分數5%的C02培養箱進行培養。倒置相差顯微鏡下每天觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態特征，隔天換液一次，并攝片記錄，待細胞長滿70%瓶底時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化細胞，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待大部分細胞胞體回縮、變圓，立刻終止消化，以1:2比例傳代培養，記為Pl代，傳代過程中，隔日換液一次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟，傳代培養記為P2代，依次類推。
[0006]S2:原代細胞免疫吸附法純化:上述細胞培養5天后，用0.125%胰酶，37°C消化lOmin, 100rpm,離心6min收集，用PBS洗3次，接種在無血清RPMI1640培養基中，向細胞懸液內加入鼠抗人Thyl.1單克隆抗體，作用濃度為20ng/ml，37°C下作用30min，該抗體將與間充質來源的成纖維細胞特異性結合，細胞懸液離心除培養基，新鮮培養基洗2次除去抗體，全培養基重新懸浮細胞，移入山羊抗鼠IgG包被過的培養皿中，37°C下孵育1H，將細胞懸液再次吸出離心，培養基洗一次，加入全培養基后移入PLL包被的培養皿中，調節接種密度為106/ml，第三天加入新鮮培養基1ml，第五天觀察細胞生長情況，胰酶消化后重新接種在PLL包被過的培養皿中，于37°C含5% C02空氣的培養箱內培養。
[0007]S3:原代細胞流式細胞儀檢測:純化后的細胞取少量應用流式細胞儀進行細胞表型的鑒定，具體步驟為:細胞用胰酶消化后，用PBS液調整細胞濃度為l*106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體:CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置 4°C孵育 30min, PBS 洗 2 遍，直接進行流式細胞儀分析。
[0008]S4:體外誘導人類羊膜間充質細胞分化為胰島素分泌細胞，分為3個階段:誘導MSCs分化為巢蛋白陽性細胞(DMEM培養基+5mmol/L 2-巰基乙醇培養5h);誘導巢蛋白陽性細胞擴增并分化為前體細胞(細胞接種于涂有Matrigel的培養板，在DMEM培養基+B27+10 μ g/L bFGF+0.lmmol/L 2-巰基乙醇+ITS中培養7天)；誘導胰島素分泌細胞成熟(DMEM 培養基 +B27+10 μ g/L HGF+20mmol/L 煙酰胺 +0.lmmol/L 2-巰基乙醇 +LY294002 培養7?21天。
[0009]S5:誘導后細胞形態、功能鑒定RT-PCR方法=Trizol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計對RNA樣品定量后通過RT-PCR進行產物擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。誘導第28天，胰島素-1、Pdx-1、Pax-6mRNA表達顯著高于第7天和第14天。收集24h培養基，以放射免疫法測定胰島素累積分泌量。誘導7天后，胰島素分泌量急劇增加，而且隨著時間延長分泌量呈上升趨勢，各時間點相比，差異均有統計學意(P〈0.01)。胰島素刺激實驗:參照參考文獻，計算刺激指數(SI)。誘導第7天，細胞對葡萄糖的刺激可以產生反應；誘導第14?28天細胞的基礎和刺激后分泌量均顯著增高，對葡萄糖的刺激更加敏感；第14天、第28天的SI較第7天顯著升高(P = 0.0008,0.003),但是第14天與第28天相比，差異無統計學意義(P = 0.051)。
[0010]本發明將人類羊膜間充質細胞體外定向分化為胰島素分泌細胞的方法，先將原代培養的細胞應用免疫吸附法進行純化，純化后的細胞2-巰基乙醇，B27，bFGF，煙酰胺誘導；誘導后細胞形態功能鑒定。該方法較前所報道的各種其他誘導方法明顯提高了胰島素分泌細胞誘導轉化率。
【附圖說明】
[0011]通過下面結合附圖的詳細描述，本發明前述的和其他的目的、特征和優點將變得顯而易見。其中:
[0012]圖1所示為本發明的體外羊膜間充質細胞定向分化為胰島素分泌細胞方法步驟流程圖。
【具體實施方式】
[0013]所述人類羊膜間充質細胞體外定向分化為胰島素分泌細胞方法包括如下步驟:
[0014]S1:原代細胞的分離培養:無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤(經家屬同意)，將羊膜與絨毛層鈍性分離，置于含有雙抗(100U/ML青霉素、100UG/ML鏈霉素)的D-HANKS液反復沖洗。將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約1*1_碎塊，加入2.5G/L胰蛋白酶37°C消化lOmin，加入含5%小牛血清的RPMI1640培養基終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，過濾后的羊膜組織中加入1.0g/L II型膠原酶消化液，37°C消化0.5h，再次用5%小牛血清的RPMI1640終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞，1000r/min離心5min，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞密度為1*106接種到25cm2培養瓶，加入含1%青鏈霉素，10ng/mlbFGF和10 % FBS的RPMI1640培養基。置于37°C，飽和濕度，體積分數5%的C02培養箱進行培養。倒置相差顯微鏡下每天觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態特征，隔天換液一次，并攝片記錄，待細胞長滿70%瓶底時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化細胞，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待大部分細胞胞體回縮、變圓，立刻終止消化，以1:2比例傳代培養，記為Pl代，傳代過程中，隔日換液一次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟，傳代培養記為P2代，依次類推。
[0015]S2:原代細胞免疫吸附法純化:上述細胞培養5天后，用0.125%胰酶，37°C消化lOmin, 100rpm,離心6min收集，用PBS洗3次，接種在無血清RPMI1640培養基中，向細胞懸液內加入鼠抗人Thyl.1單克隆抗體，作用濃度為20ng/ml，37°C下作用30min，該抗體將與間充質來源的成纖維細胞特異性結合，細胞懸液離心除培養基，新鮮培養基洗2次除去抗體，全培養基重新懸浮細胞，移入山羊抗鼠IgG包被過的培養皿中，37°C下孵育1H，將細胞懸液再次吸出離心，培養基洗一次，加入全培養基后移入PLL包被的培養皿中，調節接種密度為106/ml，第三天加入新鮮培養基1ml，第五天觀察細胞生長情況，胰酶消化后重新接種在PLL包被過的培養皿中，于37°C含5% C02空氣的培養箱內培養。
[0016]S3:原代細胞流式細胞儀檢測:純化后的細胞取少量應用流式細胞儀進行細胞表型的鑒定，具體步驟為:細胞用胰酶消化后，用PBS液調整細胞濃度為l*106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體:CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置 4°C孵育 30min, PBS 洗 2 遍，直接進行流式細胞儀分析。
[0017]S4:體外誘導人類羊膜間充質細胞分化為胰島素分泌細胞，分為3個階段:誘導MSCs分化為巢蛋白陽性細胞(DMEM培養基+5mmol/L 2-巰基乙醇培養5h);誘導巢蛋白陽性細胞擴增并分化為前體細胞(細胞接種于涂有Matrigel的培養板，在DMEM培養基+B27+10 μ g/L bFGF+0.lmmol/L 2-巰基乙醇+ITS中培養7天)；誘導胰島素分泌細胞成熟(DMEM 培養基 +B27+10 μ g/L HGF+20mmol/L 煙酰胺 +0.lmmol/L 2-巰基乙醇 +LY294002 培養7?21天。
[0018]S5:誘導后細胞形態、功能鑒定RT-PCR方法=Trizol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計對RNA樣品定量后通過RT-PCR進行產物擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測。誘導第28天，胰島素-1、Pdx-1、Pax-6mRNA表達顯著高于第7天和第14天。收集24h培養基，以放射免疫法測定胰島素累積分泌量。誘導7天后，胰島素分泌量急劇增加，而且隨著時間延長分泌量呈上升趨勢，各時間點相比，差異均有統計學意(P〈0.01)。胰島素刺激實驗:參照參考文獻，計算刺激指數(SI)。誘導第7天，細胞對葡萄糖的刺激可以產生反應；誘導第14?28天細胞的基礎和刺激后分泌量均顯著增高，對葡萄糖的刺激更加敏感；第14天、第28天的SI較第7天顯著升高(P = 0.0008,0.003),但是第14天與第28天相比，差異無統計學意義(P = 0.051)。
[0019]實驗結果及分析如下:
[0020]1.原代培養的羊膜間充質細胞在接種12_24h內部分細胞開始貼壁生長，剛貼壁的細胞呈圓形，折光性強，隨后細胞胞質逐漸展開，折光性減弱，一周后逐漸形成扁平單層細胞，呈漩渦狀生長或成簇生長，隨著細胞密度增加，胞體變得細長，形態類似成纖維細胞，生長速度同樣較慢，長滿皿底需2-3w。傳代后細胞生長迅速，接種6h后細胞即貼壁，形態、大小均一，在小牛血清存在的條件下，傳代細胞3-5d可增殖一倍。培養的細胞可以穩定生長傳代，而且體外培養10代以后，細胞的增殖速度無明顯減緩。
[0021]2.人AMSCS的體外生長曲線表明，人羊膜間充質細胞生長周期約30d，第15d為生長高峰期。細胞經過傳一代后3-4d，細胞增殖迅速，6d后又緩慢而平穩增長。
[0022]3.取原代培養10天左右的羊膜間充質細胞進行流式細胞儀檢測，結果表明細胞高表達 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD106、CD166，但不表達 CD34、CD45、HLA-DR，高表達CD49d0
[0023]4.人AMSCS的體外克隆化培養結果表明，培養14天左右的AMSCS均呈克隆樣生長，符合間充質干細胞的生長特性。
[0024]5.該細胞向胰島素分泌細胞誘導分化的結果表明，在誘導培養7d后胰島素-1、Pdx-U Pax-6mRNA表達增高，胰島素分泌量急劇增加。結果證明羊膜間充質細胞有向胰島素分泌細胞方向分化的潛能。
[0025]人羊膜為半透明薄膜，無血管、神經及淋巴管，有一定的彈性，厚度為
0.02-0.50mm，光鏡下可分為5層，即上皮層、基底膜層、致密層、纖維母細胞層及海綿層，羊膜間充質細胞位于羊膜基底膜層，此細胞團能發育成人體的各種組織器官。由于羊膜是胚胎發育的早期產物，所以有理由認為羊膜間充質細胞是多能性的或其中含有多能性的干細胞，目前大量相關研究也表明羊膜細胞是一個良好的細胞移植材料。
[0026]Elwan和Okawa等利用免疫組織化學技術，發現培養的人羊膜細胞可以合成釋放兒茶酚胺(CA)、多巴胺(DA)、去甲腎上腺素(NE) ;SakUragaWa等發現培養的羊膜細胞可以合成釋放乙酰膽堿(Ach)等神經遞質；2000年Uchida等又進一步證實羊膜細胞可以合成腦源性神經生長移植(BDNF)、神經營養因子-3 (NT-3)、神經生長因子(NGF)、IL-U IL-4、IL-6等多種因子，提示羊膜組織具有合成釋放神經遞質的神經生物學功能，還可以分泌神經營養因子等生物活性物質，對胚胎神經發育的早期階段具有重要調節作用。
[0027]胰島是多細胞組成的集合體，從單一的人羊膜間充質細胞誘導分化成為細胞的組成、空間排列與胰島完全一致的難度較大。雖然本研究誘導的胰島素分泌細胞形態上與真正的胰島有一定的差別，僅是能夠表達Pdxl、Pax6等參與胰島素分泌調節的基因，而且可釋放一定量的胰島素，對葡萄糖刺激有一定的反應性，具備了替代胰島移植物的潛能。
[0028]本發明并不局限于所述的實施例，本領域的技術人員在不脫離本發明的精神即公開范圍內，仍可作一些修正或改變，故本發明的權利保護范圍以權利要求書限定的范圍為準。
【主權項】
1.一種人類羊膜間充質細胞體外誘導分化為胰島素分泌細胞方法，其包括如下步驟: S1:原代細胞的分離培養:無菌條件下取產后棄置的新鮮胎盤，將羊膜與絨毛層鈍性分離，置于含有雙抗的D-HANKS液反復沖洗；將漂洗后的羊膜用眼科剪剪成約l*lmm碎塊，加入2.5G/L胰蛋白酶37°C消化lOmin，加入含5%小牛血清的RPMI 1640培養基終止消化，并輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，過濾后的羊膜組織中加入1.0g/L II型膠原酶消化液，37°C消化0.5h，再次用5%小牛血清的RPMI1640終止消化，輕柔吹打混勻后200目細胞篩過濾，收集細胞，1000r/min離心5min，臺盼藍染色計數活細胞，調整細胞密度為1*106接種到25cm2培養瓶，加入含I %青鏈霉素，10ng/mlbFGF和10% FBS的RPMI1640培養基；置于37° C，飽和濕度，體積分數5%的C02培養箱進行培養；倒置相差顯微鏡下每天觀察原代和傳代細胞的生長情況和形態特征，隔天換液一次，并攝片記錄，待細胞長滿70%瓶底時，用2.5g/L的胰蛋白酶消化細胞，消化過程中，用倒置顯微鏡觀察細胞消化情況，待大部分細胞胞體回縮、變圓，立刻終止消化，以1:2比例傳代培養，記為Pl代，傳代過程中，隔日換液一次，待細胞長滿70%瓶底重復以上步驟，傳代培養記為P2代，依次類推； 52:原代細胞免疫吸附法純化:上述細胞培養5天后，用0.125%胰酶，37 °C消化lOmin, 100rpm,離心6min收集，用PBS洗3次，接種在無血清RPMI1640培養基中，向細胞懸液內加入鼠抗人Thyl.1單克隆抗體，作用濃度為20ng/ml，37°C下作用30min，該抗體將與間充質來源的成纖維細胞特異性結合，細胞懸液離心除培養基，新鮮培養基洗2次除去抗體，全培養基重新懸浮細胞，移入山羊抗鼠IgG包被過的培養皿中，37°C下孵育1H，將細胞懸液再次吸出離心，培養基洗一次，加入全培養基后移入PLL包被的培養皿中，調節接種密度為106/ml，第三天加入新鮮培養基1ml，第五天觀察細胞生長情況，胰酶消化后重新接種在PLL包被過的培養皿中，于37°C含5% C02空氣的培養箱內培養； 53:原代細胞流式細胞儀檢測:純化后的細胞取少量應用流式細胞儀進行細胞表型的鑒定，具體步驟為:細胞用胰酶消化后，用PBS液調整細胞濃度為l*106/ml，分別加入下列鼠抗人單克隆抗體:CD29-FITC、CD34-FITC、CD44-PE、CD45-PE、CD73-PE、CD90PE、CD105-FITC、CD106-PE、CD166-FITC、HLA-DR-PE，置 4°C孵育 30min, PBS 洗 2 遍，直接進行流式細胞儀分析； S4:體外誘導人類羊膜間充質細胞分化為胰島素分泌細胞，分為3個階段:誘導MSCs分化為巢蛋白陽性細胞(DMEM培養基+5mmol/L 2-巰基乙醇培養5h);誘導巢蛋白陽性細胞擴增并分化為前體細胞(細胞接種于涂有Matrigel的培養板，在DMEM培養基+B27+10 μ g/L bFGF+0.lmmol/L 2-巰基乙醇+ITS中培養7天)；誘導胰島素分泌細胞成熟(DMEM 培養基 +B27+10 μ g/L HGF+20mmol/L 煙酰胺 +0.lmmol/L 2-巰基乙醇 +LY294002 培養7?21天； S5:誘導后細胞形態、功能鑒定RT-PCR方法=Trizol試劑提取細胞總RNA，紫外分光光度計對RNA樣品定量后通過RT-PCR進行產物擴增，瓊脂糖凝膠電泳檢測；誘導第28天，胰島素-l、Pdx-l、Pax-6mRNA表達顯著高于第7天和第14天；收集24h培養基，以放射免疫法測定胰島素累積分泌量；進行胰島素刺激實驗。
【文檔編號】C12N5/077GK106011048SQ201510134763
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2015年3月25日
【發明人】吳衛江
【申請人】吳衛江