一種空間氧化微桿菌lct-h6的制作方法
【專利摘要】一種空間氧化微桿菌LCT?H6，更具體的說是一種太空微生物，運用空間技術從“神舟九號”飛船返回艙內部的冷凝水分離獲得。其特征：氧化微桿菌LCT?H6是好氧的革蘭陽性菌，與微桿菌Microbacterium maritypicum親緣關系最為相近，對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料具有腐蝕能力。在基因組學層面對該菌進行闡明，證實LCT?H6的全基因組序列總長度為4.11Mbp，GC含量為67.75%，其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數目最多的COG為“能量產生和轉化”、“氨基酸轉運和代謝”、“糖轉運和代謝”、“無機鹽離子轉運和代謝”、“翻譯、核糖體結構和形成”。CGMCC 1257420160601
【專利說明】
一種空間氧化微桿菌LCT-H6
技術領域
[0001 ]本發明屬于微生物及生物技術領域，涉及一種新的微生物菌株氧化微桿菌LCT-H6以及其生物學特性、基因組DNA序列，利用生物信息學技術進行了組學分析，獲得其在基因組的特性。
【背景技術】
[0002]隨著人類空間探索活動的日益頻繁，宇宙空間成為了人類活動的一個重要領域。太空密閉艙中存在著特定的微生物群落。雖然每一件物品都經過了嚴格消毒，微生物仍會隨航天員身體、人體分泌物、航空部件等進入太空，并在航天器密閉艙室內形成特定微生物群落，既包括無害微生物，也包括一些致病性和腐蝕性微生物。“和平”號運行十余年來空間站內檢測到234種微生物。太空密閉艙內的特殊環境因素，包括微重力、弱磁場和粒子輻射等，使得微生物會產生變異，導致它們對生存環境的要求很低，更加容易生長和繁殖，某些微生物的腐蝕性會增強。太空密閉艙中腐蝕性微生物的大量繁殖，使得各種航天材料逐漸產生腐蝕，加速航天器件的降解耗損，將可能導致空間站內的設備運行失靈，影響航天器的長期正常運行及其在軌使用壽命，甚至對飛行安全也會造成很大威脅。航天器服役條件惡劣，在軌時間長，而維修條件相對不足，一旦發生微生物腐蝕設備故障，損失不可估量。國外載人航天器在軌經驗和國內地面研究的初步結果表明，微生物會嚴重威脅航天設備安全。開展長期太空密閉艙中微生物對航天器材腐蝕的機理及防控措施研究，深化對載人航天器中微生物風險的認識和加強相關技術儲備，探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施，為載人航天器的研制和運營提供技術支撐。
[0003]針對空間環境微生物材料腐蝕研究，目前尚無氧化微桿菌的相關報道。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種空間氧化微桿菌LCT-H6。對空間菌株進行表型檢測，然后對其進行全基因組測序，闡明該細菌的特性及用途。
[0005]本發明提供的菌株氧化微桿菌LCT-H6，其保藏號為CGMCCN0.12574。
[0006]所述的氧化微桿菌LCT-H6，革蘭陽性菌，與微桿菌Microbacterium maritypicum親緣關系最為相近。對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料具有腐蝕能力。
[0007]所述的氧化微桿菌^:1'-冊，全基因組序列總長度為4.111?^，6(:含量為67.75%， 其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數目最多的COG為“能量產生和轉化”、“氨基酸轉運和代謝”、“糖轉運和代謝”、“無機鹽離子轉運和代謝”、“翻譯、核糖體結構和形成”，以及其他。
【附圖說明】
[0008]圖1氧化微桿菌LCT-H6的革蘭氏染色。
[0009]圖2氧化微桿菌LCT-H6進化樹。
[0010]圖3氧化微桿菌LCT-H6在環氧樹脂唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0011]圖4氧化微桿菌LCT-H6對環氧樹脂腐蝕的SEM觀察。
[0012]圖5氧化微桿菌LCT-H6在酯類聚氨酯唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0013]圖6氧化微桿菌LCT-H6對酯類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0014]圖7氧化微桿菌LCT-H6在醚類聚氨酯唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0015]圖8氧化微桿菌LCT-H6對醚類聚氨酯腐蝕的SEM觀察。
[0016]圖9氧化微桿菌LCT-H6在硫化天然橡膠唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0017]圖10氧化微桿菌LCT-H6對硫化天然橡膠腐蝕的SEM觀察。
[0018]圖11氧化微桿菌LCT-H6在聚乙烯醇縮甲醛唯一碳源培養條件下增長曲線。
[0019]圖12氧化微桿菌LCT-H6對聚乙烯醇縮甲醛腐蝕的SEM觀察。
[0020]圖13氧化微桿菌LCT-H6的COG功能分析。
【具體實施方式】
[0021 ]下述實施實例中所用的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0022]下述實施實例中所用的材料、試劑，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。
[0023]一、氧化微桿菌LCT-H6的表型
1.菌株來源:對“神舟九號”飛船返回艙內部的冷凝水進行了微生物的采集，選用細菌培養基對樣品進行初篩，然后挑取菌落形態不同的單菌落進行劃線培養，純化到單一菌株后，使用生理鹽水加80%甘油保藏菌種。菌株命名為氧化微桿菌LCT-H6，保存于中國普通微生物菌種保藏中心，保藏號為CGMCC N0.12574。
[0024]2.革蘭氏染色:取50ul樣品離心，棄上清，加入無菌水50ul，吸取20ul于載玻片上進行固定;初染，吸取革蘭氏染色1(結晶紫)2滴于載玻片樣品上進行初染lmin，然后用自來水沖洗染液;媒染，吸取革蘭氏染色Π (碘液)2滴覆蓋涂面染約Imin，然后用自來水沖洗染液，用吸水紙吸取涂面上的水分;脫色，吸取革蘭氏染色ΠΚ酒精)2滴滴在涂面上約30s，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分;復染，吸取革蘭氏染色IV(番紅)2滴滴在涂面上約lmin，用水沖洗載玻片，用吸水紙吸取涂面上的水分;觀察，先用顯微鏡低倍鏡找到目標視野，然后再用油鏡(100X)進行觀察，判定并記錄結果、拍照，見圖1。氧化微桿菌LCT-H6為革蘭氏陽性桿菌，菌體單個、成雙或成串狀排列。
[0025]3.氧化微桿菌LCT-H6菌株16s rDNA鑒定:16S rDNA是16S rRNA序列的基因，長約
1.5kb。將已分純的單菌直接經菌液PCR擴增16S rDNA，部分通過菌液PCR較難擴增的單菌經擴大培養后提取基因組后擴增，擴增所用引物序列如下:
SgF: AGAGTTTGATCATGGCTCAGSgR: TAGGGTTACCTTGTTACGACTT
16S rDNA PCR產物用96孔mi I Ipore純化系統純化后準確定量，經ABI 3730x1全自動序列分析儀測序，測序結果使用Sequence scanner、Seqman等序列分析軟件，將兩向測序結果去掉首尾不可信序列后拼接，余下的約1350bp(雙向測序)即用于同源性分析。所得16SrDNA序列在Eztaxon server 2.1數據庫中進行比對，確定菌株大致的分類地位。所有單菌16S序列全部導入seqman，輸出single file(fasta)后，經Mega 5.0軟件cIusterW多重比對，輸出meg文件重新導入構建Neighbor-Joining tree。其中，phylogeny test method為bootstrap參數設置為1000。16s rDNA鑒定結果顯不LCT-H6與微桿菌Microbacteriummaritypicum 相似性為 99%(圖 2)。
[0026]4.腐蝕性實驗:選擇航天器已采用的5種高分子材料環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯、硫化天然橡膠和聚乙烯醇聚縮醛為氧化微桿菌LCT-H6腐蝕特性研究對象。
[0027]分別以這5種高分子材料為唯一碳源對菌株LCT-H6進行培養，在不同時間點進行取樣并測定培養液在600 nm波長下的吸光度(0D600)，以判斷細菌利用單一高分子材料作為唯一碳源的生長情況。具體操作如下:向100 mL無菌三角燒瓶中倒入40 mL無機鹽基礎培養基，每個培養瓶中加入10個高分子材料試樣，接種5 mL菌懸液，透氣膜封口，放入32°C，相對濕度為75%的恒溫培養箱中。每株菌和每個材料準備3個平行樣品。設置4個時間點:1、3、
6、10周取樣。測定各個時間點培養液600 nm波長下的吸光度，判斷細菌利用高分子材料作為唯一碳源的生長情況。結果(圖3、5、7、9)表明在I至10周內，以環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料為唯一碳源生長實驗中，菌株LCT-H6的0D600均大于對照菌株，具有明顯的增長現象。以聚乙烯醇縮甲醛為唯一碳源生長實驗中，菌株LCT-H6的0D600與對照菌株相差較小，增長效果不明顯(圖11)。
[0028]高分子材料表面微生物膜和腐蝕形態SEM觀察:將環氧樹脂膜加工成尺寸為1mm(直徑)X0.5_(厚度)圓片;醚類聚氨酯、酯類聚氨酯泡沫和聚乙烯醇縮甲醛泡沫分別加工成10 mm(長)X 10 mm(寬)X 5mm(厚度)的小方塊;硫化橡膠膜加工成尺寸為6mm(直徑)X
0.5mm(厚度)圓片;所有樣品用丙酮浸泡I天，5%乙醇/水溶液中15min滅菌，無菌水清洗至中性。將培養的菌株LCT-H6分別接種至5種高分子材料膜表面，在不同時間點對高分子材料膜表面用掃描電子顯微鏡(SEM)進行觀察，如圖4、6、8、10所示，I至10周內菌株LCT-H6能在環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料膜表面形成微生物膜，說明菌株LCT-H6具有降解和腐蝕這4種高分子材料的潛力。而在聚乙烯醇縮甲醛表面未形成微生物膜，說明菌株LCT-H6無腐蝕聚乙烯醇縮甲醛的潛力(圖12)。
[0029 ] 二、空間氧化微桿菌LCT-H6全基因組測序
培養氧化微桿菌LCT-H6并提取基因組DNA，首先采用超聲法將檢測合格的DNA樣品隨機打斷，得到一系列DNA片段，經T4 DNA聚合酶、Klenow DNA聚合酶和T4多聚核苷酸激酶等處理后，回收目的片段，得到測序文庫，利用Illumina的Genome Analyzer II測序;測序結束后得到的reads，經過濾處理后進行組裝和分析。采用Glimmerf.0軟件從組裝結果中獲得基因序列并將基因的序列與各數據庫進行比對，得到對應的功能注釋信息。LCT-H6的全基因組序列總長度為4.1 IMbp，GC含量為67.75%。其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數目最多的COG為“能量產生和轉化”、“氨基酸轉運和代謝”、“糖轉運和代謝”、“無機鹽離子轉運和代謝”、“翻譯、核糖體結構和形成”，以及其他(圖13)。
[0030]本發明的特點和應用價值:本研究是我國第一次利用自己研發的空間技術獲得對常用航天高分子材料具有腐蝕性的太空艙定植氧化微桿菌LCT-H6，為研究載人航天器微生物腐蝕提供了寶貴的樣本。對該菌的進一步研究，將有助于深化對載人航天器中微生物風險的認識和加強相關技術儲備，有助于探索更加有效的載人航天器微生物綜合控制措施。
[0031]
關于保藏的LCT-H6菌株說明A.菌種的保藏單位名稱和地址名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所
B.交機構保藏的日期2016年6月I日
C.保藏機構給予的保藏號CGMCC N0.12574
D.分類命名氧化微桿菌 Microbacterium Oxydans0
【主權項】
1.一種空間氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:保藏號為CGMCC 12574。2.根據權利要求1所述的氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:革蘭陽性菌，微桿菌Microbacterium maritypicum親緣關系最為相近;對環氧樹脂、酯類聚氨酯、醚類聚氨酯和硫化天然橡膠4種高分子材料具有腐蝕能力。3.根據權利要求1所述的氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:LCT-H6的全基因組序列總長度為4.1 IMbp，GC含量為67.75%。4.根據權利要求1所述的氧化微桿菌LCT-H6，其特征在于:其蛋白被分類注釋為22類COG家族，包含蛋白數目最多的COG為“能量產生和轉化”、“氨基酸轉運和代謝”、“糖轉運和代謝”、“無機鹽離子轉運和代謝”、“翻譯、核糖體結構和形成”。
【文檔編號】C12R1/01GK106011011SQ201610455943
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月22日
【發明人】劉長庭, 張學林, 方向群, 郭英華, 王俊峰, 姜學革, 李天志, 周宏 , 劉巖, 潘磊, 徐綢, 黃兵, 李佳, 余昳
【申請人】中國人民解放軍總醫院