分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應用

分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應用
【專利摘要】本發明屬于多糖領域。本發明涉及分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應用。本發明以水或水醇溶液為介質，用堿性溶液提取茯苓粉中的茯苓多糖成為茯苓多糖堿提取液。氯乙酸與適當過量的堿性溶液中和后，與茯苓多糖堿提取液混勻，在30℃至90℃逐步升溫的條件下合成分子量分布廣泛(0.6×104至2.0×106道爾頓)的羧甲基取代度大于1.000的羧甲基茯苓多糖。用超濾法分離純化分子量0.6×104至1.0×106道爾頓的組分，優選應用作為口服制劑的原料；分離純化分子量1.0×106以上至2.0×106道爾頓的組分，優選應用作為注射制劑的原料。本發明的制備方法為液相不振蕩工藝，無需振蕩設備，且具有簡便、省料、節能、環保等特點。
【專利說明】
分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖及其制備方法和其應用
技術領域
[0001] 本發明屬于多糖領域，尤其涉及作為新型抗腫瘤生物反應調節劑(BRM)的分子量 分布廣泛的羧甲基茯苳多糖(Carboxymethylpachymaran，CMP)及其制備方法和其應用。
【背景技術】
[0002] 茯苓為多孔菌科真菌茯苓[Poria C0C0S(SChw.)W0lf]的干燥菌核，自古為傳統中 藥"四君八珍"之一，具有"利水滲濕、健脾寧心"的功效，所含成分茯苓多糖具有β(1-3)結 合的葡萄糖苷線性結構和β(1-6)結合的葡萄糖苷支鏈的結構。試驗表明，未經化學改性的 茯苓多糖沒有抗腫瘤活性，茯苓在沸水中的煎煮得率不超過2%。經過化學改性后生成的羧 甲基茯苓多糖具有水溶性，利于人體的吸收，而且羧甲基茯苓多糖能誘生與促誘生人血淋 巴細胞產生干擾素 _α (IFN-α)、干擾素 -γ (IFN- γ )、白細胞介素-2 (IL-2)、白細胞介素-6 (IL-6)，腫瘤壞死因子-a(TNF-a)、粒-巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)等多種細胞活性因 子，具有增強免疫、抗腫瘤（主要通過增強免疫功能和激活免疫監視系統來發揮抗腫瘤活 性）、抗病毒、抗放射、保肝、改善睡眠、降血糖、抗衰老等藥理學活性，可廣泛用于腫瘤手術 后的免疫治療，也可用于腫瘤放化療的輔助治療，顯著增強惡性腫瘤患者的免疫功能，減少 和消除放化療的副反應，增強腫瘤患者的免疫功能，促進腫瘤患者食欲，改善腫瘤患者睡 目民，提高腫瘤患者的生存質量與延長生命。
[0003] 已有試驗證明：羧甲基茯苓多糖按13.2g/kg劑量給小鼠灌胃，無急性毒性反應;羧 甲基茯苓多糖按〇. 22-1.73g/kg劑量(所用劑量為人臨床劑量的180倍)給大鼠灌胃12周，無 毒副反應，連續用藥3個月安全;毒理試驗也證明，羧甲基茯苓多糖無致突變、致畸胎的結 果。
[0004] Hamuro等人（1971年)采用異丙醇與水為介質，在液固相振蕩條件下合成制取羧甲 基茯苓多糖，因需大型振蕩設備，難以實現工業化生產，且需要大量的有機溶劑(如乙醚、甲 醇、丙酮、醋酸和乙醇)對羧甲基茯苓多糖進行后處理及純化，不僅生產成本較高，還造成環 境污染。
[0005] 石清東等人（1996年）以乙醇與水為介南，采用在液固相攪拌條件下合成制取羧甲 基茯苓多糖，所制取的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S)為0.92,表現為產品的溶解 度較小，雜質質量較高，以NaCl計，含氯化物％ <3.0% ;以Pb計，重金屬％ <0.002%，且較 難分離除去所含雜質，大大限制了所研制的羧甲基茯苓多糖的制劑應用和臨床應用范圍， 如該法制取的羧甲基茯苓多糖不能用于制備注射劑。
[0006] 因此，制備分子量分布廣泛的羧甲基取代度(D · S)大于1.000的羧甲基茯苓多糖， 以提高其溶解度和拓寬其制劑應用和臨床應用范圍，成為人們迫切需要解決的技術問題。

【發明內容】

[0007] 本發明的目的是提供分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備方法，包括如下步 驟：1)茯苓粉加入到水或水醇混合液中，攪拌均勾后，加入2.0-8. Omol/L的堿性溶液，攪拌 至完全溶解，得茯苓多糖堿化液;2) 1.0-10m〇l/L氯乙酸與適當過量的2.0-10m〇l/L堿性溶 液，充分反應后，加入到1)步所得的茯苓多糖堿化液中，在30°C至90°C逐步升溫的條件下合 成反應，分離純化生成的羧甲基茯苓多糖，即得。
[0008] 上面近述羧甲基茯苓多糖的分子式為(C6H1Q〇5)n，可由本領域熟知的方法推斷得， 用喊化提取法制得的茯等多糖喊化提取液，相當于1)步制得的茯等多糖喊化液;或喊提取 酸沉淀法制得的茯苓多糖粗品，再進一步堿化。
[0009] 上面所述堿化提取法是指:茯苓粉加入濃度為2.0-8.0m〇l/L或3.0-8.0m 〇l/L的堿 性溶液攪拌提取，壓濾分離，取濾液，即得茯苓多糖堿化提取液。
[0010] 上面所述堿提取酸沉淀法是指:茯苓粉加入濃度為2.0-3.0m〇l/L或3.0-4.0m 〇l/L 的堿性溶液攪拌提取，壓濾分離，取濾液;濾液加酸(如醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸），得酸沉淀 物;沉淀物經離心、水洗，即得茯苓多糖粗品。
[0011] 上面所述水醇溶液為本領域熟知的醇溶劑加水制得的溶液，所述醇溶劑選自甲 醇、乙醇、丙二醇的任一種或其組合。
[0012] 本發明所述堿性溶液由本領域熟知的堿性物質加水溶解制得，所述堿性物質選自 氫氧化鈉、氫氧化鉀、碳酸鈉或碳酸鉀的任一種或其組合，優選氫氧化鈉或氫氧化鉀。
[0013] 進一步，氯乙酸溶液的濃度為2 · 0-9 · 0m〇l/L，優選為3 · 0-8 · 0m〇l/L，更優選為5.0_ 7 · 0mol/L，最優選為 5 · 5-6 · 5mol/L。
[0014] 進一步，所述適當過量是指堿性溶液中堿性物質的實際用量比其與氯乙酸發生中 和反應所需理論用量過量2.0-20%，優選過量5-15%，更優選過量6-12%，最優選過量8-10%〇
[0015] 進一步，2)步反應液在30 °C至90 °C條件下進行取代反應3h至12h，優選反應溫度為 35 °C至85 °C，更優選為40 °C至82 °C，最優選為55 °C至80 °C ;優選反應時間為3h至12h，更優選 為6h至10h。
[0016] 進一步，所述分離是指在2)步反應生成液中加入1.0-5.0m〇l/L的酸性溶液，調其 pH值5.0-7.0后，加入3-5倍體積的醇溶劑，析出羧甲基茯苓多糖粗品；所述醇溶劑選自甲 醇、乙醇、丙二醇的任一種或其組合。
[0017] 本發明所述酸性溶液由本領域熟知的酸性物質加水溶解制得，優選所述酸性物質 選自醋酸、鹽酸、硫酸或硝酸的任一種或其組合，優選為鹽酸或硝酸，最優選為鹽酸。
[0018] 本發明合成反應的原理為：（C6HiQ〇5)n+nClCH2⑶OH+nNaOH4(C8Hi2〇7)n+nNaCl + nH20，（ C6Hi〇〇5 )n+nC 1 OfcCOOH+nKOH- (C8Hi2〇7)n+nKC 1 +ηΗ20。
[0019] 由于合成反應中氯乙酸與堿性溶液的濃度較高，存在氯乙酸與堿性物質的其他副 反應，生成一定量的氯化鈉、氯乙酸鈉、羥乙酸鈉、氯化鉀、氯乙酸鉀、羥乙酸鉀等小分子雜 質。
[0020] 進一步，所述純化是指羧甲基茯苓多糖粗品加水配成1.0-6.0 %或2.0-5.0 %或 3.0-4.0 %的水溶液，加入1.0-5.0m〇l/L的堿性溶液調pH值9.0-12.0，攪拌至羧甲基茯苓多 糖粗品完全溶解;加入30%H 2〇2溶液，其用量為溶解液總容積的0.1%。-1.0%。，進行脫色反 應;加入1.0-5.0mol/L的酸性溶液調pH值5.0-7.0，超濾去除分子量小于0.6 X 104道爾頓的 羧甲基茯苓多糖及其他小分子雜質。
[0021] 進一步，堿性溶液的濃度為1.0-4.0mol/L，優選為1.5-3.5mol/L，更優選為2.0- 3. Omol/L，最優選為 2.5mol/L。
[0022] 進一步，脫色反應的溫度為10°C-70°C，優選為15°C-60°C，更優選為20°C-50°C。脫 色反應的時間根據脫色反應的完成程度而定，通常為2h至48h，優選為5h至40h，更優選為 1011至3011，最優選為1511至2011。
[0023] 進一步，酸性溶液的濃度為1.0-9. Omol/L，優選為2.0-8. Omol/L，更優選為3.0_ 7 · 0mol/L，最優選為 4 · 0-6 · 0mol/L。
[0024] 進一步，所述超濾是用DH-UF中空纖維超濾器進行超濾。
[0025] 根據實際需要，可對反應生成的分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖進行分級分離 純化，以提高其純度。
[0026] 進一步，所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度（D · S)大于 1.000。
[0027] 進一步，分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖分子量分布為0.6 X 104至2.0 X 106道 爾頓。采用超濾器可分離純化為〇 . 6 X 104至1.0 X 106道爾頓與1.0 X 106以上至2.0 X 106道 爾頓的2個組分。
[0028] 進一步，兩個組分的羧甲基茯苓多糖的聚合度(η)分別為28至4546與4546至9091。 [0029]本發明通過提高氯乙酸和堿性水溶液的反應濃度，以增加堿化茯苓多糖同氯乙酸 鈉或氯乙酸鉀的有效碰撞，加快羧甲基化反應速率，并提高羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代 度(D · S)〇
[0030]應用本發明制備方法得到分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度 (D · S)大于1.000,明顯提高其溶解度，減少純化過程中醇溶劑的用量和殘留在廢水中的醇 溶劑量，大大降低生產成本，利于環境保護。
[0031 ]本發明的制備方法為液相不振蕩工藝，無需振蕩設備，方便實現工業化生產，具有 簡便、省料、節能、環保等特點。
[0032] 本發明所制備的產品，分子量分布0.6 X 104至1 .OX 106道爾頓的組分優選應用作 為口服制劑的原料，分子量1.0X106以上至2.0X10 6道爾頓的組分優選作為注射制劑的原 料。
[0033] 此外，回收反應廢液和超濾的醇溶劑可循環用于生產。加入適量新配制的石灰水 到回收醇溶劑的廢液中，將其分子量小于0.6Χ10 4道爾頓的羧甲基茯苓多糖、氯乙酸鈉、羥 乙酸鈉、氯乙酸鉀、羥乙酸鉀與石灰水生成鈣鹽沉淀，過濾回收或除去鈣鹽沉淀，而電解處 理廢液中所含的少量氯化鈉、氯化鉀，使其達到排放要求，以減少環境污染和降低生產成 本。
[0034] 本發明采用標準曲線法測定分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的相對分子量范 圍，采用酸洗法或酸化法測定其取代度。酸洗法的具體測定過程參見Bolhuis Gerad Κ， Arends-Scholte Anna ff,Stuut Gerrit J，etaldisintegration Efficiency of Sodium Starchglycolates Prepared from Different Native Starchs[J]，Eur J Pharm，1994， 40(5):317-320.
[0035] 本發明的另一目的是提供一種分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖，其制備方法如 前所述。
[0036] 上述所述口服制劑選自口服液、片劑、膠囊、顆粒劑、丸劑、散劑、糖漿劑、合劑。所 述注射劑選自針劑(注射液）、輸液或凍干粉針等。可采用本領域熟知的制劑技術手段制備 得到本發明的組合物。
[0037] 除非另有說明，本發明所述百分含量均為重量百分含量;所述分子量均為相對分 子量，其單位均為道爾頓。
[0038] 本發明所制備的分子量0.6X104至1.0X106道爾頓的羧甲基茯苓多糖可優選作為 口服制劑的原料。其日用劑量、日服次數和服用周期可根據患者的病情、年齡、性別、體質和 其他用藥情況等綜合因素而定。成年人通常日用劑量為300mg-1000mg/日，優選為450mg-850mg/日，最優選為600mg/日。服用次數為1-4次/日或2-3次或3次/日。通常連續用藥4周為 1個療程，可顯著提高腫瘤患者的T 4/T8比值和自然殺傷(NK)細胞的活性，協同殺死、殺傷惡 性腫瘤細胞，抑制惡性腫瘤的發展與轉移，還可改善各種腫瘤病人的食欲。
[0039] 本發明所制備的分子量1.0Χ106以上至2.0Χ106道爾頓的羧甲基茯苓多糖可優選 應用作為注射劑的原料。所制備的注射劑比口服劑更為速效。成年人臨床用藥劑量為30mg_ 180mg/日，優選60mg-150mg/日，每日1次，連用7日為1個療程。
【附圖說明】
[0040] 圖1，已知分子量的標準多糖Dexfran按Ka.V對數Log Mw作圖的分子量標準曲線； [00411圖2，本發明制得分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖在SephadexG-200層析柱上的 洗脫曲線，根據測得的Ka. V值，求得其分子量為0.6 X 104至2.0 X 106道爾頓。
[0042]圖3,本發明合成反應的原理示意圖。
【具體實施方式】
[0043]以下將結合實施例具體說明本發明，本發明的實施例僅用于說明本發明的技術方 案，并非限定本發明的實質。
[0044] 實施例1分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備
[0045] 分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備方法如下：
[0046] 1)干茯苓50kg，粉碎成細粉，投入到浸泡罐中，栗入300L水，攪拌均勻，浸泡12h;
[0047] 2)將250L濃度為2.5mol/L的氫化鈉溶液緩慢栗入浸泡罐中，攪拌反應lh，壓濾，取 濾液；
[0048] 3)在中和罐中投入300L濃度為5.0mol/L的氯乙酸溶液后，再緩緩加入300L濃度為 5.5mol/的氫氯化鈉溶液，攪拌至反應充分，冷卻至室溫；
[0049] 4)將3)步反應液栗入2)步所得濾液中，混勻后，蒸汽加熱升溫至55°C，開始計算反 應時間，每反應持續18min后提高反應溫度1°C，直至反應溫度75°C持續18分鐘后冷卻至55 Γ。
[0050] 5)用6mol/的鹽酸溶液調4)步所得反應液的pH值5.0-7.0,加入相當于反應液3倍 體積的95%乙醇進行醇析，過濾，用90%的乙醇洗滌羧甲基茯苓多糖醇析物；
[0051] 6)羧甲基茯苓多糖醇析物在60°C干燥12h后，105°C干燥2h，得羧甲基茯苓多糖粗 制品 35.0kg.
[0052] 7)將7.5kg羧甲基茯苓多糖粗制品分散于250L雙蒸水中，加入6mol/L的氫氯化鈉 溶液調pH至10.0-13.0;加入1.25L濃度為30%的H 2〇2溶液，室溫脫色反應24h，，去除有色雜 質；加入6mol/L的鹽酸溶液調pH值6.0，3000轉/分離心分離30min，取分離液，分離液用DH-UF中空纖維超濾器濾除分子量0.6 ΧΙΟ4以下的羧甲基茯苓多糖，以及氯化鈉、氯乙酸鈉與 羥乙酸鈉等雜質后，分離液中加入3倍體積的95%乙醇，進行醇析，離心分離，得羧甲基茯苓 多糖醇析物，醇析物用95 %的乙醇洗滌3次，在60 °C干燥12h后，105 °C干燥2h，粉碎，得6. Okg 分子量〇. 6 X 104至2.0 X 1〇6道爾頓的羧甲基茯苓多糖純品。
[0053]分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖具有如下理化性質：
[0054]性狀：白色粉末，無臭，略有引濕性。
[0055]分子式：（C8H12〇7)n聚合度(n): 27<n<9091。
[0056] 分子量:0·6Χ104 至 2.0X106 道爾頓。
[0057] IR[KBr] (cm-1):3700-3000，2900，1600，7，1425·2，1324·9，1078·0，891·0。
[0058] UV(0.1mol/L HC1 溶液、出0、0.10111〇1/1似0!1溶液）：無吸收峰。
[0059] 13C-NMR[H2D](ppm):180.078,104.870,87.697,86.667,84.935,83.145,77.851, 76.490,
[0060] 75.669,73.273,72.296,70.345,62.975 〇
[0061] [a]20D:-1.7〇-1.90(C = 5，H2〇)。
[0062] 1 % 水溶液的 pH值 5 · 0-7 · 0。
[0063] 水份百分含量<8.0%。
[0064] 以氯化鈉計，氯化物<0 · 01 % ;以Pb計，重金屬％<0.0001%，以As計，砷％< 0.0001%。
[0065] 實施例2分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖分子量的測定
[0066] 測定條件:儀器為LKB柱層析系統，SephadexG-200柱。移動相為0.2mol/L的NaCl溶 液(pH值7.0)緩沖溶液，流速0.5ml/min，進樣量(W/V) lmg/ml，恒溫10°C。示差折射自動檢 測，記錄儀記錄峰位。
[0067] 標準曲線：用已知分子量的標準多糖Dexfran T2000(Mw2000000)、T500 (Mw500000)、T40(Mw40000)、T20(Mw20000)、T10(Mw100 00)、T5(Mw5000)制作標準曲線，按 Ka.v對數Log Mw作圖，標準曲線見圖1。
[0068]本發明制得的分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖在Sephadex G200層析柱上的洗 脫曲線參見圖2,根據測得的Ka.V值，求得其分子量(Mw)為0.6X104至2.0X106道爾頓。
[0069] 實施例3酸化法測定分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S)
[0070] 精密稱取分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖樣品0.4020g，置于150ml的燒杯中， 80°C水浴加熱，攪拌使溶解，冷卻后，用2mol/L的鹽酸溶液調pH至4.0，加入無水乙醇100ml， 攪拌均勻，靜置過夜，離心分離醇析物，醇析物用95%的乙醇反復洗滌，至洗滌液中不含氯 離子。洗凈醇析物用〇. 1000m〇l/L的NaOH標準溶液40.00ml溶解，待溶液呈透明狀后，立即用 0.1000m 〇l/L的標準鹽酸溶液反滴定，至酚酞指示劑的紅色剛退去，記錄反滴定所消耗 0.1000m〇l/L的鹽酸標準溶液的體積為21.30ml。
[0071]按照下式計算分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S):
[0072]
[0073] 式中：A為中和lg酸式分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖樣品所消耗的NaOH的m mol 數；
[0074] CNaciH為NaOH標準溶液的濃度(0 · 1000mol/L);
[0075] VNaciH為加入0 · 1000mol/L的NaOH標準溶液的體積數(40 · 00ml);
[0076] Chq為反滴定用的鹽酸標準溶液的濃度(0.1000m〇l/L);
[0077] Vhq為反滴定所消耗0.1000m〇l/L的鹽酸標準溶液的體積數(21.60ml);
[0078] m為樣品的質量(g);
[0079] 0.162為茯苓多糖的失水葡萄糖單元的m mol質量；
[0080] 0.058為失水葡萄糖單元中一個羥基被羧甲基取代后，失水葡萄單元m mol質量的 凈增值。
[0081] 本發明所得分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的羧甲基取代度(D · S)為1.005， 計算過程如下：
[0082]
[0083]
[0084]實施例4羧甲基茯苓多糖口服液的制備
[0085]在潔凈區配料室中，將100L的去離子水栗入潔凈的搪玻璃配料罐中，投入2.0kg的 羧甲基茯苓多糖純品，羧甲基茯苓多糖純品的分子量(Mw)為0.6 X 104至1.0 X 106道爾頓，羧 甲基茯苓多糖的羧甲基取代度為1.005;配料罐的夾層輸入蒸汽，80°C加熱溶解，冷卻、壓 濾、濾液栗入另一洗凈的搪玻璃反應罐中，加入甜蜜素1.5kg、山犁酸1.5kg，攪拌均勻，溶配 液在潔凈區進行自動罐裝，l〇ml/瓶，灌裝畢，封口，置蒸汽消毒柜中115°C滅菌30min，即得。 [0086]實施例5羧甲基茯苓多糖凍干粉針的制備
[0087]在潔凈區配料室中，將100L雙蒸餾水栗入潔凈的搪玻璃配料罐中，投入600g的羧 甲基茯苓多糖純品和1200g注射用氯化鈉，羧甲基茯苓多糖純品的分子量(Mw)為大于1.0 X 106至2.0 X 106道爾頓，羧甲基的取代度為1.005;配料罐的夾層輸入蒸汽，將其加熱至80°C， 保溫30min，攪拌使溶解。冷卻至室溫，用孔徑<1μπι的陶瓷濾捧進行粗濾，粗濾液再用孔徑 <0.5μπι的玻璃濾球進行精濾。精濾液按5ml/瓶在無菌區自動灌裝，灌裝畢，置于無菌室中， 先后在-25°C和_70°C條件下進行冷凍真空干燥，無菌密封，即得。
[0088] 羧甲基茯苓多糖凍干粉針經高溫(40。(：、60。(：、80。(：）、高濕(冊92.5%、冊75%、25 °C)及光照(5000LX)等影響因素試驗后，外觀性狀、澄明度、pH值、含量及無菌檢查均符合要 求。經加速試驗(40 °C、RH75 % )3個月的考察結果，外觀性狀、澄明度、pH值、含量及無菌檢查 均符合要求。經室溫留樣考察1、3、5、12、18、24個月，經定期取樣檢查，各項指標均符合要 求。
[0089]以下通過試驗例驗證本發明制得分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的多種藥理 作用。除非另有說明，本發明試驗例的給藥劑量標準均以純品計。
[0090] 試驗例1分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的增強免疫作用
[0091] 羧甲基茯苓多糖按50mg/kg劑量每日皮下注射昆明種小鼠1次，連用10日，與對照 組醋酸可的松相比，小鼠腹腔巨噬細胞的吞噬率增加84.57% (P<0.01)，吞噬指數增加 110.0%(P<0.05)〇
[0092]羧甲基茯苓多糖按50mg/kg劑量每日皮下注射荷S18Q肉瘤的瑞士小鼠1次，連用10 日，與對照組生理鹽水相比，能使小鼠的腹腔巨噬細的吞噬率與吞噬指數分別增加70.83% (卩<0.01)與112.0%(卩<0.01)。
[0093]羧甲基茯苳多糖按50mg/kg劑量每日皮下注射帶Lewis肺癌的C57純系小鼠 1次，連 用10日，與對照組生理鹽水相比，能使帶Lewis肺癌的C57純系小鼠的腹腔巨噬細胞的吞噬率 與吞噬指數分別增加 142.47% (Ρ<0· 01)與 136.36% (Ρ<0· 05)。
[0094]對ΝΙΗ小鼠按（120-480 )mg/kg劑量灌胃給予羧甲基茯苓多糖，可對抗腫瘤化療藥 物環磷酰胺(Cy)引起的免疫抑制，使NIH小鼠的胸腺、脾臟的重量增加，溶血素抗體的含量 升高，改善和消除環磷酰胺對其的抑制作用，增強腹腔巨噬細胞的吞噬功能，提高NK細胞的 活性，提升白細胞介素-2(IL-2)至正常水平，使荷瘤的NIH小鼠的腫瘤壞死因子(TNF)的含 量明顯增加。
[0095]羧甲基茯苓多糖按(25-200 )mg/kg劑量每日腹腔注射注小鼠1次，連用4日，與對照 組生理鹽水相比，小鼠脾細胞的PFC及SRFC明顯增加(P<0.01)。
[0096] 羧甲基茯苓多糖按100mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用4日，與對照組生理鹽水 相比，小鼠對BSA誘發的DTH反應明顯增強(P < 0.01)。
[0097] 羧甲基茯苓多糖(0.05-500)μg/ml濃度對C57BL/6J和BALB/C小鼠雙向混合脾淋巴 細胞培養的增殖有明顯的促進作用，與不加羧甲基茯苓多糖的雙向混合脾淋巴細胞培養液 比，Ρ<0·05〇
[0098] 羧甲基茯苓多糖(5-100) yg/m濃度與昆明種小鼠的腹腔巨噬細胞共培養，上清液 腫瘤壞死因子-a(TNF-a)分泌增多，與不加羧甲基茯苓多糖的腹腔巨噬細胞共培養液的對 照組比：P<〇.〇5。
[0099] 試驗例2分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的抗腫瘤作用
[0100]羧甲基茯苓多糖（100-300)11^/1^劑灌胃，對1?!1小鼠的518()肉瘤的抑制率為 47·76%-61·94%，而 20mg/kg 劑量的 5-Fu 抑制率為 59.70%，兩者對比 Ρ<0·05。
[0101] 羧甲基茯苓多糖（150-300)mg/kg劑量灌胃，對NIH小鼠的EAC瘤株的抑制率為 39 · 22%-59 · 80%，與對照組生理鹽水比，Ρ值<0 · 05。
[0102] 羧甲基茯苓多糖(25-500)mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用10日，對ICR/JCL小鼠 腫瘤Uw抑制率為75.5%-92.7%，與對照組生理鹽水比，P<0.01。
[0103] 羧甲基茯苓多糖（50-200)mg/kg劑量隔日灌胃，12日后對昆明種小鼠肝癌H22的抑 制率為39.03%-62.24%，與對照組生理鹽水比，P<0.05。
[0104] 羧甲基茯苓多糖25mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用10日，對C57純系小鼠 Lewis肺 癌的抑制率為32.0%，與對照組生理鹽水比，P<0.01。
[0105]羧甲基茯苓多糖(0.1-50)μg/ml濃度對體外培養的昆明種小鼠的S18Q肉瘤與肝癌 H22細胞的生長均有明顯的抑制作用，與不加羧甲基茯苓多糖的體外培養的S18Q肉瘤與肝癌 H22細胞對照組比，P<0.05。
[0106]試驗例3分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的抗病毒作用
[0107]用（0.1-1.0 )mg/kg濃度的羧甲基茯苓多糖預處理人胚肺細胞24小時，棄上清液， 再加不同濃度的濾泡性口腔炎病毒(VSV-Indiana株），于37°C孵育24小時，VSV-Indiana在 人胚肺細胞上所呈現的CPE情況，與不加羧甲基茯苓多糖的對照組比，有顯著區別，O.lmg/ ml為有效間接抗病毒濃度，1. Omg/ml濃度抗病毒效果更顯著，在人胚肌細胞上與人胚肺細 胞上所呈現的間接抗病毒作用是一致的。
[0108]羧甲基茯苓多糖對因感染單純皰疹病毒I型(HSV-I)而引起的豬腎傳代細胞病變 具有保護作用，在感染（1〇-1〇〇)1'(：105()(半細細胞培養感染量)的!^-1的情況下，2.〇1^/1111 濃度的羧甲基茯苓多糖對HSV-I致豬腎傳代細胞的細胞病變(CPE)具有直接的抑制作用，在 感染HSV-I 100TCID5Q的情況下，羧甲基茯苓多糖的ID5Q為0.5mg/ml。
[0109]試驗例4分子量分布廣泛的羧甲基茯多糖的抗放射作用
[0110] 羧甲基茯苓多糖能對抗6<3C〇-r射線所致小鼠末梢白細胞的抑制，試驗組的小鼠按 100mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用7日，然后 6()C〇-r射線照射14.9min(50.4倫琴/min)，總 放射量750倫琴，再繼續給藥5日，試驗組的小鼠的未梢白細胞數與生理鹽水對照組比，增加 69.41%，Ρ<0·05〇
[0111] 試驗例5分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的保肝作用
[0112] 羧甲基茯苓多糖對四氯化碳中毒小鼠的肝臟有保護作用，試驗組小鼠用羧甲基茯 苓多糖按（100、200)mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用5日，對照組小鼠每日腹腔注射等容 積的生理鹽水，連用5日，第5日下午，各組小鼠均由皮下注射0.15%四氯化碳花生油溶液 0.2!111/。16小時后處死小鼠，取血測定血清谷-丙轉氨酶，試駔組小鼠血清谷-丙轉氨酶分別 降低27.32%與41.03%，與生理鹽水對照組比，P<0.01。
[0113]大鼠肝部分切除手術前按100mg/kg劑量每日腹腔注射1次，連用4日，然后部分切 除大鼠的肝左葉與中葉(約占全肝的65%-75%)，手術后再連續給藥3日，停藥2日后處死大 鼠，取肝稱重，大鼠的肝臟再生度與再生肝重/體重分別增加73.29%與18.95%，與生理鹽 水對照組比，Ρ<〇·〇1與Ρ<〇·〇〇1。
[0114] 試驗例6分子式分布廣泛的羧甲基茯苓多糖對睡眠的改善作用
[0115] 試驗組瑞士小鼠按100mg/kg劑量每日腹腔注射羧甲基茯苓多糖1次，連用7日，對 照組瑞士小鼠每日腹腔注射等容積的生理鹽水，連用7日，第7日各組均按50mg/kg劑量腹腔 注射硫噴妥鈉注射液，然后觀察各組小鼠翻正反射消失持續的時間，試驗的結果證明，羧甲 基茯苓多糖能增強硫噴妥納對小鼠中樞的抑制，羧甲基茯苓多糖試驗組的小鼠翻正反射消 失持續的時間為硫噴妥鈉對照組的4.69倍，與硫噴妥鈉對照組比，P<0.05。
[0116] 試驗例7分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人血淋巴細胞活性因子 作用
[0117] 用不同濃度（1.25-100)μg/ml的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人血淋巴細胞干擾 素 -α (Interferon-α，IFN-α)，誘生效價提高6倍，促誘生效價比常規誘生提高10-20倍。
[0118] 用l〇〇μg/ml濃度的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人外周血淋巴細胞干攏素 -γ (1]1七6^61'〇11-1'，]^^-1')、白細胞介素-2(111七61'16111<:;[11-2，11^-2)、白細胞介素-6 (Interleukin-6，IL-6)與腫瘤壞死因子-a(Tumor necrosis factor-a，TNF_a)，誘生效價 分別提高10.9、0.8、0.5、4.0倍，促誘生效價分別比常規誘生提高(0.4-0.6)、（1.2-2.8)、 (0·5-0·8)、（·5-1·1)倍。
[0119] 用lOOμg/ml濃度的羧甲基茯苓多糖誘生與促誘生人外周血淋巴細胞粒-巨噬細胞 集落刺激因子（Granulocyte-macrophage colony-stimularting factor，GM_CSF)，效價可 達8X104U/ml 以上。
[0120] 綜上所述，羧甲基茯苓多糖主要通過如下作用機理發揮其多種藥理作用：
[0121] 1)依賴宿主的免疫系統，增強機體免疫力（特異性與非特異性），抑制與殺傷腫瘤 細胞。通過激活補體，誘生多種淋巴細胞活性因子，增強巨噬細胞、NK細胞、T淋巴細胞與B淋 巴細胞的活性，多途徑協同增效發揮抗腫瘤、抗病毒作用。
[0122] 2)抑制腫瘤細胞DNA、RNA合成，直接殺死殺傷腫瘤細胞。
[0123] 3)提高腫瘤細胞膜上的唾液酸(SA)含量、抑制PT轉換、降低花生四烯酸(C2Q)等含 量，多途徑抑制腫瘤細胞的分裂與增殖。
[0124] 4)增強肝臟S0D活性，清除氧自由基，化解致癌物質，防止正常細胞DNA變異。
【主權項】
1. 一種分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多糖的制備方法，其特征在于:包括如下步驟：1) 茯苓粉加入到水或水醇混合液中，攪拌均勻后，加入2.0-8. Omol/L的堿性溶液，攪拌至完全 溶解，得茯苓多糖堿化液;2) 2.0-1 Omo 1 /L氯乙酸與適當過量的2.0-1 Omo 1 /L堿性溶液充分 反應后，加入到1)步所得的茯苓多糖堿化液中，在30°C至90°C逐步升溫的條件下進行合成 反應，分離純化生成的羧甲基茯苓多糖，即得，其羧甲基取代度大于1.000;所述適當過量是 指堿性溶液中堿性物質的實際用量比其與氯乙酸中和所需理論用量過量2.0-20%。2. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多 糖，其分子量分布范圍為0.6 X 104至2.0 X 106道爾頓。3. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多 糖分離純化得到分子量分布0.6 X 104至1.0 X 106道爾頓的組分。4. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述分子量分布廣泛的羧甲基茯苓多 糖分離純化得到分子量分布1.0 X 1〇6以上至2.0 X 106道爾頓的組分。5. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述茯苓多糖堿化液可用茯苓粉加入 到水或水醇混合液中，攪拌均勻后用2.0-8.0%mol/L的堿性溶液攪拌提取，壓濾分離，取濾 液，即得。6. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于：所述氯乙酸溶液的濃度為2.0-10·0mol/L。7. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述適當過量是指堿性溶液中堿性物 質的實際用量比其與氯乙酸中和所需理論用量過量2.0_20% 〇。8. 根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于:所述茯苓多糖堿化液與氯乙酸鈉溶液 在適當過量的堿液中合成反應，反應溫度優選55°C持續18min以后每升1°C持續18min，直至 升溫到75°C持續18min后冷卻至55°C。9. 一種根據權利要求3所述的制備方法得到的分子量分布0.6 X 104至1.0 X 106道爾頓 的羧甲基茯苓多糖的組分作為羧甲基茯苓多糖口服制劑的原料的應用。10. -種根據權利要求4所述的制備方法得到的分子量分布1.0 X 106以上至2.0 X 106道 爾頓的羧甲基茯苓多糖的組分作為羧甲基茯苓多糖注射制劑的原料的應用。
【文檔編號】A61P1/14GK106008736SQ201610489621
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月28日
【發明人】陳春霞
【申請人】陳勇, 陳雄, 陳一雄, 陳春霞