抗人pd-1人源化單克隆抗體及其應用
【專利摘要】本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種抗人PD?1人源化單克隆抗體及其應用。本發明通過篩選得到了具有良好特異性、較高的親和性和穩定性的抗人PD?L1人源化單克隆抗體，該抗體能夠特異性地與人PD?1結合，并且不結合CD28家族其它成員，阻斷PD?L1與PD?1相結合，部分恢復T細胞的功能，對腫瘤生長具有顯著的抑制作用。
【專利說明】
抗人PD-1人源化單克隆抗體及其應用
技術領域
[0001] 本發明涉及生物醫藥領域，尤其涉及一種抗人ro-i人源化單克隆抗體及其應用。
【背景技術】
[0002] T細胞活化需要兩個信號，第1信號來自T細胞抗原受體(TCR)與抗原肽-MHC復合物 的結合，為抗原特異性的;第2信號即協同刺激信號，由T細胞上粘附分子的受體與抗原提呈 細胞(APC)上相應的配體結合，為抗原非特異性的。第2信號在T細胞活化中具有重要的作 用，若無協同刺激分子提供第2信號，T細胞識別抗原后將處于無應答狀態或凋亡。CD28/ CTLA-4與其配體B7-UB7-2的結合為T細胞活化所必需的協同刺激通路，參與機體抗原特異 性體液免疫和細胞免疫。CD28-B7家族的新成員，包括：ICOS(inducible costimulator)及 其配體B7RP-1 以及PD-1 (programmed death-1)及其配體PD-L1 和PD-L2<XD28和IC0S可傳遞 協同刺激(陽性)信號;而CTLA-4和ro-i則傳遞抑制性(陰性)信號。T細胞活化的陽性和陰性 信號之間的平衡，對機體抵抗外來抗原的入侵，防止自身免疫反應的發生起著關鍵作用。
[0003] PD-1是55KD的跨膜蛋白，與CD28、IC0S和細胞毒性T淋巴細胞（CTL)相關抗原4 (CTLA-4)同屬免疫球蛋白超家族成員。其胞外區只有1個IgV樣區，與CTLA-4有23%的同源 性，但無結合B7-1/B7-2必需的MYPPPY基序；胞漿區有2個酪氨酸殘基，尾部有1個ITIM (immunoreceptor tryosine-based inhibitory motif)，而無 YXXM基序。其他CD28家族中 的成員以二硫鍵連接的同源二聚體形式而存在，而Η)-1則以單體形式存在。與CD28、CTLA-4 的局限性表達（主要在T細胞）不同，PD-1可表達于活化的T細胞、B細胞和骨髓細胞，以及 CD4-CD8-胸腺細胞。
[0004] ro-i有兩個配體，ro-Ll(B7-Hl)和ro-L2(B7-DC)，均為B7家族中的新成員，胞外都 有1個IgV樣區和1個IgC樣區。PD-L1含有290個氨基酸，其胞外區與B7-UB7-2分別有20%和 15%的同源性，胞漿區變化多樣，但二級結構同B7-UB7-2非常相似。在基因水平上TO-L2與 PD-L1有37.4%的同源性。？0-1^1和?0-1^的表達與調節不同。？0-1^11111^^在非淋巴組織(如胎 盤、心、肺和骨骼肌）中含量豐富，但除巨噬樣細胞和胎盤滋養層外，PD-L1蛋白在正常組織 中幾乎檢測不到。在APC、T細胞和內皮細胞上經誘導可表達ro-Ll，而且多種人類的腫瘤中 富含ro-Ll。相反，PD-L2僅在樹突狀細胞(DC)和單核細胞上表達。用IFN- γ處理DC和單核細 胞后，PD-L1和PD-L2的表達均上調。但是，實際上PD-L1和PD-L2分別受Thl和Th2型細胞的調 節。在巨噬細胞上，Th 1細胞分泌的IFN- γ可經轉錄因子STAT1上調H)-L 1的表達;而IFN- γ 需經IL-4才能誘導PD-L2表達，STAT6參與了 IL-4下游的信號傳導，提示PD-L2的表達受Th2 細胞的調節。
[0005] ro-i是免疫抑制性受體，與其配體ro-Li、ro-L2相互作用傳遞抑制性信號，在免疫 應答中發揮負向調控作用。PD-1與PD-L1 /PD-L2的結合，可抑制TCR介導的淋巴細胞增殖和 細胞因子(IL-2、IFN-y及IL-10)產生，導致細胞周期停滯，但不增加細胞死亡。分別阻斷DC 上H)-Ll、ro-L2的表達，可導致T細胞增殖和細胞因子（IFN-γ和IL-10)產生增加，且同時阻 斷二者表現的作用相加，表明H)-L1和PD-L2的功能是抑制T細胞活化。PD-1也可參與B細胞 應答的負調節。PD-1信號傳導的作用是抑制B細胞增殖、分化、Ig類型轉換，在建立和/或維 持外周自身耐受中起重要作用。PD-1抑制BCR介導的信號轉導的分子機制（Molecular Mechanisms)是:PD-1通過其所含SH2區的酪氨酸磷酸酶2(SHP-2)，使BCR信號轉導的重要信 號換能器去磷酸化，從而抑制效應分子的酪氨酸磷酸化，包括Igf3、Syk、PLC-y2&ERKl/2。 該抑制作用不需要Ι??Μ N-末端的酪氨酸，而需要C-末端的其他酪氨酸殘基。
[0006] PD-1在抑制TCR介導的T細胞活化的同時，可減弱IC0S、IL-4和IL-21的作用，但不 影響CD28、IL-7和IL-15的效應。然而Η)-1信號傳導能夠抑制亞理想水平的CD28介導的協同 刺激作用。在某些情況下，PD-1 - PD-L通路可能是第2位的或后備的，只有當⑶28-B7協同刺 激通路缺乏或處于亞理想水平時，該通路才能發揮調節T細胞應答的作用。在其他情況下， 該通路對T細胞活化或分化起核心作用，這可能有賴于正在進行的免疫應答的特定階段。 APC上抑制性ro-Ll/ro-L2和協同刺激B7-1/B7-2信號的相對水平，可能影響T細胞活化的程 度，決定廣生耐受還是自身免疫。PD-Li在非淋巴組織上的表達，提不ro-i -ro-L可能是通 過抑制自身反應性Τ、Β細胞和效應T細胞而誘導免疫耐受及調節局部的炎癥反應。
[0007] 腫瘤細胞所具有的逃避免疫系統的能力，是通過在其表面產生的程序性死亡配體 (PD-L1)結合到τ細胞的ro-i蛋白上實現的。機體內的腫瘤微環境會誘導浸潤的Τ細胞高表 達ro-i分子，腫瘤細胞會高表達PD-1的配體PD-L1和PD-L2，導致腫瘤微環境中ro-i通路持 續激活，T細胞功能被抑制而不能發現腫瘤以至于不能向免疫系統發出需要攻擊腫瘤和殺 傷腫瘤細胞的治療。
[0008] PD-1抗體是針對PD-1的一種抗體蛋白，使得前兩種蛋白不能發生結合，阻斷這一 通路，部分恢復T細胞的功能，使這些細胞能夠繼續殺傷腫瘤細胞。2014年7月，PMDA批準全 人源化IgG4抗Η)-1單克隆抗體Nivolumab在日本上市，用于治療晚期黑色素瘤，成為首個獲 得主要監管機構批準的PD-1抗體。20 15年，？04先后批準默沙東的1^7^11(1& (pembrolizumab)和百時美施貴寶的0PDIV0( nivolumab)兩種]^-1抗體上市。
【發明內容】
[0009] 為解決上述技術問題，本發明的目的是提供一種具有良好特異性、較高的親和性 和穩定性的抗人ro-i人源化單克隆抗體。
[0010]本發明第一方面涉及抗人ro-i人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括選自 于如下一組的⑶R區：
[0011] 重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID 勵：17-19所示，輕鏈0)1?1、001?2、0)1?3 的序列分別如SEQ ID N0:35-37所示，或與上述序列結合相同抗原表位的序列。
[0012] 進一步的，本發明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其還包括選 自于如下的重鏈可變區框架區：FRl、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 :20-23所示，或 分別與上述序列的同一性大于70%、80%、85%、90%、95%、99%的序列。
[0013] 進一步的，本發明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其還包括選 自于如下的輕鏈可變區框架區：FRl、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 :38-41所示，或 分別與上述序列的同一性大于70%、80%、85%、90%、95%、99%的序列。
[0014] 進一步的，本發明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括選自 于如下的重鏈可變區：其序列如SEQ ID N0:16所示，或與上述序列結合相同抗原表位的序 列。
[0015] 進一步的，本發明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其包括選自 于如下的輕鏈可變區：其序列如SEQ ID N0:34所示，或者分別與上述序列的同一性大于 70%、80%、85%、90%、95%、99% 的序列。
[0016] 具體的，本發明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其重鏈的序列 如SEQ ID N0:8所示。
[0017] 具體的，本發明中抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其輕鏈的序列 如SEQ ID N0:25所示。
[0018] 根據本發明第二方面任一項的核酸分子，其包含能夠編碼抗體重鏈可變區的核酸 序列，所述重鏈可變區包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0019] (l)SEQ ID N0：17-19；
[0020] (2)與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個的序列:a)結合相同抗原表位； b)同一性大于 70%、80%、85%、90% 或 97%。
[0021 ]進一步的，所述重鏈可變區包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0022] SEQ ID N0:16,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個的序列：a)結合相同 抗原表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區中含有一個到 幾個核苷酸的替換。
[0023]在本發明的實施方案中所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:5所示的序列。
[0024] 進一步的，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:7所示的序列。
[0025] 根據本發明第三方面任一項的核酸分子，其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區的核酸 序列，所述輕鏈可變區包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0026] (l)SEQ ID NO：35-37；
[0027] (2)與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個的序列:a)結合相同抗原表位； b)同一性大于 70%、80%、85%、90% 或 97%。
[0028] 進一步的，所述輕鏈可變區包含選自如下一組的氨基酸序列：
[0029] SEQ ID N0:34,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個的序列：a)結合相同 抗原表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區中含有一個到 幾個核苷酸的替換。
[0030]在本發明的實施方案中，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:26所示的序列。 [0031] 進一步的，所述核酸分子包含選自如SEQ ID N0:24所示的序列。
[0032] 本發明第四方面涉及載體，其含有本發明第二或第三方面任一項的核酸分子。
[0033] 進一步的，本發明中所指的載體含有本發明第二方面任一項的核酸分子和第三方 面任一項的核酸分子。
[0034]本發明第五方面涉及宿主細胞，其含有本發明第二或第三方面任一項的核酸分子 或本發明第四方面任一項的載體。
[0035]本發明第六方面涉及偶聯物，其含有本發明第一方面任一項的抗人ro-i人源化單 克隆抗體或其抗原結合部分，以及其它生物活性物質，所述抗人PD-1人源化單克隆抗體或 其抗原結合部分直接或通過連接片段與其它生物活性物質偶聯。
[0036]在本發明的實施方案中，所述其它生物活性物質選自可直接或間接抑制細胞生長 或殺滅細胞、或通過激活機體免疫反應從而抑制或殺滅細胞，從而達到治療腫瘤的化學物 質、毒素、多肽、酶、同位素、細胞因子或其他具有生物活性的單一物質或混合物質。
[0037] 本發明第七方面涉及組合物(例如藥物組合物），其含有本發明第一方面任一項的 抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分、第二方面或第三方面任一項的核酸分子、 第四方面任一項的載體、第五方面任一項的宿主細胞、或者本發明第六方面任一項的偶聯 物，以及任選的藥學上可接受的載體或賦形劑，以及任選的其它生物活性物質。
[0038] 根據本發明第七方面任一項的組合物(例如藥物組合物），所述其它生物活性物質 包括但不限于其它抗體、融合蛋白或藥物(例如抗腫瘤藥物，如放、化療藥物）。
[0039] 本發明還涉及診斷試劑或試劑盒，其含有本發明第一方面任一項的抗人ro-i人源 化單克隆抗體或其抗原結合部分，所述診斷試劑或試劑盒用于在體外(例如細胞或組織)或 體內（例如人或動物模型)診斷與ro-ι相關的疾病(例如腫瘤或病毒感染，例如ro-Li高表達 的病毒感染或ro-Li高表達的腫瘤）。
[0040] 在本發明的實施方案中，所述腫瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、黑 色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質瘤、胃癌、鼻咽癌、喉 癌、宮頸癌、子宮體癌、骨肉瘤、甲狀腺癌、前列腺癌;所述病毒感染包括但不限于急性、亞急 性或慢性耶￥、!1(^、!11￥感染。
[0041] 本發明還涉及本發明第一方面任一項的抗人PD-1人源化單克隆抗體或其抗原結 合部分、第二方面或第三方面任一項的核酸分子、第四方面任一項的載體、第五方面任一項 的宿主細胞、第六方面任一項的偶聯物或第七方面任一項組合物用于制備預防或治療與 ro-ι相關的疾病(例如腫瘤，微生物或病毒感染，例如ro-Li高表達的腫瘤或ro-Li高表達的 病毒感染)的藥物的用途。
[0042] 在本發明的實施方案中，所述腫瘤包括但不限于肺癌、卵巢癌、結腸癌、直腸癌、黑 色素瘤、腎癌、膀胱癌、乳腺癌、肝癌、淋巴瘤、惡性血液病、頭頸癌、膠質瘤、胃癌、鼻咽癌、喉 癌、宮頸癌、子宮體癌、骨肉瘤、甲狀腺癌、前列腺癌;所述微生物感染包括但不限于細菌、真 菌、原生動物感染;所述病毒感染包括但不限于急性、亞急性或慢性HBV、HCV、HIV感染。
[0043] 以下對本發明做進一步描述:在本發明中，除非另有說明，否則本文中使用的科學 和技術名詞具有本領域技術人員所通常理解的含義。并且，本文中所用的蛋白質和核酸化 學、分子生物學、細胞和組織培養、微生物學、免疫學相關術語和實驗室操作步驟均為相應 領域內廣泛使用的術語和常規步驟。同時，為了更好地理解本發明，下面提供相關術語的定 義和解釋。
[0044] 在本發明中，術語"抗體"是指通常由兩對相同的多肽鏈(每對具有一條"輕"（L)鏈 和一條"重"（H)鏈)組成的免疫球蛋白分子。抗體輕鏈可分類為κ和λ輕鏈。重鏈可分類為μ、 I γ、α或ε，并且分別將抗體的同種型定義為IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在輕鏈和重鏈內，可 變區和恒定區通過大約12或更多個氨基酸的"J"區連接，重鏈還包含大約3個或更多個氨基 酸的"D"區。各重鏈由重鏈可變區（V H)和重鏈恒定區（CH)組成。重鏈恒定區由3個結構域 (CH1、Ch2和Ch3 )組成。各輕鏈由輕鏈可變區（VL)和輕鏈恒定區（α)組成。輕鏈恒定區由一個 結構域α組成。抗體的恒定區可介導免疫球蛋白與宿主組織或因子，包括免疫系統的各種 細胞(例如，效應細胞)和經典補體系統的第一組分(Clq)的結合。V H和VL區還可被細分為具 有高變性的區域(稱為互補決定區(CDR))，其間散布有較保守的稱為構架區(FR)的區域。各 VH和VL由按下列順序:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4從氨基末端至羧基末端排列的3 個CDR和4個FR組成。各重鏈/輕鏈對的可變區(VH和VL)分別形成抗體結合部位。氨基酸至各 區域或結構域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health，Bethesda，Md·(1987and 1991))，或Chothia&Lesk (1987) J.Mol .Biol .196 :901-917 ;Chothia等人（1989)Nature 342:878-883的定義。術語 "抗體"不受任何特定的產生抗體的方法限制。例如，其包括，特別地，重組抗體、單克隆抗體 和多克隆抗體。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgGl，IgG2，IgG3或IgG4亞 型），IgAl，IgA2，IgD，IgESlgi^j^·^。
[0045] 在本發明中，術語抗體的"抗原結合部分"是指全長抗體的一個或多個部分，所述 部分保持結合抗體所結合的相同抗原(例如，PD-1)的能力，與完整抗體競爭對抗原的特異 性結合。通常參見，Fundamental Immunology，Ch· 7(Paul，W.，ed·，第2版，Raven Press， N.Y. (1989)，其以其全文通過引用合并入本文，用于所有目的。可通過重組DNA技術或通過 完整抗體的酶促或化學斷裂產生抗原結合部分。在一些情況下，抗原結合部分包括Fab、 Fab'、F(ab'）2、Fd、Fv、dAb和互補決定區（Q)R)片段、單鏈抗體(例如，scFv)、嵌合抗體、雙抗 體(diabody)和這樣的多肽，其包含足以賦予多肽特異性抗原結合能力的抗體的至少一部 分。
[0046] 借由上述方案，本發明至少具有以下優點：本發明通過篩選得到了具有良好特異 性、較高的親和性和穩定性的抗人PD-1人源化單克隆抗體，該抗體能夠特異性地與人PD-1 結合，并且不結合CD28家族其它成員，對腫瘤生長具有顯著的抑制作用。
[0047] 上述說明僅是本發明技術方案的概述，為了能夠更清楚了解本發明的技術手段， 并可依照說明書的內容予以實施，以下以本發明的較佳實施例并配合附圖詳細說明如后。
【附圖說明】
[0048]圖1是鼠源Η)-1抗體的ELISA結合活性結果圖；
[0049] 圖2是鼠源ro-Ι抗體的ELISA抑制活性結果圖；
[0050] 圖3是鼠源ro-i抗體的細胞結合活性結果圖；
[0051 ]圖4是鼠源ro-i抗體的細胞抑制活性結果圖；
[0052] 圖5是鼠源ro-i抗體的MLR實驗結果圖；
[0053] 圖6是人源化ro-i抗體的ELISA直接結合活性結果圖；
[0054] 圖7是人源化ro-i抗體的ELISA抑制結合活性結果圖；
[0055] 圖8是人源化ro-i抗體細胞結合活性結果圖；
[0056] 圖9是人源化ro-i抗體人源化ro-i抗體在混合淋巴細胞反應中對細胞因子IFN-γ 分泌的影響圖；
[0057] 圖10是人源化PD-1抗體人源化PD-1抗體在混合淋巴細胞反應中對細胞因子IL-2 分泌的影響圖；
[0058] 圖11是人源化ro-i抗體在血清中的穩定性結果圖；
[0059] 圖12是人源化ro-i抗體與人CD28、CTLA-4的結合特異性及與不同物種的ro-i蛋白 的結合結果圖。
【具體實施方式】
[0060] 下面結合附圖和實施例，對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細描述。以下實施 例用于說明本發明，但不用來限制本發明的范圍。
[0061] 實施例一鼠源抗體篩選
[0062] 1.1動物免疫
[0063] 采用經典的免疫時間表，對BALB/c小鼠免疫，免疫原為hPD-Ι (人源Η)-1)蛋白（購 自北京義翹神州生物技術有限公司），以使動物產生抗hPD-Ι的抗體，具體方案如表1所示： [0064]表ihro-ι蛋白動物免疫方案
[0065]
[0066]
[0067] 1.2細胞融合及雜交瘤細胞篩選
[0068] 融合前調整小鼠骨髓瘤SP2/0的狀態，保證其生長密度不超過于1.0X106個細胞， 提前3天進行終免，終免采用尾靜脈注射的方式，提前一天準備飼養細胞，鋪板數量為2.0 X 104個細胞/孔。通過PEG融合，保證脾細胞與SP2/0細胞的數量比在10:1到5:1之間，每孔所 鋪脾細胞數量不超過1.0X10 5。融合7天以后收獲上清液并更換培養基。
[0069]收獲的上清液首先通過直接ELISA結合方法進行初篩，將篩得的陽性克隆擴增后 收上清液進行復篩。
[0070]復篩采用細胞結合以及細胞抑制實驗進行兩輪篩選，篩選得到的陽性克隆采用有 限稀釋法進行亞克隆，鋪96孔板，分別為5個/孔，2個/孔和1個/孔。培養7天后采用直接 ELISA結合實驗進行篩選，挑選陽性亞克隆進行擴增并保種。
[0071 ]其中，所涉及的各實驗方法的具體步驟如下：
[0072] A、ELISA 結合方法
[0073] 包被hPD-1-Fc在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠 -HRP，顯 色，讀數擬合出反應曲線，計算出EC50值。
[0074] B、細胞結合實驗
[0075]提前一天將hPD-1-Fc過表達細胞鋪至用于檢測培養的細胞板，次日封閉后加入梯 度稀釋的抗體，再加入anti-mouse-EU，讀數即可。
[0076] C、細胞抑制實驗
[0077]提前一天將hPD-1-Fc過表達細胞鋪至用于檢測培養的細胞板，次日封閉后加入梯 度稀釋的抗體，再加入FOl-Fc-Biotin，再加入Europium-labeled streptavidin，讀數即 可。
[0078] 1.3鼠源抗體的制備及活性鑒定
[0079] 將挑選陽性亞克隆的雜交瘤細胞接種至SFM培養基內，培養7天左右，收集上清，離 心過濾后用Protein G純化柱純化，純化抗體分別進行ELISA結合活性、ELISA抑制活性、細 胞結合活性、細胞抑制活性檢測和mlr實驗。經過篩選，獲得活性最高的一株鼠源抗ro-i單 克隆抗體，命名為mouse anti-PD-1。
[0080] 其中，所涉及的各實驗方法的具體步驟如下：
[0081] A、ELISA 結合活性
[0082] 包被PD1-His在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠-HRP，顯 色，讀數擬合出反應曲線，結果如圖1所示，計算出EC50值，其與hPD-Ι結合活性EC50為 2.402ng/mL〇
[0083] B、ELISA 抑制活性
[0084] 梯度稀釋的抗體和一定濃度的roi-Fc-His預先孵育，再將混合物加入到包被roi-Fc的板上，孵育洗滌后再加入anti-His-HRP，顯色，讀數擬合出反應曲線，結果如圖2所示， 計算IC50值，其抑制活性IC50為3.827nM。
[0085] C、細胞結合活性
[0086] 提前一天將H)1-27(PD1過表達CH0-K1穩轉細胞)鋪至用于檢測培養的細胞板，次 日封閉后加入梯度稀釋的抗體，洗滌再加入ant i-mouse-EU，然后洗滌加入熒光增強液，讀 數即可，擬合出反應曲線，結果如圖3所示，計算出其細胞結合活性EC50為87.80ng/mL。 [0087] D、細胞抑制活性
[0088] 提前一天將H)1-27(PD1過表達CH0-K1穩轉細胞)鋪至用于檢測培養的細胞板，次 日封閉后加入梯度稀釋的抗體，再加入HH-Fc，洗滌加入anti-Human-EU，然后洗滌加入熒 光增強液，擬合出反應曲線，結果如圖4所示，計算出其細胞抑制活性IC50為284. Ing/mL。
[0089] e、MLR 實驗
[0090] 將磁珠分選出來的⑶4+T細胞和DC細胞以一定比例混合鋪板，再加入不同濃度的 anti-PDl鼠單抗，培養5天后，用試劑盒檢測IFN- γ的濃度，結果如圖5所示，anti-PDl鼠單 抗能顯著促進IFN- γ的表達
[0091] 實施例二鼠源抗體人源化及親和力成熟
[0092] 2.1鼠源抗體基因獲取
[0093] 米用Purelink RNA Micro kit提取mouse anti-PD-1 雜交瘤總RNA，之后用 PrimeScript? II 1st Strand cDNA Synthesis Kit逆轉錄總RNA制備cDNA。分別用Leader primer擴增抗體的重鏈及輕鏈可變區，反應體系及PCR條件分別如表2和表3所示。
[0094] 表2鼠源抗體基因 cDNA PCR反應體系 Γ00951
[0096] 表3鼠源抗體基因 cDNA PCR反應條件
[0097]
[0098] 電泳分析PCR結果，在有擴增產物的反應管中加入0.5μ1 LA Taq酶，72°C反應 lOmin。之后進行酶連，反應體系如表4所示。
[0099] 表4酶連反應體系
[0100]
[0101]酶連完成后轉化，挑克隆，保種，得到鼠源抗人PD-1抗體。測序后，得到其重鏈可變 區核酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:1和2所示，輕鏈可變區核酸序列和氨基酸序列 分別如SEQ ID NO:3和4所示。
[0102] 2.2人源化設計
[0103]分析鼠源抗體序列，與人胚系（germ line)基因比對，最終確定重鏈FR1模板來源 于HM855688(IGHV3-21*04)，重鏈FR2模板來源于L06614(IGHV3-30*07)，重鏈FR3模板來源 于M77327(IGHV3-30*15)，并確定輕鏈的人源化模板為X63397(IGKV2-28*01)。通過CDR-grafting，將重鏈和輕鏈的CDR并置到構架序列，構建人源化抗體，基因合成人源化抗體可 變區的片段。得到其重鏈可變區核酸序列如SEQ ID N0:5所示，輕鏈可變區核酸序列如SEQ ID N0:6所示。
[0104] 2.3抗體庫構建
[0105] 分析鼠源抗體CDR的DNA序列，確定可變區CDR中的突變位點。設計引物序列，將突 變位點所在的位置設計為NNS，使之編碼任意的氨基酸。以人源化抗體scFv為模板，PCR擴增 scFv抗體庫，將scFv的抗體庫，通過sfH酶切位點，構建到噬菌體質粒中，構建二級抗體庫。
[0106] 2.4抗體庫篩選
[0107]然后通過噬菌體展示進行高親和力抗體篩選，具體方法如下：
[0108] A、通過電轉化，將含scFv的抗體庫的噬菌體質粒轉化到大腸桿菌TG1中，經過37 °C，220rpm，lh的恢復后，將輔助菌體(helper phage)加入到剩余的菌液中，另加入氨節 西林，37°C，220rpm，lh。2500rpm X 5min離心去上清，用2 X YT-AK培養基吹懸菌泥，37 °C， 220rpm過夜培養；
[0109] B、包被抗原:用包被緩沖液稀釋roi-Fc-His，混勻加入到免疫管中，4°C包被過夜；
[0110] C、重組噬菌體收集:上述過夜培養菌液，2500rpmX5min離心，收集上清10ml，加入 2ml PEG/NaCl，混勻放置冰上30-60min，10000g X 20min離心，去上清，用2 X YT培養基溶解 噬菌體庫；
[0111] D、封閉：免疫管用PBS洗兩次，加入封閉液，室溫lh。另外，取等體積封閉液與噬菌 體庫混合，室溫封閉l〇-15min;
[0112] E、孵育噬菌體庫:免疫管用PBS洗2次，加入封閉好的噬菌體庫，37 °C培養箱2-3h;
[0113] F、洗脫：取100μΙ TG1菌液（前一天接種）到10ml 2XYT中，37°C，220rpm培養到 A600值0.4-0.5。用TOST洗滌免疫管8次，再用roS洗2次，加入5ml對數期生長的菌液，37 °C， 220rpm,lh；
[0114] G、0UTPUT:稀釋上述菌液至10-\10-2,分別取100ul涂平板；
[0115] H、下一輪篩選:取200μ1 helper phage加入到5ml洗脫后的菌液中，同時加入5μ1 氨芐西林，37°(：，220鄺111，111。2500印111\5111丨11離心去上清，用1011112\￥1^1(吹懸菌泥，37°(：， 220rpm過夜培養。
[0116] 重復步驟B-H。
[0117] 經過三輪篩選，挑選單克隆，制備重組噬菌體，通過Phage ELISA方法，檢測重組噬 菌體活性，具體如下：
[0118] 八、包被詘0-1+(：，4°(：過夜；
[0119] B、PBST 洗兩次，加入 phage 上清，25°C，lh;
[0120] C、PBST 洗三次，加入稀釋的 anti-M13-biotinAb，25°C，lh;
[0121] D、PBST洗三次，加入稀釋的HRP-streptavidin，25°C，lh;
[0122] E、PBST洗三次，加入預熱的TMB，25°C，10min，加入1M H2S04中止反應，0D450檢測 吸光值。挑選陽性克隆，送測序，通過PCR，重鏈可變區或輕鏈可變區拼接至其對應的人源抗 體的恒定區序列，擴增的抗體重鏈和輕鏈全長片段(包含信號肽)分別克隆入PCDNA3.1GS。 共轉染輕鏈質粒、重鏈質粒至EXPI 293細胞株，培養7天后，用Protein A(GE)純化上清，最 終獲得親和力成熟抗體。親和力成熟抗體分別進行Elisa結合活性、Elisa抑制活性和Cell 結合活性檢測。
[0123] A、ELISA 結合活性
[0124] 包被PD1-His在板上，加入梯度稀釋的抗體，孵育洗滌后，再加入羊抗鼠-HRP，顯 色，讀數擬合出反應曲線，結果如圖6所示，計算出EC50值，其與hPD-Ι結合活性EC50為 6.094ng/mL〇
[0125] B、ELISA 抑制活性
[0126] 梯度稀釋的抗體和一定濃度的roi-Fc-His預先孵育，再將混合物加入到包被roi-Fc的板上，孵育洗滌后再加入anti-His-HRP，顯色，讀數擬合出反應曲線，結果如圖7所示， 計算IC50值，其抑制活性IC50為406.1nM。
[0127] C、細胞結合活性
[0128] 提前一天將H)1-27(PD1過表達CH0-K1穩轉細胞)鋪至用于檢測培養的細胞板，次 日封閉后加入梯度稀釋的抗體，洗滌再加入ant i-mouse-EU，然后洗滌加入熒光增強液，讀 數即可，擬合出反應曲線，結果如圖8所示，計算出其細胞抑制活性IC50為103.2ng/mL。 [0129] 2.5抗體篩選結果
[0130] 經過三輪篩選，挑選單克隆76個進行檢測，選擇其中40個克隆測序，結果顯示，克 隆序列與原始的人源化抗體可變區序列一致。將人源化抗體可變區序列與人源抗體的恒定 區序列拼接，形式全抗體序列，構建表達質粒P3 . lGS-hup01-HC和P3 . lGS-hup01-LC，瞬轉 293細胞制備抗體并檢測抗體活性。
[0131] anti-ro-Ι重鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:7和8所示。其中，重鏈 可變區核苷酸序列為：
[0132] GAGGTGCAACTGGTGGAAAGCGGCGGAGGACTGGTGAAGCCCGGAGGATCCCTGAGGCTGTCCTGTGCCGCCTCCGG CTTCACCTTCAGCAGCTACACCATGTCCTGGGTGAGGCAGGCTCCCGGAAAGGGCCTGGAGTGGGTGGCTACCATCA GCAACGGAGGCTCCTTCACCTATTACCCTGACTCCATGAAGGGCAGGTTCACAATCTCCCGGGACAACTCCAAGAAC ACCCTGTACCTGCAGATGTCCAGCCTGAGGGCTGAGGACACCGCCGTGTATTACTGCGCCAGGGACAGCGACTATTA CGGCATCTTCGACTACTGGGGCCAGGGAACAACCGTGACAGTGAGCTCC(SEQ ID NO：5)
[0133] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號分別為SEQIDN0:9-ll;未劃橫線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號分別為SEQIDN0:12-15。
[0134] 對應的，重鏈可變區氨基酸序列為：
[0135] EVQLVESGGGLVKPGGSLRLSCAASGFTFSSYTMSffVRQAPGKGLEffVATISNGGSFTYYPDSMKGRFTISRDNSKN TLYLQMSSLRAEDTAVYYCARDSDYYGIFDYWGQGTTVTVSS(SEQ ID NO：16)
[0136] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號分別為SEQIDN0:17-19;未劃橫線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號分別為SEQIDN0 :20-23。
[0137] anti-ro-1輕鏈核苷酸序列和氨基酸序列分別如SEQ ID N0:24和25所示。其中，輕 鏈可變區核苷酸序列為：
[0138] GACATCGTGATGACCCAGTCCCCTCTGTCCCTGCCTGTGACACCCGGAGAGCCTGCCTCCATCAGCTGCAGGAGCTC CAAGAGCCTGCTGTACAAAGACGGCAAGACCTACCTGAACTGGTATTTACAGAAGCCTGGCCAGTCCCCCCAGCTGC TGATCTACCTCATGTCCACCAGGGCCTCCGGAGTGCCTGATCGGTTCAGCGGATCCGGCAGCGGCACCGATTTCACC CTCAAGATCTCCAGGGTGGAGGCCGAGGACGTGGGAGTGTACTATTGCCAGCAGCTGGTGGAGGACCCCTTCACCTT CGGCCAAGGCACAAAGCTGGAGATCAAGAGGACTGTG(SEQ ID NO：26)
[0139] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號分別為SEQIDN0:27-29;未劃橫線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號分別為SEQIDN0 :30-33。
[0140] 對應的，輕鏈可變區氨基酸序列為：
[0141] DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSKSLLYKDGKTYLNVYLQKPGQSPQLLIYLMSTRASGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCQQLVEDPFTFGQGTKLEIKRTY(SEQ ID NO：34)
[0142] 橫線部分分別為CDRl、CDR2、CDR3，其序列編號分別為SEQIDN0:35-37;未劃橫線 部分分別為FRl、FR2、FR3、FR4，其序列編號分別為SEQIDN0:38-41。
[0143] 實施例三人源化抗體表達質粒構建
[0144] 以P3. lGS-hup01-HC和P3. lGS-hup01-LC為模板，通過PCR擴增全長抗體重鏈片段 和輕鏈片段，構建人源化抗體表達質粒。
[0145] 輕鏈和重鏈上下游引物、反應體系及PCR條件如表5、表6和表7所示。
[0146] 表5人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應的上下游引物
[0147]
[0148] 表6人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應體系
[0149]
[0150]表7人源化抗體輕鏈和重鏈PCR反應條件
[0151]
[0152] 用PCR產物回收試劑盒回收輕鏈、重鏈的全長序列。對抗體片段輕鏈、重鏈以及質 粒分別進行雙酶切，電泳后膠回收抗體酶切和質粒酶切片段，之后對片段進行酶連。酶連之 后的人源化抗體表達質粒命名為P3.1GS-PD-1。反應體系如表8-表10所示。
[0153] 表8人源化抗體輕鏈和重鏈雙酶切反應體系
[0154]
[0155]
[0156]
[0157]
[0158]
[0159] 將上述酶連產物加入到lOOyL XL1-10感受態中，冰上30分鐘，然后，42°C熱擊90 秒，迅速放置冰上2分鐘，接著加入500yL LB培養基，37°C搖床培養1小時，將菌液于4000rpm 離心5分鐘，棄500yL上清，用槍吹懸菌泥，涂布于含50yg/mL AMP的LB固體平板上，37°C過夜 培養。挑單菌落到5mL LB液體培養基(50yg/mL AMP)，37°C250rpm培養6小時，PCR驗證克隆， 用15%滅菌甘油保藏陽性菌種，每個克隆2根，取一份凍存管送測序，另一份保存-20°C。
[0160] 實施例四穩定細胞系構建
[0161 ]人源化抗體表達質粒P3.1GS-PD-1，轉染前采用Pvul對其進行線性化;采用電轉染 的方法，將含有人源化抗體輕鏈、重鏈基因的線性化質粒轉染至CH0-KSM4，轉染了四次，將 轉染后的細胞分別命名為 20150703T，20150704T，20150708T 及 20150714T。
[0162] 轉染后撤谷氨酰氨進行加壓篩選，其中20150708Τ及20150714Τ待轉染細胞恢復2 天后進行加壓鋪板。培養約30-40天后，96孔板可觀察到克隆長出，此時進行產量鑒定。將高 產克隆轉移并擴增培養。待細胞數目達到2X10 6cellS/mL左右接種進行補料分批培養，培 養結束后收獲上清進行產量鑒定，獲得備選母克隆。而20150703T及20150704T的母克隆由 半固體鋪板方法篩選獲得。將高產的克隆開展亞克隆篩選:半固體鋪板，6孔板每孔3000-5000個細胞，培養基2.5mL，鋪板后置于37°C、5 %C02靜置培養，培養7-12天可挑選單克隆。 將挑選的單克隆進行產量鑒定，獲得備選克隆。
[0163] 通過補料篩選獲得高產細胞株，搖瓶補料方案為:采用CDM4CH0為基礎培養基進行 接種，接種密度為5 X 105cel 1 s/mL，接種后置于37 °C、5 % C02、120rpm培養，接種當天記為第 〇天，培養至第3天開始補加70g/L的cell Boost 5,每天補加接種體積的6%直至細胞收獲。 根據補料篩選結果，選擇不同轉染中相對高產的細胞株建立PCB，凍存保種，并進行傳代穩 定性研究。表達的抗體名anti-PD-1。
[0164] 實施例五抗體的結合特異性和結合動力學比較
[0165]采用Biacore分析實施例四中的細胞株表達抗體的親和力及結合動力學。利用標 準胺偶聯化學和由Biacore提供的試劑盒，經伯胺將羊抗人IgG共價連接至CM5芯片。將抗體 以30yL/min的流速在HBS EP緩沖液中流動而測量結合。結合時間300秒，解離時間7200秒。 測定的ka、kd和KD值如表11所示。
[0166] 表11人源化抗體anti-PD-Ι的結合動力學結果
[0167]
[0168] 實施例六抗體在混合淋巴細胞反應中對細胞因子分泌的影響
[0169] 先用roS緩沖液1:1稀釋血液，移取3mL的LSM至離心管內，加入稀釋過的血液4mL， 注意加入的時候，確保使稀釋后的血液至于LSM的上層，不可混勾。400g，RT離心30-40min。 最后吸出分離出的上層的PBMC，100g離心lOmiruBD公司CD4+細胞分離磁珠分離CD4+T細胞， 使用BD公司DC細胞分離磁珠分離DC細胞。96孔板每孔⑶4+T細胞數量1 X 105，DC數量1 X 104，體積共計100yL共培養。加入梯度稀釋的抗體，培養5天后檢測IFN- γ，IL-2的濃度。 [0170] 結果分別如圖9和圖10所示，抗體能有效的促進混合淋巴細胞分泌IFN-γ和IL-2。 [0171 ]實施例七抗體在血清中的穩定性
[0172]用猴血清稀釋人源化抗體anti-PD-Ι，濃度為O.Smg/mLJT-C分別放置0天、1天、4 天、7天。
[0173] 重組人PD-1融合蛋白以0.5yg/mL的濃度在包被緩沖液中4°C過夜。次日棄去孔內 溶液用TOST洗兩次。然后加入1%BSA，37°C封閉1小時然后用TOST洗兩次。穩定性抗體樣品 以lyg/mL起始依次進行3倍稀釋共8個濃度梯度，37°C孵育1小時，PBST洗三次。用羊抗人 FAB-HRP，1:10000稀釋，37 °C孵育1小時，PBST洗三次。加入TMB顯色15min，以0 · 5M的H2SO4中 止反應并在450nm讀出吸光度。
[0174] 結果如圖11所示，人源化抗體anti-PD-Ι顯示出了良好的血清穩定性，7天之內均 未顯示明顯的活性衰減。
[0175] 實施例八ELISA測定與人CD28、CTLA-4的結合特異性及與不同物種的PD-1蛋白的 結合
[0176] 測試重組⑶28家族成員重組人⑶28、重組人CTLA-4、重組鼠 ro-Ι、重組食蟹猴H)-1、重組人ro-1蛋白與抗體結合。不同蛋白以0.5yg/mL的濃度在包被緩沖液中4 °C過夜。次日 棄去孔內溶液用PBST洗兩次。然后加入1 % BSA，37 °C封閉1小時然后用PBST洗兩次。加入0.5 yg/mL抗體樣品，孵育1小時，PBST洗三次。用羊抗人FAB-HRP，1:10000稀釋，37°C孵育1小時， PBST洗三次。加入TMB顯色15min，以0.5M的H2S04中止反應并在450nm讀出吸光度。
[0177] 結果如圖12所示，抗體不結合CD28家族其它成員。抗體以類似的親和力結合人和 食蟹猴重組ro-i蛋白。
[0178] 以上所述僅是本發明的優選實施方式，并不用于限制本發明，應當指出，對于本技 術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明技術原理的前提下，還可以做出若干改進和 變型，這些改進和變型也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1. 一種抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其特征在于:包括選自于如下 一組的CDR區： 重鏈CDR1、CDR2、CDR3的序列分別如SEQ ID腸：17-19所示，輕鏈〇)1?1工01?2、〇)1?的序 列分別如SEQ ID N0:35-37所示，或與上述序列結合相同抗原表位的序列。2. 根據權利要求1所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其特征在 于:還包括選自于如下的重鏈可變區框架區：FR1、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 : 20-23所示，或分別與上述序列的同一性大于70 %、80 %、85 %、90 %、95 %、99 %的序列。3. 根據權利要求2所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其特征在 于:其重鏈的序列如SEQ ID NO:8所示。4. 根據權利要求1所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其特征在 于:還包括選自于如下的輕鏈可變區框架區：FR1、FR2、FR3、FR4的序列分別如SEQIDN0 : 38-41所示，或分別與上述序列的同一性大于70 %、80 %、85 %、90 %、95 %、99 %的序列。5. 根據權利要求4所述的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分，其特征在 于:其輕鏈的序列如SEQ ID NO:25所示。6. -種核酸分子，其特征在于:其包含能夠編碼抗體重鏈可變區的核酸序列，所述重鏈 可變區包含選自如下一組的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO：17-19； (2) 與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個的序列：a)結合相同抗原表位;b)同 一性大于70%、80%、85%、90%或97%。7. 根據權利要求6所述的核酸分子，其特征在于:所述重鏈可變區包含選自如下一組的 氨基酸序列： SEQ ID NO: 16,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個的序列：a)結合相同抗原 表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區中含有一個到幾個 核苷酸的替換。8. -種核酸分子，其特征在于:其包含能夠編碼抗體輕鏈可變區的核酸序列，所述輕鏈 可變區包含選自如下一組的氨基酸序列： (1) SEQ ID NO：35-37； (2) 與前述（1)序列相比滿足以下二者中至少一個的序列：a)結合相同抗原表位;b)同 一性大于70%、80%、85%、90%或97%。9. 根據權利要求8所述的核酸分子，其特征在于:所述輕鏈可變區包含選自如下一組的 氨基酸序列： SEQ ID N0:34,或與前述序列相比滿足以下三者中至少一個的序列：a)結合相同抗原 表位、b)同一性大于70%、80%、85%、90%或97%、c)與前述序列框架區中含有一個到幾個 核苷酸的替換。10. -種載體，其特征在于:其含有權利要求6-9任一項的核酸分子。11. 一種宿主細胞，其特征在于：其含有權利要求6-9任一項的核酸分子或權利要求10 的載體。12. -種偶聯物，其特征在于:其含有權利要求1-5任一項的抗人PD-L1人源化單克隆抗 體或其抗原結合部分，以及其它生物活性物質，所述抗人ro-Li人源化單克隆抗體或其抗原 結合部分直接或通過連接片段與其它生物活性物質偶聯。13. -種組合物，其特征在于:其含有權利要求1-5任一項的抗人PD-L1人源化單克隆抗 體或其抗原結合部分、權利要求6-9的核酸分子、權利要求10的載體、權利要求11的宿主細 胞、或者權利要求12的偶聯物，以及任選的藥學上可接受的載體或賦形劑，以及任選的其它 生物活性物質。14. 權利要求1-5任一項的抗人PD-L1人源化單克隆抗體或其抗原結合部分、權利要求 6-9的核酸分子、權利要求10的載體、權利要求11的宿主細胞、權利要求12的偶聯物、或者權 利要求13的組合物用于制備預防或治療腫瘤、免疫系統相關疾病(T細胞功能障礙）、微生物 或病毒引起的感染的用途。
【文檔編號】A61P35/00GK106008714SQ201610345750
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月24日
【發明人】李戈, 郭樹華, 張佳春, 朱翔, 朱一翔
【申請人】瑞陽(蘇州)生物科技有限公司