一種豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88 FaeG蛋白的單鏈抗體及其制備方法
【專利摘要】本發明公開了一種豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體及其制備方法。本發明的抗產毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體由抗體的重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL通過短的連接肽連接而成。輕鏈可變區VL的氨基酸序列如SEQ ID No：1所示，重鏈可變區VH的氨基酸序列如SEQ ID No：2所示。獲得的抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體分子量約為28kDa，能夠特異性的識別產腸毒素大腸桿菌K88，可用于阻斷產腸毒素大腸桿菌K88的感染和粘附。
【專利說明】
一種豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88 FaeG蛋白的單鏈抗體及 其制備方法
技術領域
[0001]本發明涉及一種豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體及其制備方 法，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 斷奶仔豬腹瀉(post-weaning diarrhea，PWD)發生在仔豬斷奶時或斷奶后的第1 周，臨床上主要癥狀表現為腹瀉、脫水、生長緩慢或停止生長，從而引起仔豬的大量死亡，給 全世界養豬業造成了巨大的經濟損失。超過50%斷奶仔豬腹瀉病例中是由特定血清型的產 腸毒素大腸桿菌(ETEC)造成的。目前細菌耐藥性問題越來越嚴重，抗生素治療細菌感染效 果不理想。單鏈抗體是一種基因工程抗體，以其分子量小、特異性高、穿透力強、易于改造等 特點，顯示了巨大的應用潛力，越來越受到人們的重視。
【發明內容】
[0003] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種豬源性抗產腸毒素大腸桿 菌K88FaeG蛋白的基因工程單鏈抗體及其制備方法。本發明的單鏈抗體能夠與產腸毒素大 腸桿菌K88FaeG蛋白特異性結合，可用于阻斷產腸毒素大腸桿菌的感染和粘附。
[0004] 本發明的技術方案具體介紹如下。
[0005] 本發明提供一種豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體，所述單鏈 抗體具有如SEQ ID No: 1所示重鏈可變區VH的氨基酸序列、如SEQ ID No:2所示的輕鏈可變 區VL氨基酸序列和位于重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL之間的連接肽。
[0006] 優選的，所述連接肽的序列為:GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。
[0007]優選的，所述單鏈抗體具有如SEQ ID No:3所示的氨基酸序列。
[0008]本發明還提供一種編碼上述單鏈抗體的基因，其具有SEQ ID No :4所示的核苷酸 序列。優選的，所述核苷酸序列中包含內切酶位點s f i I、N 011，其中S f i I的序列為 GGCCNNNNNGGCC，Not I 的序列為 GCGGCCGC。
[0009] 本發明進一步提供一種上述單鏈抗體的表達載體。優選的，其為原核表達載體。更 優選的，所述原核表達載體為pCANTAB-5e-ScF V載體。
[0010] 更進一步的，本發明提供一種上述單鏈抗體的制備方法，具體步驟如下：
[0011] (1)采用RT-PCR直接從產腸毒素大腸桿菌K88感染的豬外周血RNA中擴增出抗體編 碼基因的重鏈可變區VH基因和輕鏈可變區VL基因；
[0012 ] (2)利用S0E-PCR法將連接序列linker與重鏈可變區VH基因和輕鏈可變區VL基因 相連構建豬源性單鏈抗體基因；
[0013] (3)將步驟(2)的豬源性單鏈抗體基因克隆到噬菌體抗體展示載體pCANTAB5e中， 構建重組噬菌粒pCANTAB5e-ScFv;
[0014] (4)將步驟(3)的重組噬菌粒載體pCANTAB5e-ScFv電轉化入E.coli TG1感受態細 胞，獲得豬源性噬菌體單鏈抗體庫；
[0015] (5)將步驟(4)獲得的豬源性噬菌體單鏈抗體庫用以原核表達的產腸毒素大腸桿 菌K88FaeG蛋白作為包被抗原進行噬菌體ELI SA，得到的陽性克隆即為含有抗產腸毒素大腸 桿菌K88FaeG的單鏈抗體；
[0016] (6)分離純化步驟(5)所得陽性克隆培養產物即獲得豬源性抗產腸毒素大腸桿菌 K88蛋白的單鏈抗體。
[0017] 需要說明的是，以上各步驟采用的實驗材料均為正規公司獲得的標準材料，所用 方法均為標準試劑盒產品說明書所述方法(見相應的實施例），各步驟獲得的中間產品及最 后的終產品均經過多次試驗證明可以重復獲得，其生物學性質保持穩定一致。說明本發明 各試驗步驟所涉及的中間產品和終產品均可以按照本發明所陳述的發法準確獲得.
[0018] 本發明的技術原理是采用RT-PCR直接從產腸毒素大腸桿菌K88感染的豬外周血 RNA中擴增出抗體編碼基因的重鏈可變區（VH)基因和輕鏈可變區（VL)基因。利用S0E-PCR (重組鏈延伸反應）法將連接序列linker與VH基因和VL基因相連構建豬源性單鏈抗體 (ScFv)基因，并將其克隆到噬菌粒載體pCANTAB5e中，phage-ELISA篩選抗ETEC單鏈抗體的 陽性克隆，測序后使用DNAstar的Megalin進行序列分析，證明該單鏈抗體屬于豬源性抗產 腸毒素大腸桿菌K88蛋白的單鏈抗體。
[0019] 本發明的有益效果是:抗豬產腸毒素大腸桿菌K88的基因工程抗體能與豬產腸毒 素大腸桿菌K88FaeG蛋白特異性結合，能夠用于豬產腸毒素大腸桿菌病K88的粘附阻斷及其 功能驗證。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 為RT-PCR電泳圖；Μ為2000bp DNA ladder marker;l為VH基因 RT-PCR產物。
[0021] 圖2為RT-PCR電泳圖；Μ為2000bp DNA ladder marker;1 為VL基因 RT-PCR產物。
[0022] 圖3為VH-Linker-VL PCR電泳圖；Μ為2000bp DNA ladder marker;l為VH-Linker-VL基因 PCR產物。
[0023] 圖4為pCANTAB5e-ScFv雙酶切鑒定；M為2000bp DNA ladder marker;l、2為重組 質粒經Sfi I和Not I雙酶切。
[0024] 圖5為重組原核表達載體pCANTAB5e_ScFv質粒圖譜。
[0025] 圖6為噬菌體抗體庫的多樣性分析。
[0026]圖7為抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG單鏈抗體的純化電泳圖;Μ為預染蛋白Marker; 1為純化后的單鏈抗體。
【具體實施方式】
[0027]實施例1豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體的制備 [0028] 1、對GenBank已公布的豬抗體編碼基因重鏈可變區序列（AF064686 . 1 ; AF064687.1 ;AF064688.1 ;AF064689.1;AF064690.1)和輕鏈可變區序列（KF561242.1; GQ867594.1;GQ867595.1)設計擴增抗體輕、重鏈的引物（表1)，其中VH1F分別與VH1R、VH2R 用于擴增VH區；VL IF、VL2F、VL3F和VL 1R用于擴增VL區；VH3F、VH3R用于VH基因加入酶切位點 和Linker序列；VL4F、VL5F、VL6F在VL1F、VL2F、VL3F擴增的VL基因基礎上加入酶切位點， VL2R用于VL基因加入Linker序列。其中，VH3F含有Sfi I酶切位點，VL 2R含有Not I酶切位 點；￥!131?、￥1^4?、￥1^5?、￥1^6?含互補的1^111?^序列（酶切位點和1^111?^序列在表1中用下劃線 標示出）。Linker采用（GGGGS) 3,其對應的編碼核苷酸序列為： GGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT。引物由上海生工生物工程技術服務 有限公司合成。
[0029]表1擴增抗體可變區的引物及其擴增片段大小 [0030]
[0032]注:下劃線代表Sfi I或Not頂每切位點，方框代表連接肽序列。
[0033] 2、VH和VL基因的擴增
[0034] 以cDNA為模版，VH1F、VH1R為引物擴增VH基因（見圖1)。引物VL1F、VL2F、VL3F分別 與引物VL1R配對，擴增VL基因（見圖2KPCR反應體系為25yL:2XPCR mix 12.5yL，模版cDNA 2yL，上下游引物（25μΜ)各lyL，ddH20 8.5yL。擴增程序如下：95°C預變性3min;94°C變性 4〇8,50°(：退火4〇8,72°(：延伸11^11，30個循環 ;最后72°(：延伸1〇1^11。1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒 定產物并回收目的基因（根據Thermo公司提供的膠回收說明書操作）。
[0035] 3、ScFv基因的獲得
[0036] 分別以VH和VL基因為模板，VH2F、VH2R為引物PCR擴增帶有Linker的重鏈可變區基 因，VH4F、VL5F、VL 6F分別與VL2R配對，PCR擴增帶有Linker的輕鏈可變區基因，PCR條件同 上。擴增產物經1 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定后回收目的基因（含有Linker序列的VH和VL基因）。 以VH2F、VL 2R為引物，通過重組鏈延伸反應（S0E-PCR)將含有Linker序列的VH和VL基因連 接為ScFv基因，并加入Sfi I和Not I酶切位點，VH-Linker-VL擴增產物大小為762bp(見圖 3)〇
[0037] 4、豬源性ScFv噬菌體原始文庫的構建
[0038]根據常規分子克隆方法(參照J.薩姆布魯克等主編的《分子克隆實驗指南》），ScFv 基因和pCANTAB-5e載體分別經Sfi I和Not I雙酶切后，瓊脂糖凝膠電泳并用凝膠回收試劑 盒回收酶切產物（見圖4)。將ScFv基因插入pCANTAB-5e載體（北京普如汀生物技術有限公 司），構建重組表達質粒(參見圖5)，并將其電轉化E.coliTGl感受態細胞(北京普如汀生物 技術有限公司），連續電轉化50次，構建豬源性ScFv噬菌體原始文庫。挑取單克隆菌落PCR 驗證其陽性率，菌落PCR驗證正確的克隆進行測序分析來確定文庫的多樣性(見圖6)。
[0039] 5、ScFv的富集篩選
[0040]取純化的原核表達的ETEC K88FaeG蛋白（本實驗室制備），用抗原包被液(50mmol/ L碳酸氫鈉鹽溶液，pH=9.6)稀釋至5yg/mL，加入96孔板，每孔100yL，4 °C包被過夜;每孔加 入5 %脫脂奶粉溶液200yL，37 °C封閉lh，PBS洗滌3次;每孔加入100yL噬菌體ScFv原始文庫， 37°C孵育2h，PBS洗滌10次;每孔加入洗脫緩沖液(Gly-HCl pH=2.2) 100yL洗脫，再加入50μ L(Tri s-HCl pH = 9.0)進行中和。將部分洗脫的噬菌體感染對數生長期的大腸桿菌TG1，測 定第一輪的捕獲的噬菌體滴度，其余洗脫的噬菌體進行第二輪富集篩選;捕獲的噬菌體滴 度需要達到10 6cfu/mL;挑取最后一輪淘選的單菌落，即為抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋 白的陽性ScFv菌落。
[0041 ] 6、ScFv的誘導表達
[0042]挑取陽性ScFv菌落至含氨芐抗生素(終濃度為100μΜ)和葡萄糖(終濃度為(2M)的 2ΥΤ液體培養基中，37 °C振搖培養，菌液OD600至0.6時感染輔助噬菌體Μ13Κ07 (北京普如汀生 物技術有限公司）。12h后離心，吸取上清，即為陽性ScFv的噬菌體。陽性ScFv的噬菌體感染 對數生長期的HB2151菌液(北京普如汀生物技術有限公司），培養至菌液OD600為0.6。將菌液 分為兩份，分別為誘導組、和非誘導組。誘導組在菌液中加入IPTG(終濃度100μΜ)，于30°C誘 導過夜，離心收集菌液。用PBS懸浮菌液，超聲波裂解，離心后收集上清。采用Ni-NTA his band rasin純化ScFv，純化過程參照默克公司的《pET System Manual》。純化后的樣品進行 SDS-PAGE電泳(見圖7)。
[0043]實施例2抗原特異性ScFv的間接ELISA篩選
[0044] 取純化的原核表達的ETEC K88FaeG蛋白（本實驗室制備），用抗原包被液(50mmol/ L碳酸氫鈉鹽溶液，pH=9.6)稀釋至5yg/mL，加入96孔板，每孔lOOyL，4 °C包被過夜;每孔加 入5 %脫脂奶粉溶液200yL，37 °C封閉lh，PBS洗滌3次;將純化蛋白的上清50yL與4 %脫脂奶 粉溶液50yL混勻后加入上述孔中，37°C孵育2h，PBST洗滌3次；加入E-Tag Mouse mAb(E-tag 標簽鼠單克隆抗體購自RayBiotech公司）100yL(l: 2000)，37°C反應2h，PBST洗滌3次;加入 過氧化氫標記的羊抗鼠 IgG二抗(購自美國Invitrogen公司）1000yL(l :4000)，37°C反應lh， PBST洗滌3次;TMB顯色15min，2mo 1/L硫酸終止反應，酶標儀(美國Thermo公司讀取OD45Q處吸 光值，將設未誘導菌液上清為表達陰性對照。以P/N (P為陽性孔的0D450值，N為陰性孔的 0D450值)表示，P/N彡2.1為陽性;1.5彡P/N< 2.1為可疑;P/N< 1.5為陰性。陽性克隆經3次 重復性試驗驗證，同時設豬傳染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬沙門菌作為對照，驗 證ScFv的特異性。結果證明單鏈抗體A能夠特異性的識別產腸毒素大腸桿菌病毒，但不與傳 染性胃腸炎病毒、豬流行性腹瀉病毒、豬沙門菌發生交叉免疫反應。
[0045] 實施例3
[0046]對獲得的單鏈抗體編碼基因進行測序，證明其由762個核苷酸及據此推測的254個 氨基酸組成，所述核苷酸序列如SEQ ID No:4所示，所述氨基酸序列如SEQ ID No:3所示。 [0047] 實施例4
[0048]檢測單鏈抗體對產腸毒大腸桿菌K88的黏附阻斷效果。將IPEC-J2細胞(本實驗室 保存)鋪到細胞培養六孔板中，于37 °C 5 % C02培養箱中培養過夜。細胞生長至60 % -70 %時， 棄去細胞培養基，用無菌緩沖液洗滌3次，加入2mL無抗無血的DMEM培養基，其中兩孔胰 酶消化，細胞計數。將產腸毒素大腸桿菌K88稀釋后按50M0I感染細胞，一組加入針對產腸毒 素大腸桿菌K88的單鏈抗體(pCANTAB5e-ScFv) 100yL( lOng/yL)，另一組加入與產腸毒素大 腸桿菌K88無結合活性的單鏈抗體(pCANTAB5e-ScFv_negative)100yL，共同孵育2h。每隔半 小時輕輕震蕩3〇 seC(32h后棄去培養基，PBS洗去未結合的大腸桿菌。然后將細胞用LB細菌培 養基處理，裂解細胞，釋放細胞表面的細菌。將細菌計數，計算黏附的產腸毒素大腸桿菌的 數量。黏附抑制率計算公式為：（無結合活性單鏈抗體處理組細菌數-特異性單鏈抗體處理 組細菌數)/無結合活性單鏈抗體處理組細菌數）。試驗組內重復兩次，組間三次，證實單鏈 抗體具有一定的抗產腸毒素大腸桿菌K88的活性，可以用于阻斷產腸毒素大腸桿菌對機體 的感染和粘附(見表1)。
[0049] 表1 pCANTAB5e_ScFv抗體黏附阻斷試驗
[0050]
【主權項】
1. 一種豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88FaeG蛋白的單鏈抗體，其特征在于，所述單鏈抗 體具有如SEQ ID No: 1所示的重鏈可變區VH氨基酸序列，如SEQ ID No:2所示的輕鏈可變區 VL氨基酸序列和位于重鏈可變區VH和輕鏈可變區VL之間的連接肽。2. 如權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于，所述連接肽的序列為： GGCGGTGGTGGATCCGGTGGCGGCGGGTCT 〇3. 如權利要求1所述的單鏈抗體，其特征在于，該單鏈抗體具有如SEQ ID No:3所示的 氨基酸序列。4. 一種編碼權利要求1-3之一所述的單鏈抗體的基因，其特征在于，其具有SEQ ID No: 4所示的核苷酸序列。5. 如權利要求4所述的基因，其特征在于，所述核苷酸序列中包含內切酶位點Sfi I、 NotI，其中 Sf i I 的序列為GGCCNNNNNGGCC，NotI 的序列為GCGGCCGC。6. -種權利要求1-3之一所述的單鏈抗體的表達載體。7. 如權利要求6所述的表達載體，其特征在于，其為原核表達載體。8. 如權利要求7所述的表達載體，其特征在于，所述原核表達載體為pCANTAB-5e-ScFV 載體。9. 一種根據權利要求1-3之一所述的單鏈抗體的制備方法，其特征在于，具體步驟如 下： (1) 采用RT-PCR法直接從產腸毒素大腸桿菌K88感染的豬外周血RNA中擴增出抗體編碼 基因的重鏈可變區VH基因和輕鏈可變區VL基因； (2) 利用S0E-PCR法將連接序列1 inker與重鏈可變區VH基因和輕鏈可變區VL基因相連 構建豬源性單鏈抗體基因； (3) 將步驟（2)的豬源性單鏈抗體基因克隆到噬菌體抗體展示載體pCANTAB5e中，構建 重組噬菌粒pCANTAB5e-ScFv; (4) 將步驟(3)的重組噬菌粒載體pCANTAB5e-ScFv電轉化入E.coli TG1感受態細胞，獲 得豬源性噬菌體單鏈抗體庫； (5) 將步驟（4)獲得的豬源性噬菌體單鏈抗體庫用以原核表達的產腸毒素大腸桿菌 K88FaeG蛋白作為包被抗原進行噬菌體ELISA，得到的陽性克隆即為含有抗產腸毒素大腸桿 菌K88FaeG的單鏈抗體； (6) 分離純化步驟(5)所得陽性克隆培養產物即獲得豬源性抗產腸毒素大腸桿菌K88蛋 白的單鏈抗體。
【文檔編號】C07K16/12GK106008710SQ201610571104
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月20日
【發明人】朱建國, 張凡慶, 王苗苗
【申請人】上海交通大學