一種腫瘤抗原gpc3的ctl識別表位肽及其應用
【專利摘要】本發明公開了一種GPC3來源的抗腫瘤CTL表位肽，為九肽，其氨基酸序列為Lys?Val?Phe?Gly?Asn?Phe?Pro?Lys?Leu。本發明還包括上述肽在制備腫瘤治療性DC?CIK中的應用。本發明所制備的特異性的DC?CIK細胞對肝癌細胞Huh?7顯示出一定的殺傷率，可用于制備肝癌特異性自體免疫細胞的制備。本發明公開了GPC3來源的抗腫瘤CTL表位肽及用其肽制備腫瘤治療性DC?CIK，對多種GPC3相關腫瘤的治療具有潛在價值。
【專利說明】
一種腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽及其應用
技術領域
[0001]本發明涉及表位肽技術領域，尤其涉及一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位 肽及其應用，還涉及一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細胞的制備方法及其應用，以及一種腫瘤 抗原GPC3特異性DC-CIK細胞的制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002]磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(glypican-3，GPC3)是一種66kD的細胞膜蛋白，是硫酸乙酰 肝素蛋白聚糖的成員。GPC3能夠與細胞外基質、多種生長因子、肝素樣結合蛋白、粘附分子、 蛋白酶等相互作用，參與細胞粘附、分化、增殖與迀徙等過程。其在成熟組織中低表達，在中 胚層、多種惡性腫瘤中過表達，如其在肝癌組織中高表達，而在正常肝組織不表達，有可能 是目前發現在AFP陰性肝癌中表達率最高的基因。
[0003] 近年來，細胞免疫治療飛速發展，成為繼手術、化療、放療后的第四種腫瘤治療方 法。細胞免疫治療領域中過繼性細胞免疫治療是研究的熱點。腫瘤過繼性細胞免疫治療能 夠調動機體免疫功能以達到消除和控制腫瘤的目的，具有靶向療效明顯、不良反應輕微等 優點。過繼性細胞免疫治療包括CIK及DC-CIK等，其中DC-CIK是將CIK細胞和同源DC細胞共 培養后即可獲得DC-CIK細胞，它既可促進DC細胞的成熟，更能促進C1K的增殖，并加強其抗 腫瘤活性。DC-CIK表現出更好的靶向性和特異性，具有有效的殺瘤作用。
[0004] 腫瘤治療常用的方法有手術、放療、化療。半數以上的腫瘤患者的主要治療手段是 手術，通過手術可以治愈大部分早期未擴散的腫瘤，但是對多數中晚期腫瘤患者卻是療效 有限。放射療法也是許多腫瘤治療不可或缺的手段之一，但是其不良反應大，只能作為一種 局部療法。對于轉移擴散或全身性的腫瘤，只能依靠化療和免疫治療。其中，化療對多種腫 瘤療效確切，是臨床腫瘤治療的重要手段，但是其作用缺乏特異性，會在殺瘤同時損傷正常 細胞，長期使用會產生多種毒副作用。因此，需要更好的腫瘤全身治療手段。
[0005] 免疫細胞療法是腫瘤治療的新策略，通過從患者外周血腫采集單個核細胞，經體 外培養、增值、特異性抗原處理后，賦予其抗瘤特異性并回輸到病人體內發揮抗瘤作用。免 疫細胞療法主要包括CK、DC-CIK等。DC是功能強大的抗原提呈細胞，CIK是多種細胞因子誘 導的異質性殺傷細胞群，因此DC-CIK技術將兩者優點有效結合，具有更好的特異性和靶向 性，可確保高效的免疫反應。研究表明，
[0006] DC-CIK細胞對化療后腫瘤細胞的生長具有有效的抑制作用，且DC-CIK細胞不會危 害集體免疫系統功能。在當前對腫瘤特異性抗原了解相對較少的情況下，將DC-CIK細胞作 為一種輔助療法與傳統腫瘤治療方法進行聯合應用是個有效可行的策略。
【發明內容】
[0007] 基于【背景技術】存在的技術問題，本發明目的在于提供一種特異性腫瘤抗原GPC3的 CTL識別表位肽。
[0008] 本發明目的還在于提供上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽的應用。
[0009] 本發明目的還在于提供一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細胞的制備方法。
[0010] 本發明目的還在于提供一種腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細胞的制備方法。
[0011]本發明目的還在于提供上述腫瘤抗原GPC3特異性DC細胞和DC-CIK細胞的應用。 [0012]為實現上述目的，本發明采取如下技術方案：
[0013]本發明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽，所述CTL識別表位肽為 九肽，其氨基酸序列如下:Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pr〇-Lys_Leu。
[0014] 上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽采用固相合成法進行合成。基本流程 如下：首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體Wang樹脂上，然后 脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上;其次將第二個氨基被Fmoc基團保 護的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固相載體的第一個 氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基的二肽。重復上 述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度，最后切割得到目 的肽，再經HPLC純化，其純度大于90%。
[0015] 本發明還提出的上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備具有GPC3表達 的腫瘤治療性多肽疫苗的應用。
[0016] 優選地，上述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備肝癌治療性多肽疫苗 中的應用，尤其對肝癌細胞Huh-7具有殺傷力。
[0017] 本發明還提出的一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細胞的制備方法，采用上述特異性腫 瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽加入DC細胞進行培養得到。
[0018] 本發明還提出的上述腫瘤抗原GPC3特異性DC細胞的制備方法得到的特異性DC細 胞在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0019] 本發明還提出的一種腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細胞的制備方法，采用上述特異 性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽進行誘導得到。
[0020] 本發明還提出的上述腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細胞的制備方法得到的特異性 DC-CIK細胞在制備治療肝癌藥物中的應用。
[0021] 本發明公開了 GPC3來源的抗腫瘤CTL表位肽及用其肽制備腫瘤治療性DC-CIK，對 多種GPC3相關腫瘤的治療具有潛在價值。
[0022]本發明巧妙利用GPC3在肝癌中呈現高表達，與肝癌的病理分級明顯正相關，隨組 織病理分級的升高而增加，因此在肝癌的發生和發展中起重要作用。它具有極高的組織器 官特異性，而在正常肝臟組織中表達很低，從而采用理論和實驗相結合的方法篩選得到腫 瘤相關抗原的表位肽，所得表位肽未見文獻報道，為研制基于抗原GPC3的腫瘤疫苗或腫瘤 特異性CTL細胞的制備提供理論基礎，并為后續多價的抗原肽疫苗構建奠定基礎。
【附圖說明】
[0023]圖1為本發明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽的質譜分析圖。 [0024]圖2為本發明實施例1所得P1、P2、P3……P20各自誘導得到的特異性CTL細胞分泌 INF-γ的能力對比圖。
[0025]圖3為本發明實施例1所得Ρ4、P6、P15、Ρ16各自誘導得到的特異性CTL細胞對肝癌 細胞Huh-7殺傷能力對比圖。
[0026] 圖4為由本發明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽所制備得到的 特異性CTL細胞免疫細胞群的流式細胞儀檢測數據的統計分析圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面，通過具體實施例對本發明的技術方案進行詳細說明。
[0028]實施例1:合成表位肽
[0029] 采用理論與實踐相結合的方法，根據抗原的一級結構，綜合運用免疫信息學手段， 運用SYFPEITHI、B頂AS、NetCTL、WAPP和Epijen綜合對GPC3的抗原CTL表位進行預測分析，選 取評分前20的多肽序列進行試驗篩選，一次命名為P1、P2、P3......P20。
[0030] 基本流程如下:首先將一個氨基被Fmoc基團保護的氨基酸連接在不溶性固相載體 Wang樹脂上，然后脫掉氨基的保護基，第一個氨基酸即連接至固相載體上;其次將第二個氨 基被Fmoc基團保護的氨基酸的羧基縮合劑活化，活化后的第二個氨基酸羧基再與已接在固 相載體的第一個氨基酸的氨基反應形成肽鍵，此時在固相載體上就生成了一個帶有保護基 的二肽。重復上述的肽鍵形成反應，使肽鏈從C端向N端生長，直至達到所需要的肽鏈長度， 最后切割得到目的表位肽粗品。將目的表位肽粗品經HPLC純化得到目的表位肽精肽，其純 度大于90%，質譜分析證實其分子量符合理論值。
[0031] 本發明提出的一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽采用Fmoc固相合成法進 行合成，所述CTL識別表位肽為九肽，編號為P15,其氨基酸序列如下：Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pro-Lys-Leu。對P15進行質譜分析，其質譜分析結果如圖1所示，可以證實其分子 量為1049.26g/mol，符合理論值。
[0032]實施例2:多肽功能檢測
[0033]上述所得P15和其余19個表位肽可用于制備具有GPC3表達的腫瘤治療性多肽疫 苗，其應用實驗如下：
[0034] 1、上述CTL識別表位肽誘導特異性CTL細胞、IFN- γ分泌及對腫瘤靶細胞的殺傷實 驗檢測：抽取患者的外周血經密度梯度離心分離，獲得PBMCs，添加細胞因子培養DC細胞和 CTL細胞，進一步采用DC細胞負載本發明的GPC3表位肽，與CTL共培養刺激特異的CTL擴增， 進一步在體外采用ELISA和LDH實驗檢測特異的CTL在特異抗原刺激下INF- γ的分泌及對肝 癌細胞Huh-7的殺傷作用。
[0035]具體方法如下：
[0036] (I)、PBMC的分離與誘導：
[0037] 1)將50mL抗凝處理的外周血，2000rpm離心10min;
[0038] 2)收集上層血漿凍存，用PBS(pH=7.4)稀釋剩下的血細胞；
[0039] 3)將稀釋的血細胞加入到等體積的淋巴分離液液面上；
[0040] 4) 20 °C離心20min，關閉離心機剎車；
[0041] 5)離心后，分為四層，用吸嘴玻璃滴管吸取白膜層(即第二層）；
[0042] 6)取出的白膜層用PBS洗滌兩遍；
[0043] 7)將細胞以2~5X106/mL接種到6孔板內，2h后，回收未貼壁的細胞，用預包被 &拉卜0)3186和&拉丨-0)28186的培養板進行激活培養；
[0044] 8)貼壁的細胞加入GM-CSF和IL-4刺激培養5天誘導成DC細胞，第三天半換液；
[0045] 9)第5天，收集DC細胞，將10yg實施例1所得目的表位肽精肽加入DC細胞中，lh后， 將DC細胞與激活的T細胞共培養，同時加入IL2及IL-15;
[0046] 10)繼續培養5天后，得到抗原特異的CTL細胞進行細胞因子分泌及對腫瘤細胞的 殺傷實驗。
[0047] (11 )、IFN-γ 細胞因子分泌檢測：Human IFN-gamma Platinum ELISA( IFN-γ ELISA檢測試劑盒，eBioscience公司)檢測CTL細胞分泌的IFN-γ，步驟如下：
[0048] 1)將CTL細胞去除細胞因子培養24h后，接種到96孔板內；
[0049] 2)細胞中加入刺激對應的多肽再次刺激24h后，離心去除細胞，收集細胞上清；
[0050] 3)采用ELISA檢測上清中IFN- γ的表達，選擇IFN- γ分泌較多的CTL表位肽進行殺 傷實驗。
[0051] 結果如圖2所示，Ρ15和Ρ4、Ρ6、Ρ16負載的DC細胞均能夠較好誘導出特異性CTL細 胞，分泌較高量的IFN-γ。
[0052] (III)、腫瘤細胞殺傷實驗：采用乳酸脫氫酶（LDH)釋放檢測法，使用CytoTox 96Non_Radioactive Cytotoxicity Assay(細胞毒性檢測試劑盒，Promega公司）進行LDH試 驗檢測細胞殺傷能力。步驟如下：
[0053] 1)設立檢測培養板(100μL孔）
[0054] a.設立實驗組：以GPC3陽性表達的肝癌細胞Huh-7為靶細胞，按效應細胞和靶細胞 比為5:1、10:1、20:1加入上述特性CTL細胞
[0055] b.設立效應細胞自發釋放組 [0056] c.設立靶細胞自發釋放組 [0057] d.設立靶細胞最大釋放組 [0058] e.設立背景對照組
[0059] 2)細胞裂解及收獲上清
[0060] &.371：5%0)2共培養511
[00611 b.靶細胞最大釋放組中加入裂解液，45min后，所有的孔，250g/min離心收集上清 [0062] 3)LDH 檢測
[0063] a.轉移50yL上清至另一個96孔板
[0064] b.每孔加入50yL稀釋的底物混合物，室溫避光孵育30min
[0065] c.每孔添加50yL終止液
[0066] d.在490nm下檢測吸光值0D [0067]細胞殺傷率計算公式如下：
[0068] 殺傷率（％ ) = [ (0D孅且-0D效獅6酸:輸齟-0Df_a自發稀齟)/(0D_mt稀齟-0D__發輸齟)] X100%
[0069 ]結果如圖3所示，圖3為本發明實施例1所得P4、P6、P15、P16各自誘導得到的特異性 CTL細胞對肝癌細胞Huh-7殺傷能力對比圖；由圖3可知，P15誘導的CTL細胞對腫瘤細胞Huh-7殺傷效果最好。
[0070] 2、采用流式分析獲得的特異CTL中各種免疫細胞所占的百分比，結果如圖4所示。 由圖4可知，本發明由P15制備獲得的免疫細胞群中含有大量的CTL細胞，同時也含有一定比 例的NKT細胞，即該免疫細胞群具有較好的免疫活性，具有強大的殺傷特定腫瘤細胞的能 力。
[0071]以上所述，僅為本發明較佳的【具體實施方式】，但本發明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發明揭露的技術范圍內，根據本發明的技術方案及其 發明構思加以等同替換或改變，都應涵蓋在本發明的保護范圍之內。
【主權項】
1. 一種特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽，其特征在于，所述CTL識別表位肽為九 肽，其氨基酸序列為 Lys-Val-Phe-Gly-Asn-Phe-Pro-Lys-Leu。2. 權利要求1所述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備具有GPC3表達的腫瘤 治療性多肽疫苗的應用。3. 權利要求1所述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽在制備肝癌治療性多肽疫苗 中的應用。4. 一種腫瘤抗原GPC3特異性DC細胞的制備方法，其特征在于，采用如權利要求1所述特 異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽加入DC細胞進行培養得到。5. 根據權利要求4所述腫瘤抗原GPC3特異性DC細胞的制備方法得到的特異性DC細胞在 制備治療肝癌藥物中的應用。6. -種腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細胞的制備方法，其特征在于，采用如權利要求1所 述特異性腫瘤抗原GPC3的CTL識別表位肽進行誘導得到。7. 根據權利要求6所述腫瘤抗原GPC3特異性DC-CIK細胞的制備方法得到的特異性DC-CIK細胞在制備治療肝癌藥物中的應用。
【文檔編號】A61K35/15GK106008692SQ201610483210
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月24日
【發明人】唐奇, 馮振卿, 許國貞, 劉振云, 朱進, 趙薇
【申請人】安徽未名細胞治療有限公司