鵝oaz1多肽抗原及其多克隆抗體制備方法和應用
【專利摘要】一種鵝OAZ1多肽抗原及其多克隆抗體的制備方法和應用，本發明在鵝OAZ1序列基礎上，鑒定了鵝OAZ1基因的+1移碼位點，并在+1移碼位點后篩選、鑒定了一段特異性多肽序列。發明方法包括：①OAZ1序列分析及多肽抗原序列的篩選和鑒定。②OAZ1多肽抗原序列N端修飾、合成及檢測。③將OAZ1多肽抗原免疫新西蘭兔制備抗血清并檢測其效價；④OAZ1抗體的純化。本發明所制備的OAZ1多肽抗體可特異性結合鵝組織中OAZ1全長功能蛋白質，填補了鵝OAZ1蛋白質檢測研究領域的空白，為鵝OAZ1功能以及多胺調控動物繁殖功能的研究奠定基礎。
【專利說明】
鵝0AZ1多肽抗原及其多克隆抗體制備方法和應用
技術領域
[0001] 本發明屬于生物化學及分子免疫學領域，涉及一種鵝0AZ1多肽抗原及其多克隆抗 體制備方法和應用，所制備的抗體具有制備方法簡單、快速，成本低，效價高，能特異性結合 鵝組織中0ΑΖ1蛋白質的特點。
【背景技術】
[0002] 多胺(包括腐胺、亞精胺和精胺)是一類帶有兩個或兩個以上氨基的低分子脂肪族 化合物，可參與調控基因表達和翻譯、細胞增殖、細胞信號轉導、細胞膜穩定等過程。多胺水 平過低可導致細胞生長受到抑制甚至死亡，但是當多胺水平異常升高時也會導致癌癥的發 生，因此細胞多胺穩態的維持對于細胞正常生長具有重要意義。
[0003] 鳥氨酸脫駿酶抗酶 1 (ornithine decarboxylase antizyme 1 ,ΟΑΖΙ)是多胺代謝 過程中的關鍵調控酶。0ΑΖ1能與多胺生物合成過程中第一限速酶鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase，0DC)結合并革巴向促使其被26S蛋白酶降解，進而負反饋調控細胞內多胺水 平。近年來研究表明，0AZ1具有抗腫瘤效應和調控動物繁殖的功能。
[0004] 0ΑΖ是由0ΑΖ基因通過特殊的+ 1移碼機制編碼的蛋白質。目前已經發現的0ΑΖ基因 家族成員包括0AZ1、0AZ2、0AZ3和0AZ4,其中0AZ1分布最為廣泛，是調控0DC功能的重要成 員。四川白鵝0AZ1基因的cDNA序列包含652bp的完整編碼區序列，其0RF1 (由58個氨基酸組 成）與0RF2(由158個氨基酸組成）間的+ 1移碼位點位于第1個起始密碼子ATG后的+ 1751?^ 基。0AZ1主要通過泛素化途徑被26S蛋白酶體降解，而多胺可通過誘導OAZlmRNA翻譯中的+1 移碼機制來抑制這個泛素化降解過程，上調0AZ1表達，從而使0DC降解，抑制多胺的生物合 成過程。近年來的研究表明，0AZ1可以通過調節卵泡的生長發育及排卵過程參與調控動物 繁殖功能。我們前期研究發現，0AZ1在產蛋期籽鵝卵巢組織中表達量顯著高于產蛋前期，提 示0AZ1可能通過調控卵巢組織中多胺水平，進而參與調控籽鵝的繁殖功能。隨后我們應用 干擾和過表達技術研究并證實，0AZ1在鵝卵巢卵泡顆粒細胞增殖、凋亡，類固醇激素生成以 及生殖激素受體表達過程中具有重要調控作用。但是，目前缺乏商品化的家禽0AZ1抗體，而 且0AZ1單克隆抗體制備過程復雜，耗時長，耗資大，使得0AZ1功能研究僅停留在基因水平， 嚴重阻礙了 0AZ1以及多胺調控動物繁殖功能的研究。
【發明內容】
[0005] 為解決上述現有技術存在的問題，彌補現有家禽0AZ1全長功能蛋白質研究的空 白，本發明公開了一種鵝0AZ1多肽抗原及其多克隆抗體制備方法和應用，該多肽抗原和多 克隆抗體，具有制備方法簡單、快速，成本低，效價高的特點，并可特異性結合鵝組織中0AZ1 蛋白質。
[0006] 為實現上述目的，本發明的技術方案為：
[0007] 一種鵝0AZ1全長功能蛋白質多肽抗原，0AZ1多肽抗原的氨基酸位點位于其+1移碼 位點之后，其序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 一種抗鵝0AZ1多肽抗體的制備方法，合成SEQ ID NO. 1所示多肽序列，在其N端增 加一個半胱氨酸得到N端修飾肽得到SEQ ID N0.2所示序列，并進行質譜MS和高效液相色譜 HPLC檢測，將N端修飾肽與血藍蛋白交聯得到交聯多肽，用該交聯多肽免疫新西蘭兔后，頸 總動脈放血收集新西蘭兔血液，3000rpm離心10min后收集血清，然后應用親和柱層析的方 法純化血清中的0AZ1多克隆抗體。
[0009] 利用上述方法所制的抗鵝0AZ1多肽抗體。
[0010] 該抗體效價在1:512000以上。
[0011] 所述抗體在檢測鸛組織0AZ1蛋白質水平方面的應用。
[0012] 所述抗體在檢測鵝0AZ1功能以及多胺調控動物繁殖功能方面的應用。
[0013] 所述抗體在鵝下丘腦和卵巢組織中0AZ1全長功能蛋白質檢測方面的應用。
[0014] 相對于現有技術，本發明的有益效果為:①本發明在前期所獲得的鵝0AZ1基因序 列基礎上，對該序列進行親水性、抗原性、表面可及性和同源性分析，選擇綜合評分最高的 肽段作為靶序列進行人工合成，由于所選擇的多肽序列位于鵝0AZ1基因+ 1移碼位點之后， 因此可用于檢測鵝0AZ1全長功能蛋白質。②合成上述序列后進行N端修飾并與血藍蛋白交 聯，應用MS和HPLC檢測上述交聯蛋白。③將所制備的多肽復合物免疫新西蘭兔，利用間接 ELISA方法檢測抗血清效價，所制備的抗血清效價在1:512000以上。④應用親和柱層析的方 法純化血清中的0AZ1多克隆抗體。本發明所制備的0AZ1多肽抗體可特異性結合鵝組織中 0AZ1全長功能蛋白質，填補了鵝0AZ1蛋白質檢測研究領域的空白，為鵝0AZ1功能以及多胺 調控動物繁殖功能的研究奠定基礎。
【附圖說明】
[0015] 圖1為HPLC檢測N端修飾肽純度的結果圖。本發明制得的兔抗鵝0ΑΖ1多肽多克隆抗 體純度為92.15%。
[0016] 圖2為電噴霧電離質譜檢測N端修飾肽相對分子量的結果圖。本發明制得修飾肽實 際分子量為1641.40Da，與理論值（1641.95Da) -致。
[0017]圖3為應用本發明0AZ1多克隆抗體檢測鵝卵巢和下丘腦0AZ1蛋白質表達量的免疫 印跡結果圖。其檢測結果條帶清晰，特異性好。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明方案做進一步詳細描述：
[0019] 本發明對前期獲得的鵝0AZ1序列進行分析后，設計并合成鵝0AZ1多肽抗原，在其N 端增加一個半胱氨酸得到N端修飾肽并進行MS和HPLC檢測，將N端修飾肽與血藍蛋白交聯并 免疫新西蘭兔，收集血液制備抗血清，并進行間接ELISA檢測，采用親和柱層析方法純化抗 體。經免疫印跡鑒定表明，該多克隆抗體可特異性結合鵝組織中0ΑΖ1蛋白質，為鵝0ΑΖ1和多 胺調控動物繁殖功能的研究奠定基礎。
[0020] 具體步驟如下：
[0021] 步驟一:鵝0AZ1序列分析、多肽位點選擇以及合成
[0022]利用生物信息學相關軟件，對鵝0AZ1基因進行分析，結果發現:鵝0AZ1基因的cDNA 序列包含652bp的完整編碼區序列，其0RF1 (由58個氨基酸組成）與0RF2(由158個氨基酸組 成)間的+1移碼位點位于第1個起始密碼子ATG后的第175位堿基。
[0023] 經DNAstar軟件對鸛0AZ1氨基酸序列進行親水性（Hydrophi 1 icity)、抗原性 (Antigenicity)、表面可及性(Surface probability)和同源性(Homology)分析，選擇綜合 評分最高的肽段，亦即鵝0AZ1蛋白N端V188-A201，作為擬合成的多肽靶序列，其氨基酸序列 為VRPGHPLVPKRH)A，如SEQ ID NO. 1所示。為進行N末端修飾，所以在N端添加一個半胱氨酸 殘基，故最終合成多肽序列為CVRPGHPLVPKRPDA，SEQIDN0.2所示，其理論分子質量為 1641.95Da。
[0024] 步驟二:鵝0AZ1多肽鑒定
[0025] 應用HPLC，C184·6X250mmAlltimaTM分離柱，并用0·065%三氯乙酸的水溶液和 0.05%三氯乙酸的乙腈溶液進行梯度洗脫，于220nm檢測N末端修飾肽段的純度。結果表明， 本發明設計并合成的鵝0AZ1的N末端修飾肽段純度約為92.15% (圖1)。圖1的峰面積結果匯 總表如表1所不：
[0026] 表1峰面積結果匯總表
[0027]
L〇〇28」米用電噴霧電離質譜萬法測定本友明設計并合成的鵝0AZ1的N末端修飾肽段的分 子量。結果表明，本發明設計并合成的鸛0AZ1的N末端修飾肽段實際分子量為1641.40Da，與 理論值（1641.95Da)-致（圖 2)。
[0029]步驟三:?〇ΑΖ1的N末端修飾肽段與血藍蛋白交聯
[0030] 由于血藍蛋白的抗原性比牛血清白蛋白和雞卵白蛋白的抗原性強，血藍蛋白、牛 血清白蛋白和雞卵白蛋白均可刺激輔助性Τ細胞并進一步誘導Β細胞免疫反應，因而本發明 選擇血藍蛋白作為交聯蛋白，采用MBS作為交聯劑將血藍蛋白和鵝0ΑΖ1的Ν末端修飾肽進行 交聯。其操作方法是，將5mg的血藍蛋白和5mg鸛0AZ1的N末端修飾肽在25°C條件下交聯3h， 并將上述反應液用磷酸鹽緩沖液透析過夜，然后收集并獲得血藍蛋白-0AZ1的N末端修飾肽 段的交聯蛋白。
[0031] 步驟四：抗血清制備及純化
[0032] 用磷酸鹽緩沖液稀釋lOOyg步驟三獲得的交聯蛋白至500yL，加入等體積的完全弗 氏佐劑混勻，漩渦震蕩60min后檢測乳化效果，取1滴抗原滴于去離子水中，lmin不溶解擴散 則表明乳化完全，可用于后續的實驗操作。
[0033]從新西蘭兔耳緣靜脈采集血液并分離血清，_80°C保存作為陰性對照血清。新西蘭 兔經適應性飼養后，將經完全弗氏佐劑處理的血藍蛋白-0AZ1的N末端修飾肽段的交聯蛋白 皮下注射給新西蘭兔體內，15天進行加強免疫，然后采集家兔血液，3000rpm離心10min后收 集血清。
[0034]步驟五:抗血清效價檢測
[0035]用4yg/mL濃度0ΑΖ1的N端修飾肽在4 °C條件下包被間接EL ISA板12h。然后，在室溫 條件下，用山羊血清封閉，再用磷酸鹽緩沖液洗滌以去除未包被的抗原。將由步驟四制備的 抗體按比例為 1:1〇〇〇、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000、1:128000、1: 256000、1:512000進行稀釋。按照每孔100yL的劑量加入檢測板，同時設立陰性對照和空白 對照，然后每孔再加入200yL的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，再加入1:1000稀釋的辣根過氧化物 酶標記的山羊抗兔二抗l〇〇yL，37 °C孵育45min，每孔加入200yL的磷酸鹽緩沖液洗滌2次，每 孔中加入l〇〇yL的TBE顯色液，37 °C孵育15min后，測定450nm的吸光值，與陰性血清的比值大 于2.1判定為陽性，計算抗體效價。本實驗得出的抗體效價為1:512000以上(表2)。
[0036] 步驟六:抗體純化
[0037]采用親和柱層析的方法純化抗體，
[0038]將lmL活化的凝膠懸液注入層析柱，然后加入5mL的偶聯緩沖液沖洗2次。迅速與溶 于5mL偶聯緩沖液的500yg鵝0AZ1的N端修飾肽進行混合，室溫條件下旋轉混合過夜。用偶聯 緩沖液和甘氨酸緩沖液交替洗滌2次，最后用1 X磷酸鹽緩沖液清洗凝膠，制備好的凝膠保 存在1 X磷酸鹽緩沖液中，并加入終濃度為0.02 %的疊氮鈉，4 °C保存。將步驟四獲得的抗血 清與50mM，pH為7.4的磷酸鹽緩沖液等體積混合后，加入含有N端修飾肽的層析柱中，室溫混 勻后，再用4mL偶聯緩沖液洗滌層析柱。用15mL的洗脫緩沖液洗脫層析柱獲得純化的0AZ1抗 體。
[0039] 步驟七:鵝組織0AZ1蛋白質的免疫印跡檢測
[0040] 采用RIPA裂解液提取鵝下丘腦和卵巢組織蛋白。按照標準方法配制SDS-PAGE凝 膠，取16yL的組織蛋白裂解液，并加入蛋白上樣緩沖液5yL，95°C高溫變形10min后置于冰 上，將變性后的蛋白質產物全部加入到膠孔中，先用60V恒壓電泳跑濃縮膠，當指示劑溴酚 藍進入分離膠后改用90V恒壓電泳進行分離，當指示劑達到距凝膠下端約0.5cm處時終止電 泳。在半干轉膜儀上采用電轉膜法將分離的蛋白產物轉至PVDF膜，25V恒壓轉膜10min，用封 閉液室溫搖床封閉3h后回收封閉液，將步驟六獲得的0AZ1抗體作為一抗，用稀釋液稀釋到 1:300后加入雜交袋中，將膜轉移到雜交袋，4 °C孵育過夜。TBST洗膜3次后轉移到另一個雜 交袋中，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗孵育2h后，將膜用TBST和TBS洗滌后，ECL 顯色反應后得到免疫印跡結果（圖3)。
[0041 ]本發明①利用DNAstar軟件對鸛0AZ1氨基酸進行親水性、抗原性等分析并選擇綜 合評分最高的肽段作為擬合成的多肽靶標，然后人工合成該肽段。②鵝0AZ1翻譯具有特殊 的+1移碼機制，當0AZ1只表達0RF1時候，最終獲得的是無抗酶活性的多肽鏈，只有同時翻譯 兩個0RF才能得到0AZ1全長功能蛋白，因而我們選擇位于0RF2的一段多肽序列，其目的就是 為了檢測具有全長功能鵝0AZ1蛋白。
[0042]實驗結果
[0043]圖1和2分別為多肽純度和相對分子量的檢測結果:兔抗鵝0AZ1的N端修飾肽純度 約為92.15% ;質譜檢測結果顯示鵝0AZ1的N末端修飾肽實際分子量為1641.40Da，與理論值 (1641.95)-致。
[0044] 抗血清效價:新西蘭兔抗血清效價在1:512000以上(表2)。
[0045]表2兔抗鵝0AZ1多克隆抗血清的效價
[0046]
[0047] 表2為間接ELI SA檢測兔抗鵝OAZ1多克隆抗血清的效價結果。采用間接ELI SA法檢 測發現所制得的兔抗鵝0ΑΖ1多克隆抗體效價在1:512000以上。
[0048]免疫印跡:免疫印跡實驗結果顯示條帶清晰，特異性好，提示本發明制備的抗體能 特異性結合鵝組織中0AZ1蛋白質，可用于檢測鵝下丘腦和卵巢組織中0AZ1蛋白質表達水平 (圖3)。下丘腦中0AZ1全長功能蛋白質的表達量顯著高于卵巢組織，這與我們所報道的下丘 腦中0AZ1基因 mRNA表達量顯著高于卵巢組織的結果相一致。
【主權項】
1. 一種鵝0AZ1多肽抗原，其特征在于:0AZ1多肽抗原的氨基酸位點位于其+1移碼位點 之后，其序列如SEQ ID NO. 1所示。2. -種抗鵝0AZ1多肽抗體的制備方法，其特征在于，合成SEQ ID NO. 1所示多肽序列， 在其N端增加一個半胱氨酸得到N端修飾肽得到SEQ ID NO. 2所示序列，并進行質譜和高效 液相色譜檢測，將N端修飾肽與血藍蛋白交聯得到交聯多肽，用該交聯多肽免疫新西蘭兔 后，頸總動脈放血收集新西蘭兔血液，3000rpm離心10min后收集血清，然后應用親和柱層析 的方法純化血清中的0AZ1多克隆抗體。3. 利用權利要求2方法所制的抗鵝0AZ1多肽抗體。4. 根據權利要求3所述的抗體，其特征在于:該抗體效價在1:512000以上。5. 權利要求3所述抗體在檢測鵝組織0AZ1蛋白質水平方面的應用。6. 權利要求3所述抗體在檢測鵝0AZ1功能以及多胺調控動物繁殖功能方面的應用。7. 權利要求3所述抗體在鵝下丘腦和卵巢組織中0AZ1全長功能蛋白質檢測方面的應 用。
【文檔編號】C07K16/06GK106008690SQ201610325381
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月17日
【發明人】康波, 姜冬梅, 徐麒麟, 馬容, 何琿, 陳咨余, 易治鑫, 龍詩韻
【申請人】四川農業大學