抗逆相關基因ZmHDZIV13在調控植物抗逆性中的應用方法

抗逆相關基因ZmHDZIV13在調控植物抗逆性中的應用方法
【專利摘要】本發明涉及一種增強植物抗旱抗逆性的基因，是一種增強植物抗逆性的相關蛋白；名稱為ZmHDZIV13，來源于玉米(Zea mays L.)自交系B73，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO：2所示。該蛋白的編碼基因序列如SEQ ID NO：1所示。本發明還涉及增強植物抗逆相關蛋白的編碼基因的應用方法：將攜帶有本發明的ZmHDZIV13基因的表達載體，通過使用Ti質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注射、電導、農桿菌介導等常規生物方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成植株，獲得抗旱抗逆性提高的植株。本發明的ZmHDZIV13基因可用現有的方法構建到現有的植物表達載體中，將本發明的植物抗逆性相關蛋白的編碼基因按常規方法轉入其他植物中，可增強植物的抗旱性。
【專利說明】
抗逆相關基因 ZmHDZIV13在調控植物抗逆性中的應用方法
技術領域
[0001] 本發明涉及一種增強植物抗旱抗逆性的基因；本發明還涉及所述基因在改良植物 對干旱脅迫抗性方面的應用方法。
【背景技術】
[0002] 同源異型域-亮氨酸拉鏈(HD-Zip)是植物所特有的一類轉錄因子，廣泛存在于多 種植物中，不僅在高等植物生長發育、形態建成中發揮重要作用，同時調控植物對生物和非 生物脅迫等逆境的響應過程。擬南芥中的AtHDGll基因編碼一個屬于HD-ZipIV類家族的轉 錄因子，該基因的表達可促進根的伸長和氣孔關閉從而提高植物耐旱性，已有的研究表明 轉AtHDGll基因的擬南芥、煙草和草坪草均表現出較強的耐旱性。目前已經鑒定出玉米HD-Zip IV類轉錄因子基因17個，進化分析表明ZmHDZIV13基因與AtHDGll基因的同源性較高， 推測這兩個基因與AtHDGll基因有相似的功能。但是目前對于玉米HD-Zip IV基因家族的研 究還較少，主要是其在植物不同組織的表達模式和在植物外表皮及毛狀根發育過程中的研 究，其生理功能特別是在環境脅迫中的生理功能還未見報道。
[0003] 本發明根據NCBI數據庫中與AtHDGll基因同源的玉米HD-Zip IV基因 ZmHDZIV13的 cDNA序列。研究了ZmHDZIV13基因克隆，生物信息學分析及植物表達載體構建，并將這個克 隆基因轉入植物，從而快速獲得具有抗逆性狀的轉基因植物。

【發明內容】

[0004] 本發明的目的是提供一種增強植物抗逆性的相關蛋白及其編碼基因；本發明的第 二目的是提供一種增強植物抗逆相關蛋白的編碼基因的應用方法。
[0005] 本發明的目的是通過以下技術方案來實現的：一種增強植物抗逆性的相關蛋白； 名稱為ZmHDZIV13,來源于玉米(Zea mays L.)自交系B73,是具有下述氨基酸殘基序列之一 的蛋白質：
[0006] (1)序列表中SEQ ID:2;
[0007] (2)序列表中SEQ ID:2的氨基酸殘基序列經過一個或者幾個氨基酸殘基的取代 和/或缺失和/或添加且與植物抗逆相關的蛋白質。
[0008] 其中，序列SEQ ID:2由698個氨基酸殘基組成。
[0009] 所述一個或者幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十個氨基 酸的取代和/或缺失和/或添加。氨基酸優先取代如表1所示。
[0010] 表1氨基酸替換表
[0011]
[0012]
轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成植株，獲得抗旱抗逆性提高的植株。
[0022]本發明的ZmHDZIV13基因可用現有的方法構建到現有的植物表達載體中，可在其 轉錄超始核苷酸前加包括組成型啟動子、增強啟動子、誘導型啟動子、組織特異性啟動子、 發育階段特異性啟動子在內的任何一種啟動子。為了便于對ZmHDZIV13基因植物細胞或植 物進行鑒定及篩選，可對所使的載體進行加工，如加入植物可選擇性標記(bar基因、GUS基 因、熒光素酶基因等)或具有抗性的抗生物素標記物(慶大霉素、卡那霉素等）。被轉化的植 物宿主既可以是單子葉植物，也可以使雙子葉植物，如:水稻、小麥、玉米、煙草、擬南芥等。 [0023]實驗證明，在逆境條件下，轉ZmHDZIV13煙草比野生型煙草具有較強的抗旱性。在 干旱脅迫條件下，轉基因煙草存活率、生物量和相對含水量均高于非轉基因植株，同時脯氨 酸含量得到提高，丙二醛含量降低。
[0024] 將本發明的植物抗逆性相關蛋白的編碼基因按常規方法轉入其他植物中，可增強 植物的抗旱性。
【附圖說明】
[0025] 圖1為玉米ZmHDZIV13基因全長PCR擴增產物；
[0026] 圖2為載體pUCm-T-ZmHDZIV13的酶切鑒定；
[0027] 圖 3 為載體 pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar 的酶切鑒定；
[0028] 圖4為6個限制性酶BamH I、EcoR I、Hind III、Sma I、Xba I、Sac I消化煙草基因 組的對比圖；
[0029] 圖5為玉米和擬南芥HD-Zip IV型轉錄因子基因編碼蛋白的進化分析；
[0030] 圖6為玉米ZmHDZIV13和擬南芥AtHDGll基因編碼蛋白序列的同源性比較；
[0031]圖 7 為pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar 表達載體構建流程；
[0032] 圖8為玉米ZmHDZIV13基因轉基因煙草獲取過程圖；
[0033] 圖9為轉基因煙草的PCR鑒定；（其中：M為DNA Marker D2500;CK+為陽性對照；CF 為陰性對照；1-10為抗性植株）
[0034] 圖10為部分經PCR檢測的陽性轉基因煙草植株的Northern blot分析結果；雜交結 果表明SEQ ID NO: 1核苷酸序列能在轉基因煙草中表達；
[0035] 圖11為20%PEG對ZmHDZIV13轉基因煙草幼苗生長的影響；
[0036] 圖12為20 % PEG脅迫下ZmHDZI VI3轉基因煙草和野生煙草存活率的變化；
[0037] 圖13為20%PEG脅迫下ZmHDZIV13轉基因煙草和野生煙草相對含水量的變化；
[0038] 圖14為20%PEG脅迫下ZmHDZIV13轉基因煙草和野生煙草生物量的變化；
[0039] 圖15為20%PEG脅迫下ZmHDZIV13轉基因煙草和野生煙草中丙二醛含量對比；
[0040] 圖16為20%PEG脅迫下ZmHDZIV13轉基因煙草和野生煙草中脯氨酸含量對比。
【具體實施方式】
[0041 ]下述實施中的方法，如無特別說明，均為常規方法。
[0042] 實施例1;SEQ ID N0:2蛋白及其編碼基因的獲得
[0043] 煙草(Nicotiana tobaccum)，生態型為T12,由甘肅省農業科學院提供。
[0044] 菌株：大腸桿菌（Eschrichiacoli)DH5a，用于煙草遺傳轉化的根癌農桿菌 (Agrobacterium tumefaciens)為LBA4404,兩個菌株均為甘肅省干旱生境作物學玉米重點 實驗室保存。
[0045]質粒：T/A克隆載體pUCm-T購自生工生物工程（上海）有限公司，植物表達載體 PCAMBIA3300-35S-PR0II MCS-bar為甘肅省干旱生境作物學玉米重點實驗室改造，卡那抗 性用于T/A克隆。
[0046] 一、核苷酸序列SEQ ID NO: 1的克隆步驟如下：
[0047](一)玉米總RNA的提取與純化 [0048] 玉米RNA的提取(Trizol法）：
[0049] 實驗前準備工作:DEPC水的配置：1L水中加入lml的DEPC(DEPC體積份數是0.1 % )， 37°(：溫浴1211。
[0050] 高壓滅菌至少20min，滅菌2次，使DEPC徹底失活。PCR管，1.5ml離心管，2ml離心管， 各種槍頭等用DEPC水(未滅菌)浸泡，37°C過夜，次日滅菌備用。
[0051 ] 試劑:trizol，氯仿，異丙醇，75%乙醇(DEPC水配置），DEPC。
[0052] (1)取0. lg玉米未成熟雄穗放入研缽中迅速研磨，期間不斷加入液氮；
[0053] (2)將研磨好的材料放入離心管中，迅速加入lml的trizol試劑，渦旋混勻，室溫靜 置5min(室溫過高時也可以冰上放置）；
[0054] (3)4°C條件下12000rpm離心15min，取上清液lml;上清液中加入200μ1氯仿，禍旋 振蕩15S，室溫靜置3min;
[0055] (4)4°C條件下12000rpm離心15min;將樣品上層無色水相（約500μ1)移入另一離心 管中，加入等體積的異丙醇，振蕩混勻，室溫靜置l〇min;
[0056] (5)4°C條件下12000rpm離心15min，棄上清液；
[0057] (6)離心管中加入lml 75%乙醇(RNase free)洗滌沉淀；
[0058] (7)4°C條件下5000rpm離心5min，棄上清液；
[0059] (8)重復步驟(6)、（7);
[0060] (9)將沉淀放在超凈工作臺中，風干約10min，至沉淀變成半透明狀；
[0061 ] (10)離心管中加入60_80μ1 RNase free ddH20,4°C條件下溶解30min;
[0062] (11)取3μ1 RNA溶液在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳檢測RNA質量。
[0063] (二)RT-PCR 擴增玉米 ZmHDZIV13 基因 [0064] 第一鏈cDNA的合成：
[0065] (1)按照生工生物公司M-MuLV第一鏈cDNA合成試劑盒說明，建立20μ1反應體系:將 下列組分依次加入RNase free的PCR管中：RNA溶液5μ1，01igo d(T) 18Primer(0·5yg/yl) 1μ l，RNase free ddH20加至 12μ1;輕輕混勾后，離心3_5S;65°C溫浴5min;
[0066] (2)溫浴后PCR管迅速置冰上冷卻30s，離心3-5s后依次加入以下組分：W5X Reaction Buffer 4μ1,RNase Inhibitor(20U/yl)lyl,dNTP(10mmol/L)2yl；
[0067] (3)輕輕混勻后置37 °C水浴5min;加入M-MuLV逆轉錄酶(2〇υ/μ1) ΙμL，使終體積為 20μ1；
[0068] (4)將上述混合物置于42°C水浴60min;72°C孵育10min終止反應，得到反轉錄 cDNA〇
[0069] (三）目的基因的克隆
[0070] 將上一步得到的反轉錄cDNA稀釋20倍備用。根據已測序的ZmHDZIV13基因組序列 設計一對PCR特異性引物，從cDNA中擴增完整的核苷酸序列。反應條件為:94°C預變性5min; 94°C變性3(^,571(^退火30s，72°c延伸2min;變性、退火、延伸重復35個循環;72°C10min，4 °(：結束程序保存。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。電泳如圖1所示：結果表明獲得2097bp的片 段。
[0071] ZmHDZIV13具有序列SEQ ID N0:1的核苷酸序列。通過RT-PCR的方法從玉米基因組 中克隆到ZmHDZIV13基因的全長cDNA序列，序列長2097bp。以cDNA序列為探針搜索NCBI數據 庫，得到該基因的全長DNA序列(GenBank登錄號:BK008038)，序列比對發現該基因包含10個 外顯子和9個內含子。以ZmHDZI VI 3基因的DNA序列為探針搜索玉米基因組數據庫 (MaizeGDB)，發現該基因位于第4號染色體上靠近端粒的位置。Protparam工具分析表明 ZmHDZIV13基因編碼698個氛基酸，預測分子量為7.62kD，分子式為C3314H5285N963O1QQ5S46,等電 點pi = 6.19，理論推導半衰期為30h，不穩定指數53.03，脂溶指數82.58。蛋白質氨基酸序列 分析表明ZmHDZIV13蛋白不含吡咯賴氨酸(Pyl)和硒半胱氨酸(Sec);絲氨酸(Ser)含量最多 為10.5%;其次是亮氨酸〇^11)，含量為9.3%。總的負電殘基以叩+6111)為77，正電殘基(八坪 +Lys)為69，疏水性平均系數(GRAVY):為-0.164。
[0072] 二、ZmHDZIV13擬南芥AtHDGll基因編碼蛋白序列的同源性比較
[0073]以AtHDGl 1蛋白氨基酸序列為探針檢索NCBI的擬南芥和玉米蛋白質數據庫得到12 個擬南芥HD-Zip轉錄因子序列和17個玉米HD-Zip轉錄因子序列，將這些序列進行比對并構 建進化樹(見圖5)。根據序列比對的結果選取ZmHDZIV13這個HD-Zip IV型轉錄因子基因作 為我們的目標基因。將這個蛋白氨基酸序列分別與擬南芥AtHDGll蛋白氨基酸序列進行同 源性比對，結果表明ZmHDZ IV13與AtHDGll的蛋白氨基酸同源性分別為53.51%(見圖6)。通 過查找GenBank數據庫，找到ZmHDZIV13基因的全長cDNA序列，GenBank登錄號為BK008038， 并以此設計特異引物通過RT-PCR的方法從玉米基因組中克隆ZmHDZIV13基因，并連接到 pUCm-T克隆載體中。
[0074] 實施例2;ZmHDZIV13及其編碼基因的功能驗證
[0075] 一、ZmHDZIV13基因表達載體的構建
[0076](一）目的片段與pUCm-T載體連接
[0077] 根據pUCm-T vector(生工生物）說明書配置如下溶液：10 XLigation Buffer 1.0 yl，50%PEG 1·0μ1，ρυ〇?-Τ vector Ι.ΟμΙ，純化的PCR產物4·0μ1，Τ4 DNA Ligase Ι.ΟμΙ， dd H20 2μ1;16Γ連接6小時。
[0078] (二)大腸桿菌感受態細胞的制備(采用1.5ml離心管制備）
[0079] 菌液轉入預冷的1.5ml離心管中，4°C3500rpm離心10min，去上清液。離心管中加入 300μ1冰冷的0. lmol/L的CaCh溶液重懸菌體，冰浴SOmirufC條件下3500rpm離心10min。去 上清液，將菌體懸浮于60μ1冰冷的0. lmol/L的CaCl2溶液中，加入10μ1甘油，液氮速凍后于-80°C冰箱中保存，使用時取出，置于冰上融化。
[0080](三)連接產物轉化大腸桿菌
[0081 ]取100μ1感受態細胞置于冰上，完全解凍后輕輕將細胞均勻懸浮。加入5μ1連接液， 輕輕混勻。冰上放置30min。加入400μ1 LB液體培養基，37°C，250rpm振蕩培養lh。將離心管 內容物混勻，吸取200μ1菌液涂布在預先用20yl100 mM IPTG和100μ1 20mg/ml X-gal涂布的 氨芐青霉素平板上。平板在37°C下正向放置1小時以吸收過多的液體，然后倒置培養過夜。 [0082](四）堿裂解法小量提取大腸桿菌質粒DNA
[0083] (1)挑取平板上單菌落，接種于5ml附加氨芐青霉素的LB液體培養基中，37°C， 250rpm振蕩培養過夜。
[0084] (2)取1.5ml培養液倒入1.5ml離心管中，4°C12000rpm離心30s。
[0085] (3)棄上清，將離心管倒置于濾紙上幾分鐘，使液體流盡。
[0086] (4)菌體沉淀重懸于100μΙ溶液I中，劇烈振蕩，室溫放置lOmin。
[0087] (5)加入新配置的溶液II 200μ1，蓋緊管口，快速溫和振蕩離心管數次，以混勻內 容物，冰浴5min。
[0088] (6)加入150μ1預冷的溶液III，蓋緊管口并倒置離心管，溫和振蕩10s，冰浴5min，4 °〇條件下，12000rpm離心5min。
[0089] (7)將上清液（約400μ1)移入另一干凈的離心管中，加入200μ1 tris-飽和平衡酚 和200μ1氯仿/異戊醇（24/1)振蕩混勾，4°C條件下12000rpm離心5min。
[0090] (8)將上層無色水相(約400μ1)移入一新的干凈離心管中，加入11111(2.5倍體積)預 冷的無水乙醇，振蕩混勻后置于-20 °C冰箱中20min，然后4°C條件下12000rpm離心5min。
[0091] (9)倒掉上清液，將管口敞開倒置于濾紙上使所有液體流盡，加入lml預冷的70% 乙醇洗滌沉淀，4 °C條件下，12000rpm，離心5min。
[0092] (10)重復步驟9。
[0093] (11)吸出上清液，將離心管倒置于衛生紙上，使液體流盡，室溫干燥。
[0094] (12)將沉淀溶于20μ1 TE緩沖液中，37°C水浴lh，儲存于-20°C冰箱中。
[0095] (五)質粒DNA的PCR驗證
[0096] 以大腸桿菌質粒DNA為模板(稀釋10倍），擴增ZmHDZIV13,并引入酶切位點。PCR反 應25·0μ1 體系如下：ddH20 9.5yl，Premix EX Taq 12.541,57 引物（ΙΟμ mol/υ?.Ομυ'引 物（ΙΟμ mol/L) 1 · 0μ1，質粒 DNA 1 · 0μ1。反應條件為:94°C 預變性 5min; 94°C 變性 30s，57 · 1°C 退火3〇8,72°(：延伸111^11;變性、退火、延伸重復30個循環；72°(：1〇1^11 ;4°(：結束程序保存。 1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測。挑選陽性克隆菌液送去測序。測序結果表明2097bp的片段具有 由序列1的5'的第1至2097位脫氧核苷酸組成的核苷酸序列。
[0097] (六)pUCm-T-ZmHDZIV13 載體酶切驗證
[0098] 用 Xbal 和 Smal 雙酶切 pUCm-T-ZmHDZIV13 得到 2115bp 的 ZmHDZIV13 基因線性片段 (見圖2);雙酶切CPB(pCAMBIA3300-35S-PR0II MCS-bar)得到單一的大小為9580bp的線性 片段，兩個線性片段連接得到pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar表達載體(見圖ThXbal和 Smal雙酶切pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar表達載體進行鑒定，結果表明植物表達載體 pCAMBIA3300-35S-ZmHDZIVI 3-bar構建正確（見圖 3)。
[0099]二、轉ZmHDZIV13基因煙草的鑒定及功能分析 [0100](一)轉ZmHDZIV13基因煙草的獲得及篩選
[0101] (1)利用葉盤法轉化煙草，Baste除草劑抗性篩選
[0102] 將構建的質粒PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar轉入農桿菌LBA4404,用葉盤法轉 化煙草，方法如下：
[0103] 外植體預培養:剪取完全展開的無菌試管苗的葉片，剪去葉緣接種于再生培養基 (MS+6BA lmg/L)黑暗培養 1 ~Μ。
[0104] (2)農桿菌的培養
[0105] 從含有根癌農桿菌平板上挑取含有目的基因的單菌落，接種到3ml YEP液體培養 基中（Rif 50μg/ml、Kan 50μg/ml)于27°C恒溫搖床上，220rpm震蕩培養過夜0D6qq為0.6-0.8。培養過夜的菌液按1 %~2 %的比例，轉入新配置的無抗生素的YEP培養基中，在與上述 相同的條件下培養6h左右，0D600為0.4~0.6時即可用于轉化。
[0106] (3)轉化
[0107]于超凈工作臺上，將菌液倒入無菌的小培養皿中，取不具Basta除草劑抗性的煙草 無菌苗的幼嫩、健壯葉片，去主脈，將葉片剪成0.5cm2的小塊，放入菌液中，浸泡5~1 Omin， 取出葉片置于無菌濾紙上吸去附著的菌液，接種于共培養基MS培養基，pH 5.8、添加瓊脂 9g/L，共培養(黑暗，23°C)3d。
[0108] (4)選擇培養
[0109]將共培養后的外植體接種于選擇培養基，培養基為:MS培養基+6BA 3mg/L+NAA 0 · 2mg/L+Carb 500mg/L+Basta 30mg/L+瓊脂8g/L，pH5 · 8;置于光照培養架上，每隔20~30d 繼代一次，至分化出轉基因植株。
[0110] (5)轉基因植株生根與移栽
[0111] 將轉基因植株接種到生根培養基中，生根培養基為：1/2MS培養基+Carb 250mg/L+ 8&5^&3〇!^/1+瓊脂88/1，？!15.8，置于培養架上，進行誘導生根培養，轉基因植株生根后打 開瓶蓋，進行自然光照，溫度控制在20~25°C，煉苗4d，再將轉基因苗移栽至營養缽中，置于 溫室培養。等根系發達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養基，移入土壤中，剛開 始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養主要過程如圖8所示:其中：A 表不煙草葉片共培養;B表不選擇和生根培養;C表不轉化植株移栽;D表不T1代株系純化篩 選。
[0112]將轉基因煙草To代種子播種于營養土中，在22°C/18°C、16h/8h光周期條件下培養 7d左右，用300yg/L Basta除草劑均勻噴灑葉片，5d后大部分幼苗開始黃花，逐漸枯萎死亡， 少數能繼續生長，并且葉片為綠色，表形正常(見圖8中的D圖）。經PCR鑒定的陽性植株，分單 株系收獲籽粒，得到的種子為!^代，經除草劑篩選單株收獲得到種子為^代，純合體同一株 系可以混收種子。本研究共得到25株ZmHDZIV13T 2代純合株系，從中分別隨機選取10個株系 進行表型鑒定。
[0113] (二)轉基因煙草植株的PCR鑒定
[0114] 以 ZIV13-F1 : 57 ATGGACTTCGGCGACGACGT CAT 3 7，Z I V 1 3-R 1 : 5 7 TCAATGGCTGGCCAATTCAAGGC3'，為引物，對Basta除草劑篩選為陽性的轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar T2代煙草基因組進行PCR檢測，以野生型的煙草（圖9中CK_)和 PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar (圖9 中 CK+)的 PCR 檢測為對照，結果表明除了 L4、L9外，其 他均可以擴增到2097bp的條帶，而野生型中沒擴增產物出現。
[0115] (三）轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar 煙草的 Southern 雜交驗證
[0116] 將Basta除草劑篩選和PCR為陽性的轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar煙草單株 提取0麻，以2111!1021￥13基因的特異引物21￥13-卩1、21￥13-1?1，以轉？〇厶1?1厶3300-355-ZmHDZIV13-bar煙草基因組DNA為模版擴增得到2097bp基因片段為探針進行Southern雜交， 具體方法如下：
[0117] 3.1探針的純化及標記效率檢測
[0118] 探針標記效率檢測是為了確定雜交時最適探針濃度及檢測探針敏感性。根據預估 合成的探針濃度，將標記的探針和陽性對照稀釋到lng/μL，以該濃度為起始濃度，進行系列 稀釋，分別稀釋成 10pgAiL、3pg/yL、lpg/yL、0 · 3pg/yL、0 · lpg/yL、0 · 03pg/yL、0 .Olpg/yL、 Opg/μΜ標記的探針與陽性對照一一對應點在尼龍膜的同一行，選擇信號強度相當的乘以 相應的稀釋倍數，計算出探針的最終濃度。合適的探針濃度較難掌握，可根據雜交效果進行 微調，如果背景值較高，可將原來的雜交液進行適當的稀釋，信號較低時，再加入少量探針。
[0119] 3.2擬南芥DNA的提取及定量
[0120] 樣品基因組DNA含量會影響Southern雜交的結果。一次Southern雜交約需10yg總 DNA(0D260/0D280 = 1.8~2.1)。植物組織基因組較大，要獲得較強的雜交信號，樣品DNA量 在30yg左右為宜。本實驗采用改良CTAB法提取DNA，延長樣品在5 5 °C提取液中水浴時間至 3h，提取的棉花基因組DNA量大，完整性好。提取多個樣品需通過電泳或紫外分光光度計來 保證各樣品之間的DNA含量基本相同，使雜交信號強度一致，有可比性。
[0121] 3.3限制性內切酶的選擇
[0122] 參見圖4:選擇BamHI、EcoRI、Hindm、Smal、XbaI、SacI六個限制性酶消化擬南芥基 因組。對于ZmHDZI VI3基因，6個內切酶消化基因組的效果較完全，表現出彌散的電泳圖譜， 且出現衛星條帶。對ZmHDZIV14基因除Hindm外，其他內切酶消化基因組的效果較完全因此 最終選取BamHI、EcoRI、SmaI、XbaI、SacI五個內切酶消化擬南芥DNA。
[0123] 3.4酶切產物的回收及電泳
[0124] 酶切16h后取5μ1電泳觀察擬南芥DNA是否酶切徹底，若酶切后有衛星條帶，表明酶 切較為徹底。然后加1 /1 〇倍體積3 m ο 1 / L的乙酸鈉，0.6 -1倍體積預冷的異丙醇，混勻， 12000rpm離心 10min，沉淀用35μ1 ddH20溶解，加5μ1 loading buffer輕輕混勾，65°C水浴 10min，迅速至冰上2-5min，將DNA上樣到1 %凝膠孔中，40V電泳12h。
[0125] 3.5轉膜與固定
[0126] 將膠裁成5.0 X 4.0cm大小，于平皿中用ddH20沖洗一次，加入100ml 0.25mol/L的 鹽酸脫嘌呤，室溫震蕩15-30min，至溴酚藍變成黃色；ddH20沖洗兩次，加變性液混合液 (1 · 5mol/L NaCL，0 · 5mol/L NaOH)室溫震蕩20_30min，可延長至90min，至溴酸藍恢復到原 來的藍色；用ddH20沖洗2次，加入2 X SSC平衡凝膠5min。
[0127] 3.5.1虹吸印記法轉膜
[0128] 在清洗干凈的方盤中放置一玻璃板，其上放置一濾紙，濾紙兩端浸入盤內10XSSC 中，用玻璃棒趕走濾紙和平板之間的氣泡;將凝膠倒置于玻璃板上，正面朝下，切掉一角作 為標記，并用保鮮膜將四周封閉以防吸水紙接觸凝膠的邊緣造成液體短路;將尼龍膜至于 置于平衡凝膠上面，趕走氣泡;膜上放兩張濾紙，其上再放20層吸水紙；吸水紙上放一玻璃 板，其上放600g左右的重物，建立液體從液池經凝膠像尼龍莫的上行通路，以洗脫凝膠中的 DNA并使其聚集到尼龍膜上;室溫下過夜轉膜16h以上，期間更換2-3次吸水紙;轉膜后EB染 色，觀察轉膜效果，并標記序號、加樣孔位置及對應的分子量標準位置;用2 X SSC漂洗尼龍 膜1次，濾紙吸干，靜止l〇min。
[0129] 3.5.2 固定
[0130] 120°C烘烤尼龍膜30min(若稍后進行實驗:將干燥的尼龍膜儲于2~8°C，用時用2 XSSC 浸泡 5min)
[0131] 3.6雜交
[0132] 分2次小心的將64ml ddH20加入到試劑盒DIG Easy Hyb Granules中，立即在37°C 下攪拌5min至完全溶解，溶解終體積100ml。
[0133] 預雜交:取8.0ml 65°C預熱的DIG Easy Hyb Granules高效雜交液加入雜交管中， 排凈氣泡，65°C雜交爐中預雜交2h(8-15rpm)。
[0134] 探針變性:將標記的探針沸水浴中變性5~lOmin，立即放冰上冷卻lOmin。
[0135] 雜交:排凈預雜交液，在8 .Oml新DIG Easy Hyb Granules加入4· ΟμL新變性好的探 針（1~3μ1/膜，5~20ng/ml雜交液），混勾，65°C雜交儀中雜交20h(8~15rpm);雜交完成后， 將雜交液回收置于一可耐低溫又可耐沸水浴的管中，儲于-15~-20°C以備重復使用。使用 時解凍并在65 °C下變性lOmin。
[0136] 3.7 洗膜
[0137] (1)雜交后室溫下，20ml 2XSSC/0.1洗膜2次，每次5min;
[0138] (2)預熱到50°C，20ml 0.1XSSC/0.1%SDS洗滌2次，每次 15min;
[0139] (3)然后將膜置于20ml的洗滌緩沖液中平衡2-5min;
[0140] (4)在搖床上輕輕搖晃，將膜在10ml封閉緩沖液中孵育30min;
[0141] (5)封閉完成后倒出阻斷液，加入稀釋好的10ml抗體溶液，孵育至少30min;
[0142] (6)去除抗體緩沖液，用20ml洗滌緩沖液緩慢洗膜2次，每次15min;
[0143] (7)去除洗滌緩沖液，20ml檢測緩沖液中平衡膜2次，每次2-5min;
[0144] (8)用檢測緩沖液稀釋300μ1 NBT/BCIP化學顯色底物，在約15ml新鮮制備的顯色 液中反映顯色，在顯色過程中勿搖動。16h完成反應，為檢測顯色程度，中途可短時間曝光觀 察；
[0145] (9)斑點或條帶出現后，用50ml TE緩沖液或PCR級用水洗膜5min，照相，結果如圖 10所示，圖10表明：未轉化植株和L4未顯示任何雜交信號，ZmHDZIV13基因 LI、L10轉化植株 都顯示了雜交信號。
[0146] 三、功能鑒定
[0147] (一)干旱對轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar煙草幼苗生長的影響
[0148] 將野生型和轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar煙草植株T2代種子種到營養缽 中，生長至3葉期，添加20 % PEG溶液。PEG脅迫7d后，轉ZmHDZIV13基因煙草植株與非轉基因 植株的長發育狀態發生了很大的變化，并且轉基因植株與非轉基因植株的萎蔫程度也有著 明顯的差別(見圖11)。干旱脅迫時，非轉基因植株葉片開始脫水，干旱環境已經對非轉基因 煙草的生長產生抑制，而轉基因植株未受影響；隨著脅迫時間延長，轉基因煙草植株與非轉 基因植株都出現了不同程度的萎蔫死亡，但非轉基因植株萎蔫程度要比轉基因植株嚴重； 說明轉基因煙草有一定的抗旱能力，干旱脅迫環境下，ZmHDZIV13基因在一定程度上減輕了 干旱對植株的脅迫傷害。
[0149] (二)干旱對轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZI VI 3-bar煙草和野生煙草存活率、生物量、 相對含水量的變化
[0150] 干旱處理的1~2代煙草轉基因植株和野生型煙草植株，在20%PEG脅迫處理5d后，測 定其存活率、葉片相對含水量及生物量，對應結果如圖12、圖13與圖14所示。
[0151] 圖12表明在非脅迫條件下，轉基因植株與野生植株的存活率均為100%，PEG脅迫 處理5d后，與脅迫條件下野生型相比，轉ZmHDZIV13的存活率提高31.38%。
[0152] 圖13所示:在正常條件下野生型和轉基因植株的葉片相對含水量都保持在97%左 右，無明顯差異;干旱處理后，各植株葉片相對含水量均表現為下降，野生型植株葉片相對 含水量下降最多，下降了一半以上，其葉片相對含水量只有45.67%，而轉ZmHDZIVl基因煙 草T2代植株的相對含水量基本都在60%左右，即PEG脅迫5d時，轉基因煙草葉片的相對含水 量較脅迫下野生型的分別高出41.93 %，表明在脅迫條件下，ZmHDZIVI3轉基因煙草T2代植 株的葉片持水性較野生型植株強。
[0153] 圖14所示:在正常條件下生長20d的野生型和轉基因單株生物量都保持在1.75g左 右，差異不顯著;干旱處理后，各植株的生物量均表現為下降，野生型植株葉片生物量下降 最多，下降了42.28%。在脅迫條件下，與野生型煙草相比，轉ZmHDZIV13基因煙草植株的生 物量高出32.68%，因此，轉ZmHDZIV13基因煙草對干旱脅迫具有更好的抵御能力。
[0154] (三)干旱對轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar煙草幼苗丙二醛含量的影響
[0155] 將野生型和轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar煙草植株的T2代種子種在營養缽 中，培養至3葉期后用20%PEG溶液處理幼苗根系，5d后稱取O.lg葉片于10%三氯乙酸中研 磨，12000印111離心1〇111；[11。取21111^上清液與21111^0.6%硫代巴比妥酸混合，于沸水浴中反應 15min，迅速冷卻后離心。取上清液測定532nm、600nm和450nm波長下的光吸收。
[0156] 丙二醛(Malondialdehyde，MDA)的濃度根據以下公式計算：C(ymol L-3 = 6 · 45 (0D532-0D6(x)) -0.560D45Q;進一步算出組織中的含量;結果如圖15所示。圖15表明：在不加 PEG 的條件下，野生型和轉基因植株的丙二醛含量基本無差異，在PEG脅迫處理5d后，相比于脅 迫下的野生煙草，轉21^021￥13基因煙草葉片的1?從含量顯著降低，降低了20.71%;說明干 旱脅迫下轉ZmHDZIV13植株的膜質過氧化程度明顯小于野生型。
[0157] (四）干旱對轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar煙草幼苗脯氨酸含量的影響
[0158] 1、按照上述方法，將野生型和轉PCAMBIA3300-35S-ZmHDZIV13-bar煙草植株的T2 代種子種在營養缽中，培養至3葉期后用20%PEG溶液處理，然后，按照如下方法檢測脯氨酸 含量:準確稱取不同處理的待測植物葉片各〇.5g，分別置大管中，然后向各管分別加入5ml 3%的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取lOmin，（提取過程中要經常搖動），冷卻后過濾于干 凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。
[0159] 2、吸取2ml提取液于另一干凈的帶玻塞試管中，加入2ml冰醋酸及2ml酸性茚三酮 試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。冷卻后加入4ml甲苯，搖蕩30S，靜置片刻，取上 層液至l〇ml離心管中，在3000rpm下離心5min。
[0160] 3、用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對照，在 分光光度計上520nm波長處比色，求得吸光度值。結果計算根據回歸方程計算出（或從標準 曲線上查出）2ml測定液中脯氨酸的含量(Xyg/2ml)，然后計算樣品中脯氨酸含量的百分數。 計算公式如下:脯氨酸含量(yg/g) = [XX5/2]/樣重(g);結果如圖16所示。圖16表明：在非 脅迫條件下，野生型和轉基因株系中游離脯氨酸的含量基本無差異;在PEG脅迫處理5d后， 與脅迫下的野生煙草相比，轉基因株系游離脯氨酸含量顯著增加，分別提高了33.95%。 <.11.0>_甘肅農業大學 < 120>抗逆相關基因 ZmHDZIV13在調控植物抗逆性中的應用 <160> 2 <170> Patentln version 3.3 <210> SHQID： 2 <211> 698 <212> PRT <213> 玉米（辦句這!>·) <400> 1
[0161] Met As；p Phe Gly Asp· Asp. ￥al Met Asp Gly Gly' Ser A：sp· Ala Gin Arg 1 5 10 15 Arg Lys Lys Ar：cj· Tyr· His Arg His Thx Fro Arg Gin lie Gin .Gin Leu 2:0 .25' 3：Q Glxi Ala Met Ph：e. Lys Glu C.ys Pro： His Pro Asp Glu Aan Gin Arg Met 35 40： 45 Girt L:e:u Ser Arg· Glu Lexi Gly La：u Glii Pro Ar.g· G'lri lie Ly：s： Phe: Trp 5? :5.5 60： Phe G:l.n A.s.n Arg Airg Thr. i5.1n Met Lys Ala Gin His CSlu. Arg Gin A爭-p ：65 7.0 75 S.O Asn Cys .P:h:e Leu Arg .Ala Glu ASii Asp Lys 工.le Ar:g. Gys Glu ?βη. lie: .81 85 9Q ：9.5 A.la Met Arg· Glu Ala Leu Arg :Ser ￥al 工le C.ys PrD Thr Cys； -Gif Gl.y 1.0-D 105 11.0 Pro Pro Val AXa Asp· Asp Tyr Phe Asp Qlu Gin Ly:s Leu Me.t .Glu 115· 120 125 As.n Ala Arg Leu. Lys Glu Gin Leu As:p Arg Val Se：r S：er· L.en T'hr Ser 130 135 .140 Ly.s Tyr Leu Gl.y Acg Ρ?ο X.la Thr Gin. Leii Pr.o Pro. .Ala Gin Ala Ala· .14.5 15Q 155 16-0 Leu Ser Met Ser Ser Leu Asp Ley Sar Val Gly Gly L：eu Qly 'Ser Pro 161 165 170 175 Ser Leu Asp Leu Asp Leu Le：xi Ser Gl,y Gly Ser Ser Gly Tyr Pro Pro 1.8::0 185 1 冊 Ehe His Leu Pro Met Fro: V.a.1 S.e.r Glu Met Glu Arg Pro Met Met Ala 195 '200 2..0.5 Glu Met A」a Th.r A:r.g .A]_s Met Asp Glu Led I.le Arg Met Ala Girl :A:L.a. 210 215 2.2.0 Gly Glu Leu Trp Val Lys Ala Gly -Gly Arg Glu Val Leu Αεη Val ：22.5 2.30 23.5 24C Asp Thr Tyr Asp Ser Val Phe: Ala Lys Pro Gly Ala Ala Ser Phe. Arg 241 245 25:.0 255. Gly Pro Asp Val His Val :Glu Gly Ser Arg Asp Ser Gly Leu Val Phe 2：6'.〇 2 6;5 2-70 Met Ser Ala. Val Gly Leu· Val Asp- Met Phe Met Asp Setr Ser :L:y:s T.rp 2 IS 280 2：8,5 Thr Glu Phe Phe Pro Ala lie Val Ser Lys Ala Arg Thr Val Asp. Val
[0162] 290 295 3G0- Den V.a工 Aan G:l.y Met Gly Arg S.lu Leu 'Vel Leu Met Tyr 3.0'5 310 315 320 G:lu :Glu Leu .His Val Met Ser Pro Val Val Pro Thr Ar.g· Glu Ph.e Cys' 321 325 33:0 335 Phe Leu Ar.g Tyr Cys .Arg Gl.ri 工l.e- G丄i:i- A:rg Gly I」eU. T.i?二? Ala lie. Alia 3:4.0: 34 5 35? Asp lie Ser Val Asp Leu Gin .Gin His Asp Ala Arg Phe- Gly Ala .Pro: 355 36C 365 Pro Ser Arg S:er C'ys Arg Leu Pro Ser Gly ( ^s Leu lie· Ala '-hsp. Met 370 3,7 5 3:8-0 Ala Asp Gly Ser Ser Lys Val Thr Trp Val Glu His Met Glxi 工le: Glu. 485 3：·9·0 395 40C Asp Arg Val Pro lie·· His L：eu Ley Tyr Arg As：p· Leu lie· Leu Se ：r Gly 401 4 0 5. 410 415 Ala Ala Phe Gly Ala Hie Arg Trp L：eu Ala Alg. Leu Gin Arg Ala Cys· 420 4-2.5 4 3-0 Glu Arg Cys Ala Cy:s L:eu Val Pro Al.a Gly Met Pro His. Arg A:s.p. lie· 435 440 445 Ala Val Ala Gly Val .Thr Pro .Glu. Cly Lys Arq Ser Met· Met Lys Le：u 45? 455 460 Se：r Gin Arg· MET Val Ser S.e.r Phe C,ys Ala Ser Leu S；er Ala Ser Gin 465 470 475 4.80 Leu Η?·5 Arg Trp· Thr Thr Leu Ser Glv Pro S：er Asp Val Gl.y Val Arg 481 5-85 49:0 4 9：5 Val Thr' Val His Arg Ssr Thr Asp Pro Gly Gin Pro Ser Gly Val Val r)00 5.05 510 Leu. Se-.r Ala Ala T.h.r Se.r: lie Tr.p Le.u Pro Val Pro C.ys Asp Arg Veil 515 5.2：Q 525 Bhe Ala Ph：e Va.l iVrg -Asp Glu His： Thr -Ar:g S：e；:r Gin Xrp Asp Val Leu 53C 53.5 54C ：S.e:r His： Gly As:n Pro Val Gin; Glu Val Ser Arg lie Pr：〇' Asn Gly ：Ser 545- 5:5.0 55.5. 5 60. Eis. Fro Gly Asn Gys 工le S.er Le:J Leu Arg :(31.γ Leu Asn Ala S.er Gin 561 5.6_5 5?Q: 5-75 Asn Ser Me：t Le :u. Il§. Leu Gin- Glu Ser Gys Thr Asp Gly Thr Glv Ser· 5·8? 58,5 G..90 Le:u Val. Val Tyr .Al.a Pro Il:e Asp lie. P.r.〇 A-l.a iUa Asn Val Val Met 595. 600 6::05 Ser :Gl.y Glu Asp- Pro .Ser Ala. lie Pr-?. Leu Le:u, P.r0 Ser .Gly Phe Thr 610. 615 6.2 C lie Le'u Pro· Asp Gly .Arg E Jr:〇 .Gly Ala Pro Ser Ser Ser' S：er Ala Gly 6.2-5 630 .635. 6^0 Gly .Pro Leu Val G丄y S-e：r .Pro- Ala； Ala Ala; Gly Se.r Leu. Val Thr Val β41 645 6：5? ^55
[0163] Ala Ph,e Gl.n XIe Leu ￥al Ser Ser Leu Pro S：er Ser Arg. Le:u Asn Ala Bm. M5 670 Glu Ser Val Ala Thr V^il Asn Se.r Leu lie S:e.r Thr Thr Val Glu Gin .67 5 €80 6：.8.5 lie L；ys Ala Ala Le'U .Asn Cys Al.a Se-r His 69Q. 69.5 698 <160 2 < 170> Patentlti wsioti 3 J ^210> SL-J.QID: 1 <2\)> 2097 <212- DN 八 <213> 玉米L_) <400> 2 atggaetteg gcgaGgacgt eatggBGggq ggetcGgaeg ceeagGgcisg Gaagaagaga 60 taccaccgcc acacaccgcg ccagattcag cagctcgagg cgatgttcaa ggagtgcccg 120 cacccggHGg agaact-agcg gatgeagetg ageagggage tggggctgga gccccggcag ：18Q
[0164]
【主權項】
1. 一種增強植物抗逆性的相關蛋白；其特征在于：名稱為ZmHDZIV13,來源于玉米(Zea mays L.)自交系B73,其氨基酸序列如序列表SEQ ID N0:2所示。2. 如權利要求1所述的一種增強植物抗逆性的相關蛋白，其特征在于:該蛋白的編碼基 因序列如SEQ ID N0:1所示。3. 如權利要求2所述的一種增強植物抗逆性的相關蛋白，其特征在于:重組表達載體或 轉基因細胞或工程菌含有權利要求2的編碼基因。4. 一種增強植物抗逆相關蛋白的編碼基因的應用方法;其特征在于：將攜帶有本發明 的ZmHDZ IVI3基因的表達載體，通過使用T i質粒、Ri質粒、植物病毒載體、直接DNA轉化、微注 射、電導、農桿菌介導等常規生物方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物經組織培育成 植株，獲得抗旱抗逆性提高的植株。
【文檔編號】C07K14/415GK106008687SQ201610383891
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年6月1日
【發明人】彭云玲, 閆慧萍, 趙小強, 武博洋, 方鵬
【申請人】甘肅農業大學