抑制產氣莢膜梭菌感染的重組β2蛋白及其制備方法與應用

抑制產氣莢膜梭菌感染的重組β2蛋白及其制備方法與應用
【專利摘要】本發明公開了抑制產氣莢膜梭菌感染的重組β2蛋白及其制備方法與應用。該重組β2蛋白為a)或b)或c)：a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質；b)由SEQ ID No.2第51?286位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；c)在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白。該重組β蛋白免疫動物后可使動物產生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產氣莢膜梭菌的攻擊。該重組β蛋白可溶性好，純化簡易，可作為診斷抗原、制備成單克隆抗體或進一步對蛋白功能與構象關系進行研究。
【專利說明】
抑制產氣莢膜梭菌感染的重組β2蛋白及其制備方法與應用
技術領域
[0001]本發明涉及生物技術領域中抑制產氣莢膜梭菌感染的重組β2蛋白及其制備方法 與應用。
【背景技術】
[0002] 產氣莢膜梭菌(Clostridium Perfringens)也稱魏氏梭菌，是一種重要的人畜共 患病，該病原是創傷性氣性壞疽和人類食物中毒以及羊快疫、羔羊痢疾、牛羊壞死性腸炎、 牛羊腸毒血癥的主要病原之一，對畜牧業造成了巨大的經濟損失。產氣莢膜梭菌主要的致 病因素是其分泌的外毒素，種類多達13種，其中α、β和ε是最主要的外毒素，根據產生外毒素 的種類不同，可將產氣莢膜梭菌分為43、(：、〇4這五個血清型。02毒素是產氣莢膜梭菌所有 毒素基因中最新發現的非常重要的一種外毒素，其中主要以Β和C型的細菌可產生該毒素。 產氣莢膜梭菌的β2毒素導致動物傳染病的防控是當前困擾動物疫病防控工作著的主要難 題之一。傳統疫苗在治療和預防動物產氣莢膜梭菌疾病方面雖然取得了一定的效果。但是， 這些疫苗在使用過程中仍然暴露了一些缺陷，例如傳統疫苗免疫易引起動物局部炎癥以及 毒性反應等。研發能表達β2外毒素抗原蛋白，并且不破壞β2外毒素抗原蛋白的免疫原性，對 產氣莢膜梭菌β2外毒素引起的疫病起到防控作用的基因工程疫苗是急需解決的技術難題。
[0003] 現有技術中對產氣莢膜梭菌主要外毒素蛋白的表達與純化方法相對復雜，表達產 物通常以不溶性的包涵體形式存在，可溶性蛋白表達的報道在國內外非常少。因為包涵體 中的表達產物不具有生物學活性，因而需要進行變性與復性處理。蛋白的變性與復性是一 個極其復雜的過程，不同蛋白的復性條件各異，復性率往往很難提高。這是限制其應用的主 要制約因素。采用可溶性表達方式可很好的克服這一問題。如何構建可溶性表達載體并且 優化可溶性蛋白的高效表達方法，是本領域長期以來一直研究的熱點課題。

【發明內容】

[0004] 本發明所要解決的一個技術問題是如何獲得抑制產氣莢膜梭菌感染的可溶性蛋 白質疫苗。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供了制備重組β2蛋白的方法。
[0006] 本發明所提供的制備重組β2蛋白的方法，包括使重組β2蛋白的編碼基因在生物中 進行表達得到所述重組β2蛋白的步驟;所述生物為微生物、植物或非人動物；
[0007] 所述重組β2蛋白為a)或b)或c)或d):
[0008] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0009] b)由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0010] C)在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白； [0011] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質。
[0012] 上述方法中，a)的蛋白質名稱為β2-his，b)的蛋白質名稱為β2-Y。SEQIDNo.2由 353個氨基酸殘基組成。
[0013] 上述方法中，蛋白標簽是指利用DNA體外重組技術，與目的蛋白一起融合表達的一 種多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表達、檢測、示蹤和/或純化等。
[0014] 上述方法中，所述使重組β2蛋白的編碼基因在生物中進行表達包括所述重組β2蛋 白的編碼基因導入受體微生物，得到表達所述重組β2蛋白的重組微生物，培養所述重組微 生物，表達得到所述重組β2蛋白。
[0015] 上述方法中，所述受體微生物可為C1)_C4)中的任一種：
[0016] C1)原核微生物；
[0017] C2)革蘭氏陰性細菌；
[0018] C3)埃希氏菌屬細菌；
[0019] C4)大腸桿菌 BL21(DE3)〇
[0020] 上述方法中，所述蛋白質的編碼基因為如下1)或2)或3)或4)所示的基因：
[0021] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子；
[0022] 2)編碼序列是SEQ ID No.l的第151-861位所示的DNA分子；
[0023] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述重組β2蛋白。
[0024] 其中，SEQ ID No.l由1068個核苷酸組成，其名稱為f32-hisY基因，編碼氨基酸序列 是SEQIDNo.2的蛋白質β2-his。SEQIDNo.l的第151-861位所示的DNA分子是β2-Y基因， 編碼由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列組成的蛋白質β2-Υ。
[0025]上述方法中，所述重組微生物為將pET30a-i32-Y導入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表 達氨基酸序列是SEQ ID No. 2的重組β2蛋白的重組微生物，所述重組微生物命名為BL21 (DE3) /pET3Oa-02-Y，所述 pET3Oa-02-Y 為將載體 pET30a (+)的 BamHI 和 Xho I 位點之間的序列 替換為SEQ ID No.l第151-861位所示的DNA片段得到的重組載體。
[0026] 上述方法中，所述表達為誘導表達，所述誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘導 13-16小時或13-24小時或13小時或16小時。
[0027]下述任一種產品也屬于本發明的保護范圍：
[0028] P1)重組β2蛋白，所述重組β2蛋白為a)或b)或c)或d):
[0029] a)由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0030] b)由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
[0031] c)在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白；
[0032] d)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的可溶性蛋白質；
[0033] P2)與所述重組β2蛋白相關的生物材料，所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一 種：
[0034] Β1)編碼所述重組β2蛋白的核酸分子；
[0035] Β2)含有Β1)所述核酸分子的表達盒；
[0036] Β3)含有Β1)所述核酸分子的重組載體；
[0037] Β4)含有Β2)所述表達盒的重組載體；
[0038] Β5)含有Β1)所述核酸分子的重組微生物；
[0039] Β6)含有Β2)所述表達盒的重組微生物；
[0040] B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物；
[0041 ] B8)含有M)所述重組載體的重組微生物；
[0042] B9)含有B1)所述核酸分子的轉基因動物細胞系；
[0043] B10)含有B2)所述表達盒的轉基因動物細胞系；
[0044] B11)含有B3)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0045] B12)含有M)所述重組載體的轉基因動物細胞系；
[0046] B13)含有B1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；
[0047] B14)含有B2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；
[0048] B15)含有B3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0049] B16)含有M)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0050] P3)預防動物產氣莢膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重組β2蛋白或所述生物材料。 [0051 ] 上述產品中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA;所述核酸分 子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0052]這里使用的術語"同一性"指與天然核酸序列的序列相似性。同一性可以用肉眼或 計算機軟件進行評價。使用計算機軟件，兩個或多個序列之間的同一性可以用百分比（％ ) 表示，其可以用來評價相關序列之間的同一性。
[0053] 上述產品中，所述重組β2蛋白按照上述任一種方法制備；
[0054]所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因：
[0055] 1)編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子；
[0056] 2)編碼序列是SEQ ID No.l的第151-861位所示的DNA分子；
[0057] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質的DNA分子；
[0058] 所述重組載體為所述pET3Oa-02-Y;
[0059] 所述重組微生物為El)或E2):
[0060] E1)所述重組微生物為將所述重組β2蛋白的編碼基因導入受體微生物，得到表達 所述重組β2蛋白的重組微生物，所述受體微生物為Cl )-C4)中的任一種：
[0061 ] C1)原核微生物；
[0062] C2)革蘭氏陰性細菌；
[0063] C3)埃希氏菌屬細菌；
[0064] C4)大腸桿菌 BL21(DE3);
[0065] 所述重組微生物為所述BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y;
[0066] 所述預防動物產氣莢膜梭菌感染的疫苗的活性成分為所述重組β2蛋白或所述生 物材料。
[0067] 下述任一種應用也屬于本發明的保護范圍：
[0068] Υ1)所述重組β2蛋白在制備抗產氣莢膜梭菌疫苗中的應用；
[0069] Υ2)所述生物材料在制備抗產氣莢膜梭菌疫苗中的應用；
[0070] Υ3)所述方法在制備抗產氣莢膜梭菌疫苗中的應用；
[0071] Υ4)所述重組β2蛋白在制備產氣莢膜梭菌病診斷抗原中的應用；
[0072] Υ5)所述重組β2蛋白在制備單克隆抗體中的應用。
[0073]本發明中，所述產氣莢膜梭菌可為A、B、C、D和Ε這5種型產氣莢膜梭菌中的任5種、 任4種、任3種、任2種或任1種。
[0074]本發明中，所述抗產氣莢膜梭菌疫苗具體可為上述預防動物產氣莢膜梭菌感染的 疫苗。
[0075]在實際應用中，可以將本發明的重組β2蛋白或其相關生物材料作為藥物直接給予 病人、或者與適宜的載體或賦形劑混合后給予病人，以達到治療產氣莢膜梭菌感染的目的。 這里的載體材料包括但不限于水溶性載體材料(如聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、有機酸等）、 難溶性載體材料(如乙基纖維素、膽固醇硬脂酸酯等）、腸溶性載體材料(如醋酸纖維素酞酸 酯和羧甲乙纖維素等）。其中優選的是水溶性載體材料。使用這些材料可以制成多種劑型， 包括但不限于片劑、膠囊、滴丸、氣霧劑、丸劑、粉劑、溶液劑、混懸劑、乳劑、顆粒劑、脂質體、 透皮劑、口含片、栓劑、凍干粉針劑等。可以是普通制劑、緩釋制劑、控釋制劑及各種微粒給 藥系統。為了將單位給藥劑型制成片劑，可以廣泛使用本領域公知的各種載體。關于載體的 例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如淀粉、糊精、硫酸鈣、乳糖、甘露醇、蔗糖、氯化鈉、葡萄糖、 尿素、碳酸鈣、白陶土、微晶纖維素、硅酸鋁等;濕潤劑與粘合劑，如水、甘油、聚乙二醇、乙 醇、丙醇、淀粉漿、糊精、糖漿、蜂蜜、葡萄糖溶液、阿拉伯膠漿、明膠漿、羧甲基纖維素鈉、紫 膠、甲基纖維素、磷酸鉀、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解劑，例如干燥淀粉、海藻酸鹽、瓊脂粉、褐 藻淀粉、碳酸氫鈉與枸櫞酸、碳酸鈣、聚氧乙烯、山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸鈉、甲基 纖維素、乙基纖維素等;崩解抑制劑，例如蔗糖、三硬脂酸甘油酯、可可脂、氫化油等;吸收促 進劑，例如季銨鹽、十二烷基硫酸鈉等；潤滑劑，例如滑石粉、二氧化硅、玉米淀粉、硬脂酸 鹽、硼酸、液體石蠟、聚乙二醇等。還可以將片劑進一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包 衣片、腸溶包衣片，或雙層片和多層片。為了將單位給藥劑型制成丸劑，可以廣泛使用本領 域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如稀釋劑與吸收劑，如葡萄糖、乳糖、淀粉、可可 月旨、氫化植物油、聚乙烯吡咯烷酮、Gelucire、高嶺土、滑石粉等;粘合劑如阿拉伯膠、黃蓍 膠、明膠、乙醇、蜂蜜、液糖、米糊或面糊等；崩解劑，如瓊脂粉、干燥淀粉、海藻酸鹽、十二烷 基磺酸鈉、甲基纖維素、乙基纖維素等。為了將單位給藥劑型制成栓劑，可以廣泛使用本領 域公知的各種載體。關于載體的例子是，例如聚乙二醇、卵磷脂、可可脂、高級醇、高級醇的 酯、明膠、半合成甘油酯等。為了將單位給藥劑型制成注射用制劑，如溶液劑、乳劑、凍干粉 針劑和混懸劑，可以使用本領域常用的所有稀釋劑，例如，水、乙醇、聚乙二醇、1，3_丙二醇、 乙氧基化的異硬脂醇、多氧化的異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯等。另外，為了制備等 滲注射液，可以向注射用制劑中添加適量的氯化鈉、葡萄糖或甘油，此外，還可以添加常規 的助溶劑、緩沖劑、pH調節劑等。此外，如需要，也可以向藥物制劑中添加著色劑、防腐劑、香 料、矯味劑、甜味劑或其它材料。使用上述劑型可以經注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、 肌肉注射和腔內注射等;腔道給藥，如經直腸和陰道;呼吸道給藥，如經鼻腔;粘膜給藥。上 述給藥途徑優選的是注射給藥。
[0076] 本發明將SEQ ID No.l的第151-861位所示的DNA分子插入pET30a( + )的BamHI和 Xhol位點，得到表達SEQ ID No.2的重組蛋白β2-his的重組表達載體pET30a-β2-Y。將重組 表達載體pET30a-i32-Y導入大腸桿菌BL21 (DE3)獲得了可溶性的目的蛋白i32-his。本發明優 化了 f32-hisf32-his的表達條件，進一步提高了 f32-his的表達量，用0.75mM的IPTG在16°C誘 導13-24小時，02-his的含量達到菌體總蛋白的84%，表達的02-his 87%可溶。02-his免疫 動物后可使動物產生較高的血清抗體水平，并且可抵抗產氣莢膜梭菌的攻擊。i32-his在抵 抗A型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護率為90 % (18只存活，2只死亡），PBS對照組小鼠全部 死亡;i32-his在抵抗B型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護率為100%(20只全部存活），？85對 照組小鼠全部死亡;i32-his在抵抗C型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護率為80% (16只存 活，4只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡;i32-his在抵抗D型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護 率為90% (18只存活，2只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡。第三次免疫i32-his后7-14天抗體 效價達到峰值，最高抗體效價達1:128000 42-his可溶性好，純化簡易，可作為診斷抗原、制 備成單克隆抗體或進一步對蛋白功能與構象關系進行研究。
【附圖說明】
[0077]圖1為各菌株表達蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。
[0078] 圖中，Μ為Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD; 1、誘導表達的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導表達的BL21 (DE3)/pET30a-i32-Y全菌蛋 白液體，3、誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-Y全菌蛋白液體，4、誘導表達的BL21(DE3)/ pET30a-f32-Y含蛋白上清液，5、誘導表達的BL21 (DE3) /pET30a-f32-Y含蛋白沉淀，6、未誘導 表達的BL21(DE3)/pET3Oa-02-W全菌蛋白液體，7、誘導表達的BL21(DE3)/pET3Oa-02-W全菌 蛋白液體，8、誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-W含蛋白上清液，9、誘導表達的BL21(DE3)/ pET3Oa-02-W含蛋白沉淀，10、未誘導表達的BL21(DE3)/pET3Oa-pm02-W全菌蛋白液體，11、 誘導表達的BL21 (DE3)/pET3Oa-pm02-W全菌蛋白液體，12、誘導表達的BL21 (DE3)/pET30a-pmf32-W含蛋白上清液，13、誘導表達的BL21 (DE3) /pET30a-pmf32-W含蛋白沉淀。
[0079] 圖 2 為Western-blot 圖譜。
[0080] 圖中，1、誘導表達的受體菌全菌蛋白液體，2、未誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i3 2-Y全菌蛋白液體，3、誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-Y全菌蛋白液體，4、誘導表達的 BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y含蛋白上清液，5、誘導表達的BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y含蛋白沉 淀，6、未誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-f32-W全菌蛋白液體，7、誘導表達的BL21(DE3)/ pET30a-f32-W全菌蛋白液體，8、誘導表達的BL21 (DE3) /pET30a-f32-W含蛋白上清液，9、誘導 表達的 BL21(DE3)/pET3Oa-02-W 含蛋白沉淀，10、未誘導表達的 BL21(DE3)/pET3Oa-pm02-W 全菌蛋白液體，11、誘導表達的BL21 (DE3 )/pET30a-pmi32-W全菌蛋白液體，12、誘導表達的 BL21 (DE3) /pET3Oa-pm02-W 含蛋白上清液，13、誘導表達的BL21 (DE3) /pET3Oa-pm02-W 含蛋 白沉淀。
[0081 ]圖3為重組蛋白02-his的AKTA純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。
[0082]圖4為重組蛋白Κ-his的分子篩純化鑒定。箭頭所指的為純化的目的蛋白峰。
[0083] 圖5為純化的目的蛋白的SDS-PAGE電泳圖譜。箭頭示目的條帶。
[0084] 其中 Μ是Marker，從上到下分別為 180KD、130KD、95KD、72KD、55KD、43KD、34KD、 26KD;1是誘導表達的BL21(DE3)/pET3Oa-pm02-W全菌蛋白液體;2是誘導表達的BL21(DE3)/ pET30a-pmf32-W含蛋白沉淀；3是未誘導表達的BL21 (DE3) /pET30a-f32-Y全菌蛋白液體;4是 誘導表達的BL21(DE3)/pET30a全菌蛋白液體;5是誘導表達的BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y含蛋 白上清液；6是誘導表達的BL21 (DE3 )/pET30a-i32-Y全菌蛋白液體；7是誘導表達的BL21 (DE3)/pET30a-i32_Y含蛋白沉淀；8是鎳柱純化的i32_his蛋白；9是分子篩純化的i32_his蛋 白。
【具體實施方式】
[0085] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為 常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0086] pET30a( + )為 Novagen 公司產品。pET28a( + )為 Novagen 公司產品。
[0087] A型產氣莢膜梭菌強毒株C57_10、B型產氣莢膜梭菌強毒株C58_5、C型產氣莢膜梭 菌強毒株C59-4、D型產氣莢膜梭菌強毒株C60-11均為中國獸醫藥品監察所產品。
[0088] 實施例1、可溶性表達02-hisY
[0089] 1、合成基因
[0090] 本申請設計了3種重組β2基因，分別為SEQ ID No.l所示的02-hisY基因 、SEQ ID No.3所示的β2-hisW基因、SEQIDNo.4所示的pmβ2-hisW基因。
[0091] 02-hisY基因和02-hisW基因均編碼SEQ ID吣.2所示的蛋白質擬-11丨8(^11^2-1118￥ 基因編碼SEQ ID如.5所示的蛋白質?11^2-11丨81。擬-11丨8是將?11^2-11丨81的第52-80位氨基酸 殘基缺失得到的蛋白質。
[0092]用化學合成的方法合成出SEQ ID No.l的第151-861位所示的β2-Υ基因（編碼SEQ ID No.2的第51-286位氨基酸殘基所示的蛋白質），SEQ ID No.3的第151-861位所示的擬-W 基因（編碼SEQ ID No.2的第51-286位氨基酸殘基所示的蛋白質），SEQ ID No.4的第151-948位所示pmf32-W基因（編碼SEQ ID如.5的第51-315位氨基酸殘基所示的蛋白質?1^2-￥)。
[0093] 2、重組表達載體和重組菌的構建
[0094] 以β 2 - Y基因作為模板，利用上游引物F 1 (序列為5 ' -g g a t c c atgaacgaggtgaacaaataccagag-3'）和下游弓丨物 Rl(序列為5'-CTCGAGTTAGTAGCAGTAGCCTTCGCCAA-3 '）進行PCR擴增，在β2_Υ基因的兩端加上BamHI位點（帶 下劃線的序列）和Xhol識別位點（帶下劃線的序列），得到SEQ ID No. 1的第145-867位所示 的β2-Υ基因 PCR產物。
[0095] 以β 2 - W基因作為模板，利用上游引物F 2 (序列為5 ' -g g a t c c CTCGAGTCAGTAGCAGTAGCCTTCGCCAA-3'）進行 PCR 擴增，在 g2~ff 基因的兩端加上 BamHI 和 Xhol 識別位點，得到SEQ ID No. 3的第145-867位所示的02-W基因 PCR產物。
[0096] 以p m β 2 - W基因作為模板，利用上游引物F 3 (序列為5'_ ggatccatgaaaaaactgatcgtcaaatccac-3 '）和下游引物R2進行PCR擴增，在pm02_W基因的兩 端加上BamHI和Xhol識別位點，得到SEQ ID如.4的第145-1353位所示的?11^2-1基因？0?產 物。
[0097] 將上述β2_Υ基因 PCR產物用BamHI和Xho頂每切，回收目的片段(β2_Υ基因）；同時用 BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大片 段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。將其均勾涂布于 含卡那霉素的LB平板上，37°C培養16小時。單菌落振蕩培養過夜，提取質粒用BamHI和Xhol 進行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質粒進行測序，將測序結果表明是用SEQ ID No. 1的第 151-861位所示的β2-Υ基因替換pET30a( + )的BamHI和Xhol識別位點間的片段，保持pET30 (+)的其它序列不變得到的重組表達載體，命名為pET30a-i32-Y。pET30a-i32-Y含有帶Hi s標 簽的β2-hisY基因，β2-hisY基因的核苷酸序列是SEQIDNo.l，編碼SEQIDNo.2所示的蛋 白質K-his。將含有pET3Oa-02-Y的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y。
[0098] 將上述f32_W基因 PCR產物用BamHI和Xho頂每切，回收目的片段(f32_W基因）；同時用 BamHI和Xhol酶切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體大片 段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞。將其均勾涂布于 含卡那霉素的LB平板上，37°C培養16小時。單菌落振蕩培養過夜，提取質粒用BamHI和Xhol 進行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質粒進行測序，將測序結果表明是用SEQ ID No.3的第 151-861位所示的02-W基因替換pET30a( + )的BamHI和Xhol識別位點間的片段，保持pET30 (+)的其它序列不變得到的重組表達載體，命名為pET30a-f32_W。pET30a-f32_W含有Hi s標簽 融合蛋白β2-hisW基因，β2-hisW基因的核苷酸序列是SEQIDNo.3，編碼SEQIDNo.2所示 的蛋白質K-his。將含有pET3Oa-02-W的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/pET3Oa-02-W。
[0099] 將上述pm02-W基因 PCR產物用BamHI和Xhol酶切，回收目的片段(pm02-W基因）；同 時用BamHI和Xho頂每切載體pET30a( + )，回收載體大片段;將回收的目的片段與回收的載體 大片段連接，得到目的質粒。將目的質粒轉化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞。將其均勻涂 布于含卡那霉素的LB平板上，37°C培養16小時。單菌落振蕩培養過夜，提取質粒用BamHI和 Xhol進行雙酶切鑒定，將酶切驗證正確的質粒進行測序，將測序結果表明是用SEQ ID No.4 的第151 -948位所示的pmi32-W基因替換pET30a (+)的BamHI和Xho I識別位點間的片段，保持 pET30( + )的其它序列不變得到的重組表達載體，命名為pETSOa-pm^-WdETSOa-pm^-W含 有帶His標簽的pmβ2-hisW基因，pmβ2-hisW基因的核苷酸序列是SEQIDNo.4，編碼SEQID No.5所示的蛋白質pmβ2-hisW。將含有pET30a-pmβ2-W的重組大腸桿菌命名為BL21(DE3)/ pET3Oa-pm02_W。
[0?00] 3、蛋白表達形式的分析與鑒定
[0101] 將BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y、BL21(DE3)/pET3Oa-02-W、BL21(DE3)/pET3Oa-pm02-W 和大腸桿菌BL21(DE3)(簡稱受體菌)這四個菌株分別單獨接種于含50μg/ml卡那霉素的LB 液體培養基(在LB液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基） 中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至OD600值（以含50μg/ml卡那 霉素的LB液體培養基為空白對照）達到0.6時，取出1 mL菌液作為未誘導表達的菌液（對 照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進行誘導表達。上述四株菌的誘導 表達均是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。
[0102] 取誘導表達的菌液和未誘導表達的菌液用于蛋白表達形式分析。具體步驟為，取 lm L菌液置于1.5m L離心管中，做好標記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清液， 收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌 體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌 蛋白液體于4°C離心機中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液） 和沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液 體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后， 置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析，并 且結合蛋白灰度分析軟件初步分析蛋白含量。將電泳后的凝膠轉印于NC膜，以抗His標簽的 羊抗鼠抗體為結合抗體DAB顯色，進行Western-blot鑒定。將上述全菌蛋白液體和含蛋白上 清液用〇.22μπι濾膜過濾后上樣至預先用溶液1(溶質及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl，溶劑是水，pH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機器上，分別用10個柱體積 的溶液1與10個柱體積的溶液2(溶質及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪唑，溶 劑是水，PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質蛋白，并在AKTA機器上監測蛋白峰。用溶液3(溶質 及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳柱掛在 鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳柱純化 目的蛋白樣品。
[0103] 將鎳柱純化的目的蛋白樣品用GE公司生產的Superdex200凝膠柱通過分子篩進一 步純化。流動相使用溶液1。通過分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗 脫峰，得到分子篩純化的目的蛋白樣品，使用NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)對 得到的分子篩純化的目的蛋白樣品中蛋白（即可溶性目的蛋白）的含量進行定量分析。并用 NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)測定全菌蛋白液體中的蛋白質含量，得到菌體總 蛋白含量。將含蛋白沉淀用尿素溶解后，用NanoDrop2000超微量分光光度計(ND2000)測定 含蛋白沉淀中的蛋白質的含量。
[0104] 結果表明誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-Y的全菌蛋白液體、含蛋白上清液和 含蛋白沉淀中均含有大小為33kD的目的蛋白f32-his，未誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-f32-Y的全菌蛋白液體中不含有大小為33kD的目的蛋白i32-his;誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-β2-Υ的全菌蛋白液體中目的蛋白i32-his占菌體總蛋白（全菌總蛋白）的84 %，誘導表達的 BL21(DE3)/pET30a-i32-Y的含蛋白上清液中的目的蛋白i32-his占誘導表達的BL21(DE3)/ pET30a-i32_Y的全菌蛋白液體中目的蛋白i32_his的87%，該87%的目的蛋白i32_his為可溶 性蛋白；誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-Y的含蛋白沉淀中的目的蛋白i32-his占誘導表 達的BL21 (DE3) /pET30a-i32-Y的全菌蛋白液體中目的蛋白i32-h i s的13 %，該13 %的目的蛋 白i32-his為不溶性包涵體蛋白；說明誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-Y的目的蛋白β2-his占菌體總蛋白的84%，BL21 (DE3)/pET3Oa-02-Y表達的目的蛋白02-his中87 %為可溶性 蛋白，13%的目的蛋白f32-his為不溶性包涵體蛋白。誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-f32-W的 全菌蛋白液體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均含有大小為33kD的目的蛋白i32-his，未誘 導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-W的全菌蛋白液體不含有大小為33kD的目的蛋白i32-his; 誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-W的全菌蛋白液體中目的蛋白i32-his占菌體總蛋白的 84%，誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-W的含蛋白上清液中的目的蛋白i32-his占誘導表 達的BL21 (DE3)/pET30a-i32-W的全菌蛋白液體中目的蛋白i32-his的1.7 %，該1.7 %的目的 蛋白i32-his為可溶性蛋白；誘導表達的BL21 (DE3)/pET30a-i32-W的含蛋白沉淀中的目的蛋 白i32-his占誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-W的全菌蛋白液體中目的蛋白i32-his的 98.3%，該98.3%的目的蛋白f32-his為不溶性包涵體蛋白；說明誘導表達的BL21 (DE3)/ pET3Oa-02-W的目的蛋白02-his占菌體總蛋白的84%，BL21(DE3)/pET3Oa-02-W表達的目的 蛋白i32-his中1.7 %為可溶性蛋白，98.3 %為不溶性包涵體蛋白。未誘導表達的BL21 (DE3)/ pET3Oa-pm02_W的全菌蛋白液體、誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-pmβ2-W的全菌蛋白液體、 含蛋白上清液和含蛋白沉淀中均不含有大小為36kD的目的蛋白pmi32-his;說明BL21(DE3)/ pET30a-pmi32-W沒有表達目的蛋白pmi32-his。誘導表達的大腸桿菌BL21 (DE3)的全菌蛋白液 體不含有大小為33kD的目的蛋白i32-his;說明大腸桿菌BL21(DE3)沒有表達目的蛋白β2-his。菌落形成單位（CFU)數量相同的誘導表達的BL21(DE3)/pET30a-i32-Y和誘導表達的 BL21 (DE3) /pET3Oa-02-W表達的菌體總蛋白質量相同（圖1和圖2)。
[0105] 4、02_his 的純化
[0106] 將BL21(DE3)/pET30a-i32-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體 培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D6QQ值至0D6Q()值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液 體培養基為空白對照)達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進行誘導表達。該 誘導表達是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。
[0107] 取IPTG誘導表達13h后的菌液收集菌體沉淀。加入roS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠， 于4°C離心機中16000rpm/min離心30min，收集上清液(命名為含蛋白上清液），棄沉淀。將含 蛋白上清液用〇.22μπι濾膜過濾后上樣至預先用溶液1(溶質及其濃度如下：20mM Tris、 150mM NaCl，溶劑是水，pH8.0的溶液)平衡好的鎳柱。將鎳柱接入AKTA機器上，分別用10個 柱體積的溶液1與10個柱體積的溶液2(溶質及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、50mM咪 唑，溶劑是水，PH8.0的溶液)清洗鎳柱中的雜質蛋白，并在AKTA機器上監測蛋白峰。用溶液3 (溶質及其濃度如下：20mM Tris、150mM NaCl、300mM咪唑，溶劑是水，pH8.0的溶液)沖洗鎳 柱掛在鎳柱上的目的蛋白，并使用AKTA收集出現目的蛋白峰的洗脫樣品，將該樣品稱為鎳 柱純化的K-his(圖3)。
[0108] 將鎳柱純化的P2_his用GE公司生產的Superdex200凝膠柱通過分子篩進一步純 化。流動相使用溶液1。通過分子篩純化后可以除去樣品中的含有的大量咪唑，收集洗脫峰， 得到分子篩純化的擬-his蛋白（分子篩純化目的蛋白樣品）（圖4)，使用Nan〇Dr〇p2000超微 量分光光度計(ND2000)對得到的蛋白的純度進行定量分析。
[0109] 將純化的i32-his進行質譜分析其氨基酸序列，結果表明i32-hiS的氨基酸序列如 SEQIDNo.2**。
[0110] 將BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y、BL21(DE3)/pET3Oa-pm02-W和BL21(DE3)/pET30a(將 pET30a( + )導入大腸桿菌BL21(DE3)得到的重組菌)這三個菌株分別單獨接種于含50μg/ml 卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml 得到的培養基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至OD600值（以 含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基為空白對照)達到0.6時，取出1 mL菌液作為未誘導表 達的菌液(對照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)進行誘導表達。上述三 株菌的誘導表達均是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。
[0111] 取誘導表達的菌液和未誘導表達的菌液用于蛋白表達形式分析。具體步驟為，取 lm L菌液置于1.5m L離心管中，做好標記，4°C條件下8000rpm/min離心30min，棄掉上清液， 收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌 體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌 蛋白液體于4°C離心機中16000rpm/min離心30min，分別收集上清液(命名為含蛋白上清液） 和沉淀(命名為含蛋白沉淀），向含蛋白沉淀中加入50yL PBS重懸洗滌沉淀。向全菌蛋白液 體、含蛋白上清液和含蛋白沉淀中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后， 置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析。結 果表明BL21(DE3)/pET30a-i32-Y表達的目的蛋白i32-his以可溶性的形式存在于細菌破碎菌 體的上清液中，可溶性蛋白目的條帶表達明顯，上清液中雜質較少。通過對AKTA機器純化洗 脫條件的優化，可以得到純度更好的可溶性目的蛋白條帶。進一步通過分子篩的純化后，可 以除去蛋白樣品中的含有的大量咪唑（圖5)。通過分子篩的純化后的可溶性蛋白可以作為 診斷抗原、制備成單克隆抗體或進一步對蛋白功能與構象關系進行研究。
[0112] 另外，按照上述方法，將pET28a( + )的限制性內切酶Nhel和Notl位點之間的序列替 換為SEQ ID No.l第151-861位所示的β2-Υ基因，保持pET28a( + )的其它序列不變，得到含有 β2-Υ基因的重組表達載體，將該重組表達載體命名為pET28a-f32-Y。將pET28a-f32-Y轉入大 腸桿菌BL21 (DE3)感受態細胞，將得到的重組大腸桿菌命名為BL21 (DE3) /pET28a-f32-Y。將 BL21 (DE3) /pET28a-i32-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體培養基中加 入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型 全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D6Q()值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基為空白對照） 達到0.6時，取出1 mL菌液作為未誘導表達的菌液(對照），其余液體中加入異丙基硫代-β-D_半乳糖苷（IPTG)進行誘導表達。該誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。取誘 導表達的菌液和未誘導表達的菌液按照上述方法進行蛋白表達形式分析。結果表明，未誘 導表達的BL21(DE3)/pET28a-02-Y全菌蛋白液體、誘導表達的BL21(DE3)/pET28a-02-Y全菌 蛋白液體、誘導表達的BL21(DE3)/pET28a-i32-Y含蛋白上清液和誘導表達的BL21(DE3)/ pET28a-i32-Y含蛋白沉淀中均沒有目的蛋白的表達。可見，雖然采用同一種外源目的基因 （β 2-Υ基因），在不同的BL21(DE3)表達載體-pET28a( + )和pET30a( + )中，外源目的基因的表達 情況相差很大，將β2-Υ基因通過pET30a (+)導入大腸桿菌BL21 (DE3)可獲得β2-Υ基因的高效 可溶性表達，將β2-Υ基因通過pET28a (+)導入大腸桿菌BL21 (DE3)中，β2-Υ基因卻沒有表達。
[0113] 實施例2、i32_hi s的動物免疫保護性試驗
[0114] 1、抗產氣莢膜梭菌疫苗的制備
[0115] 將實施例1中分子篩純化的i32_his蛋白用無菌roS溶解，得到i32_his濃度為ΙΟΟΟμ g/mL的擬-hi s溶液，用于免疫。將擬-hi s溶液與弗氏佐劑按1:1等體積混合，乳化制備油乳 劑疫苗，將其命名為首免疫苗。將i32-hiS溶液與不完全弗氏佐劑按1:1等體積混合，乳化制 備油乳劑疫苗，將其命名為二免疫苗。
[0116] 取出從中國獸醫藥品監察所購買到的A型產氣莢膜梭菌強毒株C57-10、B型產氣莢 膜梭菌強毒株C58-5、C型產氣莢膜梭菌強毒株C59-4、D型產氣莢膜梭菌強毒株C60-11。在超 凈工作臺中，用75 %酒精棉球仔細擦拭保存菌種的安瓿瓶外壁，然后用砂輪在安瓶的上三 分之一處做一劃痕，再用干燥的無菌紗布包裹安瓶將其掰開。吸取400yL厭氧肉肝湯液體培 養基反復吹打安瓶中的菌種，使凍干菌種溶解菌懸液。按照1:100的比例將菌懸液接種到含 有牛肉膏的厭氧肉肝湯的試管中，并在試管上層加蓋l-2cm的液體石蠟隔絕空氣。將接好菌 的試管放入厭氧培養箱，置37°C恒溫培養箱中，培養16-24h后，觀察細菌的生長情況。復蘇 后的菌種經過涂片、染色、鏡檢，確認無誤后傳1-2代后使用，并將一部分菌種用30%的甘油 鹽水-80°C冰箱保存。
[0117] 2、B型產氣莢膜梭菌攻毒試驗
[0118] 按照如下方法測試i32-his對B型產氣莢膜梭菌強毒株C58-5的抗性試驗：
[0119]將30只體重在18-22g的雌性昆明小鼠，隨機分成2組(攻毒劑量組20只，并設10只 小鼠的PBS對照組）。攻毒劑量組，首次免疫、第二次免疫與第三次免疫均采用皮下注射的方 法進行免疫，首次免疫用首免疫苗，第二次免疫與第三次免疫用二免疫苗，每次免疫劑量均 為0.2mL/只（i32-his免疫劑量為100yg/只）；PBS對照組中的每只小鼠首次免疫、第二次免疫 與第三次免疫，皮下注射〇.2mL PBS。首次免疫之前，先對小鼠進行一次割尾采血，分離血 清，用作陰性對照血清。首次免疫后，間隔14d進行第二次免疫，二免后14d進行第三次免疫。 第三次免疫兩周后每只攻毒劑量組小鼠和每只PBS對照組小鼠腹腔注射2 X109cfu的B型產 氣莢膜梭菌強毒株C58-5進行攻毒試驗。自一免后開始，每組小鼠每周米血一次，每組米5 只，分離血清，于-80°C冰箱保存，用于檢測抗體。采用間接ELISA檢測免疫動物抗體水平，具 體方法如下：
[0120] 1)包被:將實施例1中分子篩純化的f32-his用0.05mol/L p Η 9.0的碳酸鹽包被緩 沖液進行稀釋，然后按1 〇〇μL7孔逐一加入ELISA板中，將加好的ELISA板置4°C冰箱中過夜； [0121] 2)洗滌:從4°C冰箱中取出ELISA板，棄去板孔內的液體，并在濾紙上拍干，向每孔 加入200yL PBST置于洗板機中進行洗版，重復4次。
[0122] 3)封閉：向ELISA板的每個孔中加入100yL含有5%脫脂乳的PBST溶液，放入37°C溫 箱孵育lh;
[0123] 4)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機中進行洗版，重復4次；
[0124] 5)加待檢血清:將待檢血清按比例用滅菌ros進行稀釋，每孔加100yL，同時設陰性 對照、陽性對照和空白對照孔，放入37°C溫箱孵育lh;
[0125] 6)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機中進行洗版，重復4次；
[0126] 7)酶標二抗結合:將HRP標記的羊抗鼠二抗用含有5 %脫脂乳的PBS封閉緩沖液按 1:20 000-1:40000濃度稀釋后，分別向每孔加入100yL，放入37°C溫箱孵育lh;
[0127] 8)洗滌：向每孔加入200yL PBST置于洗板機中進行洗板，重復4次；
[0128] 9)顯色反應:將新鮮配制的TMB顯色液按lOOyL/孔加入到ELISA板的各個孔中，放 入37°C溫箱避光顯色15min;
[0129] 10)終止反應：向按照50yL/孔加入2mol/L的濃H2S〇4終止液，放入37°C溫箱反應 5min，終止顯色；
[0130] 11)讀數:將終止顯色的ELISA板放酶標儀中檢測0D45Q的值。
[0131] 12)判定檢測結果：用確定好的陰陽性臨界值來判定檢測結果。陽性臨界值=陰性 樣本的0D45Q平均值+3S(S為標準方差）。待檢血清的效價為待檢血清的0D值多陽性臨界值時 所對應的血清稀釋度。
[0132] 3、C型產氣莢膜梭菌攻毒試驗
[0133] 除了將B型產氣莢膜梭菌強毒株C58-5替換為C型產氣莢膜梭菌強毒株C59-4,攻毒 劑量調整為1.5 X 108cfu外，其它操作完全相同。
[0134] 攻毒劑量組和PBS對照組實驗小鼠在三免二周后，分別使用各型產氣莢膜梭菌 1MLD 100的劑量對小鼠進行攻毒，并于一周內觀察和記錄小鼠發病死亡情況。攻毒結果表 明，攻毒劑量組(免疫i32-hiS)對各型產氣莢膜梭菌的攻擊均具有一定的免疫保護效果。β2-his在抵抗Α型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護率為90% (18只存活，2只死亡），roS對照組 小鼠全部死亡;i32-his在抵抗B型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護率為100% (20只全部存 活），PBS對照組小鼠全部死亡;i32-his在抵抗C型產氣莢膜梭菌攻擊時的免疫保護率為80% (16只存活，4只死亡），PBS對照組小鼠全部死亡;i32-his在抵抗D型產氣莢膜梭菌攻擊時的 免疫保護率為90%(18只存活，2只死亡），？85對照組小鼠全部死亡。將純化后的似-1!&作為 診斷抗原包被酶標板檢測檢測小鼠免疫抗原或者攻毒后的血清抗體，發現敗-his作為診斷 抗原建立的檢測方法均具有非常好的靈敏性與特異性。分別檢測各實驗組中小鼠初免后〇-6周的血清中抗體效價水平，結果表明Κ-his融合毒素蛋白免疫組抗體效價有明顯升高，在 二免后抗體效價快速上升，三免后7-14天抗體效價達到峰值，最高抗體效價達1:128000。
[0135] 實施例3、i32_his誘導表達條件的優化
[0136] 1、誘導溫度和時間的優化
[0137] 將BL21(DE3)/pET30a-i32-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體 培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基 為空白對照)達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進行下述6種誘導表 達。第一種誘導表達是用0.75mM的IPTG在37°C誘導1小時。第二種誘導表達是用0.75mM的 IPTG在37°C誘導2小時。第三種誘導表達是用0.75mM的IPTG在37°C誘導4小時。第四種誘導 表達是用〇.75mM的IPTG在37°C誘導5小時。第五種誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘導 13小時。第六種誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘導24小時。
[0138] 取lm L誘導后的重組菌液置于1.5m L離心管中，做好標記，4°C條件下8000rpm/ min離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。向全菌蛋白液體中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer，充 分混勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電 泳分析。結果表明BL21 (DE3) /pET30a-i32-Y在誘導溫度為37 °C，誘導時間在1 _4h的條件下，β 2-his蛋白表達量隨時間延長逐漸上升，5h誘導條件下蛋白表達量有所下降。但是隨著誘導 溫度的降低，i32-hiS表達量也有所增加，當誘導溫度降低至16°C，時間為誘導13h時，i32-his 表達量達到最高，目的蛋白P2-his占全菌總蛋白的84%。繼續培養至24h，i32-his的表達量 略有下降，因此，通過實驗驗證BL21(DE3)/pET30a-f32-Y的最佳誘導溫度為16°C，誘導時間 為13-24h。
[0139] 2、IPTG濃度的優化
[0140] 將BL21(DE3)/pET30a-i32-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體 培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基 為空白對照)達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進行下述6種誘導表 達。第一種誘導表達是用O.lmM的IPTG在16°C誘導13小時。第二種誘導表達是用0.3mM的 IPTG在16°C誘導13小時。第三種誘導表達是用0.5mM的IPTG在16°C誘導13小時。第四種誘導 表達是用〇.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。第五種誘導表達是用ImM的IPTG在16°C誘導13 小時。第六種誘導表達是用0mM的IPTG在16 °C誘導13小時。
[0141] 取lm L誘導后的重組菌液置于1.5m L離心管中，做好標記，4°C條件下8000rpm/ min離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。將全菌蛋白液體于4 °C離心機中16000rpm/min離心30min，收集上 清液(命名為含蛋白上清液），向含蛋白上清液中加入l〇yL 5XSDS-PAGE loading Buffer， 充分混勻后，置沸水浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機瞬離。取6yL用于SDS-PAGE 電泳分析。結果表明擬-his在不同濃度的IPTG誘導下，表達量也有所不同。i32-his表達量與 加入IPTG濃度在0.1-0.75mM之間呈遞增關系。當IPTG誘導濃度為ImM時，蛋白表達量有所減 少，這可能與IPTG本身的毒性有關。因此選擇IPTG濃度0.75mM為最佳誘導濃度。
[0142] 3、誘導時間的優化
[0143] 將BL21(DE3)/pET30a-i32-Y接種于含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基(在LB液體 培養基中加入卡那霉素至卡那霉素的濃度為50μg/ml得到的培養基）中，37°C，采用Thermo MaxQ6000型全溫振蕩器200rpm振蕩培養至0D 6QQ值（以含50μg/ml卡那霉素的LB液體培養基 為空白對照)達到0.6時，加入異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG)分別進行下述2種誘導表 達。第一種誘導表達是用0.75mM的IPTG在16°C誘導13小時。第二種誘導表達是用0.75mM的 IPTG在16°C誘導16小時。
[0144] 取lm L誘導后的重組菌液置于1.5m L離心管中，做好標記，4°C條件下8000rpm/ min離心30min，棄掉上清液，收集菌體沉淀。加入lm L PBS重懸沉淀，8000rpm/min離心 5min，棄掉上清液。向洗滌好的菌體沉淀中加入200yL PBS，高壓破碎菌體，裂解至菌液不再 粘稠，得到全菌蛋白液體。
[0145] 向全菌蛋白液體中加入10yL 5 XSDS-PAGE loading Buffer，充分混勻后，置沸水 浴中煮沸5min，待樣品冷卻后，用掌式離心機瞬離。取6yL用于SDS-PAGE電泳分析。
[0146] 結果表明BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y在誘導溫度為16°C，誘導時間在13h與16h的條 件下，目的蛋白P2-his表達量變化不大，此時表達的蛋白幾乎均為可溶性蛋白，沉淀中的不 溶性包涵體蛋白幾乎沒有表達。當誘導溫度為16°C，誘導時間在13h與16h的條件下表達的 可溶性目的蛋白純度較高，表達量接近。因此，通過實驗驗證，進一步確定了重組菌的最佳 誘導溫度為16°C，誘導時間為13-16h。
【主權項】
1. 制備重組β2蛋白的方法，包括使重組β2蛋白的編碼基因在生物中進行表達得到所述 重組β2蛋白的步驟;所述生物為微生物、植物或非人動物； 所述重組β2蛋白為a)或b)或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質； b) 由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列組成的蛋白質； c) 在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質。2. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于:所述使重組β2蛋白的編碼基因在生物中進 行表達包括將所述重組β2蛋白的編碼基因導入受體微生物，得到表達所述重組β2蛋白的重 組微生物，培養所述重組微生物，表達得到所述重組β2蛋白。3. 根據權利要求2所述的方法，其特征在于:所述受體微生物為Cl )-C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細菌； C3)埃希氏菌屬細菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3)。4. 根據權利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于:所述蛋白質的編碼基因為如下1) 或2)或3)或4)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-861位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述重組β2蛋白。5. 根據權利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于:所述重組微生物為將pET30a-i32-Y導入大腸桿菌BL21(DE3)得到的表達氨基酸序列是SEQ ID No.2的重組β2蛋白的重組微生 物，所述重組微生物命名為BL21(DE3)/pET3Oa-02-Y，所述pET3Oa-02-Y為將載體pET30a( + ) 的BamHI和XhoI位點之間的序列替換為SEQ IDNo. 1第151 -861位所示的DNA片段得到的重組 載體。6. 根據權利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于:所述表達為誘導表達。7. 根據權利要求6所述的方法，其特征在于:所述誘導表達是用0.75mM的IPTG在16 °C誘 導13-16小時或13-24小時或13小時或16小時。8. 下述任一種產品： P1)重組β2蛋白，所述重組β2蛋白為a)或b)或c)或d): a) 由SEQ ID No.2的氨基酸序列組成的蛋白質； b) 由SEQ ID No.2第51-286位所示的氨基酸序列組成的蛋白質； c) 在a)或b)所示的蛋白質的羧基端或/和氨基端融合蛋白標簽得到的融合蛋白； d) 將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/ 或添加得到的可溶性蛋白質； P2)與所述重組β2蛋白相關的生物材料，所述生物材料為下述B1)至B16)中的任一種： Β1)編碼所述重組β2蛋白的核酸分子； Β2)含有Β1)所述核酸分子的表達盒； B3)含有B1)所述核酸分子的重組載體； B4)含有B2)所述表達盒的重組載體； B5)含有B1)所述核酸分子的重組微生物； B6)含有B2)所述表達盒的重組微生物； B7)含有B3)所述重組載體的重組微生物； B8)含有Μ)所述重組載體的重組微生物； Β9)含有Β1)所述核酸分子的轉基因動物細胞系； Β10)含有Β2)所述表達盒的轉基因動物細胞系； Β11)含有Β3)所述重組載體的轉基因動物細胞系； Β12)含有Μ)所述重組載體的轉基因動物細胞系； Β13)含有Β1)所述核酸分子的轉基因植物細胞系； Β14)含有Β2)所述表達盒的轉基因植物細胞系； Β15)含有Β3)所述重組載體的轉基因植物細胞系； Β16)含有M)所述重組載體的轉基因植物細胞系； Ρ3)預防動物產氣莢膜梭菌感染的疫苗，其含有所述重組β2蛋白或所述生物材料。9. 根據權利要求8所述的產品，其特征在于:所述重組β2蛋白按照權利要求1-7中任一 所述的方法制備； 所述核酸分子為如下1)或2)或3)所示的基因： 1) 編碼序列是SEQ ID No.l所示的DNA分子； 2) 編碼序列是SEQ ID No. 1的第151-861位所示的DNA分子； 3) 與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼權利要求1所述蛋白質的DNA 分子； 所述重組載體為權利要求5中所述pET3Oa-02-Y; 所述重組微生物為El)或E2): E1)所述重組微生物為將所述重組β2蛋白的編碼基因導入受體微生物，得到表達所述 重組β2蛋白的重組微生物，所述受體微生物為Cl )-C4)中的任一種： C1)原核微生物； C2)革蘭氏陰性細菌； C3)埃希氏菌屬細菌； C4)大腸桿菌BL21(DE3); 所述重組微生物為將權利要求5中所述BL21 (DE3 )/pET30a-f32-Y; 所述預防動物產氣莢膜梭菌感染的疫苗的活性成分為所述重組β2蛋白或所述生物材 料。10. 下述任一種應用： Υ1)權利要求8或9中所述重組β2蛋白在制備抗產氣莢膜梭菌疫苗中的應用； Υ2)權利要求8或9中所述生物材料在制備抗產氣莢膜梭菌疫苗中的應用； Υ3)權利要求1-7中任一所述的方法在制備抗產氣莢膜梭菌疫苗中的應用； Υ4)權利要求8或9中所述重組β2蛋白在制備產氣莢膜梭菌病診斷抗原中的應用； Υ5)權利要求8或9中所述重組β2蛋白在制備單克隆抗體中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK106008683SQ201610302759
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年5月9日
【發明人】宋曉暉, 孫雨, 翟新驗, 董浩
【申請人】中國動物疫病預防控制中心