一種制備利那洛肽的方法
【專利摘要】本發明屬于生物化學多肽合成技術領域，具體涉及一種利那洛肽的制備方法。主要解決現有合成步驟繁瑣，原料成本高，合成周期長，收率低、雜質多，不適合工業化生產等技術問題。技術方案：一種制備利那洛肽的方法，包括以下步驟：（1）Fmoc?Tyr(tBu)?OH與載體樹脂反應，得到Fmoc?Tyr(tBu)?樹脂；（2）Fmoc?Tyr(tBu)?樹脂與其他帶有Fmoc保護基團的氨基酸逐一用活化劑偶聯，得到利那洛肽線性肽樹脂；（3）利那洛肽樹脂經脫保護、裂解劑裂解、得到利那洛肽線性肽；（4）利那洛肽線性肽中的三個二硫鍵經氨水/DMSO體系環化后，得到利那洛肽粗肽；（5）利那洛肽粗肽在堿性緩沖溶液中純化后，凍干即得到利那洛肽純品。
【專利說明】
一種制備利那洛肽的方法
技術領域
[0001] 本發明屬于生物化學多肽合成技術領域，具體涉及一種利那洛肽的制備方法。
【背景技術】
[0002] 利那洛肽由美國Ironwood公司研發，于2012年12月17日首次獲批在美國上市的用 于治療成人慢性特發性便秘和便秘型腸易激綜合癥（IBS-C)的多肽類藥物，商品名為 LINZESS'本品是鳥苷酸環化酶-C(GCC)激動劑，作用機制可能為利那洛肽與小腸上皮細胞 內的GC-C受體結合，其激活GC-C，導致腸液分泌增加，并加速轉運，而且還降低小腸內痛覺 神經的敏感性。
[0003] 利那洛肽是由14個氨基酸組成的，并且含有3對二硫鍵的多肽，具體結構序列如 下：
近年來，雖然對于利那洛肽的合成報道較多，但由于其結構復雜，尤其是二硫鍵的形成 過程中具有多個反應位點，選擇性差。造成了副反應多、收率低、提純困難等難題，而現有的 報道也是僅僅局限于實驗室小量制備階段。
[0004] Miriam 等人在文章 （Optimized Fmoc Solid-Phase Synthesis of the Cysteine-Rich Peptide Linaclotide，Biopolymers(2011),96(1) ,69-80)中報道三種合 成利那洛肽的方法：（1)采用Trt為Cys的保護基，固相合成利那洛肽線性粗肽，然后再在溶 液中隨機氧化成利那洛肽;（2)采用Trt、Acm為Cys的保護基，用半選擇性氧化的方法合成利 那洛肽；（3)采用Mmt、Acm、Trt或Acm、Trt、pMe0Bz或StBu、Trt、pMeOBz兩兩正交保護Cys，用 完全選擇性的氧化方法合成利那洛肽。第一種方法，雖然步驟簡單易行，但收率和純度都很 低，不適用工業化生產;第二種方法，采用了半選擇性氧化的策略，雖然降低了反應過程中 異構體的生成，但步驟相對繁瑣，收率也沒有較大提高，同樣不適合工業化生產;第三種方 法，采用了完全選擇性的氧化策略，雖然異構體生成進一步降低，但需要使用到多種氨基酸 側鏈脫除試劑和不同的氧化試劑，步驟更加繁瑣，雜質也相應增多，也不適合工藝放大。
[0005] 專利 CN102875655、CN1046231051、CN104628826、CN104844693 介紹 了利用固相合 成的方法逐一偶聯氨基酸序列，然后利用不同氧化體系隨機氧化的方法制得利那洛肽。雖 然這些方法最后都制得了目標物，但最多也就只得到了幾十克級的樣品，遠遠達不到工業 生產要求，同時，這些隨機氧化過程也無法避免二硫鍵的錯配，雜質多，收率低。專利 CN104163853雖然使用了片段偶聯的方法制備來制備利那洛肽線性肽，但同樣也存在上述 缺點。
[0006] 專利CN103626849、CN104974229、CN105017387采用了固相合成逐一偶聯氨基酸序 列，然后分步定向氧化的方法制備利那洛肽，這些方法無一例外都用了不同的保護基保護 Cys，然后用不同的氨基酸側鏈脫除試劑脫保護，分步氧化的方法。這些方法合成步驟繁瑣， 原料成本高，合成周期長，收率低、雜質多，同樣也不適合工業化生產。
【發明內容】
[0007] 本發明目的是提供一種利用自動多肽合成儀快速、簡捷的大量制備利那洛肽的方 法，主要解決現有合成方法存在的合成步驟繁瑣，原料成本高，合成周期長，收率低、雜質 多，不適合工業化生產等技術問題。
[0008] 為實現上述目的，本發明采用如下技術方案:一種制備利那洛肽的方法，包括以下 步驟： (1 )Fmoc_Tyr (tBu) -OH 與載體樹脂反應，得到 Fmoc-Tyr (tBu)-樹脂； (2) Fmoc-Tyr(tBu)_樹脂與其他帶有Fmoc保護基團的氨基酸逐一用活化劑偶聯，得到 利那洛肽線性肽樹脂； (3) 利那洛肽樹脂經脫保護、裂解試劑裂解、得到利那洛肽線性肽； (4) 利那洛肽線性肽中的三個二硫鍵經氨水/DMS0體系環化后，得到利那洛肽粗肽； (5) 利那洛肽粗肽在堿性緩沖溶液中純化后，凍干即得到利那洛肽純品。
[0009] 本發明所述的利那洛肽的制備方法中，步驟1中的載體樹脂為HMP-AM樹脂或Wang 樹脂，優選為HMP-AM樹脂，替代度為0.2~0.6mmol/g。
[0010] 本發明所述的利那洛肽的制備方法中，所采用的帶有保護基團的氨基酸分別為： Fmoc- Tyr (tBu)-〇H、Fmoc_ Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc- Thr (tBu)-〇H、Fmoc_ Ala-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc- Asn (Trt)-OH和Fmoc- Glu (0tBu)-OH〇
[0011] 本發明所述的利那洛肽的制備方法中，步驟2中偶聯所用的活化試劑為：HOBt/ DIC、HOBt/DCC、HBTU/HOBt或TBTU/HOBt混合試劑中的一種。進一步優選為:H0Bt/D IC。
[0012]本發明所述的利那洛肽的制備方法中，步驟3中所用的裂解試劑為三氟乙酸 (TFA)、三異丙基硅烷(TIS)、1，2-乙二硫醇(EDT)和水組成的混合試劑。各組分的比例優選 為TFA:TIS:EDT :H20體積比=(90-96) :(1-4) :(1-4) :(1-4)，進一步的優選為TFA:TIS:EDT: 出0體積比=94:2:2:2。
[0013] 本發明所述的利那洛肽的制備方法中，步驟4中選用的氧化二硫鍵的體系為氨水/ DMS0體系，反應時間為5-24小時，進一步的優選為10-12小時。步驟(4)中所述的氨水/DMS0 體系，其中氨水質量百分濃度為0.5%-10%，DMS0質量百分濃度為1%-5%，進一步的優選為氨 水質量百分濃度1%_5%，DMS0質量百分濃度為2%，氧化體系的pH值為8~11，進一步優選為pH 值為9~11。溶劑優選為30%質量百分濃度的乙腈水溶液。
[0014] 本發明所述的利那洛肽的制備方法中，步驟5選用的提純方法為堿性緩沖液中，用 反相高效液相色譜提純。就是用pH=9~10的0.1%質量百分濃度氨水和乙腈為流動相進行梯 度洗脫。
[0015] 本發明的有益效果是:本發明公開了一種利用自動多肽合成儀大量制備利那洛肽 的工藝方法，本發明的特點在于：1、在合成多肽時，采用了穩定的HMP-AM樹脂，同時序列中 所有的半胱氨酸均采用價格低廉的Fmoc-Cys(Trt)-〇H為原料，降低了成本。2、在氧化形成 三個二硫鍵過程中，采用氨水/DMS0體系，反應溫和，有效地避免了二硫鍵的錯配，收率高， 成功應用于大規模生產。3、最后純化過程中采用堿性緩沖液為洗脫體系，得到了純度較高 的利那洛肽。總收率為:15%~25%，純度穩定在:95%以上。
【附圖說明】
[0016] 圖1為本發明產品色譜圖。
[0017] 圖2為本發明產品質譜圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面通過具體實施例進一步地闡釋本發明，但本發明并不僅限于這些實施例，任 何根據本發明做出的若干推演和替換，都應當視為本發明的權利保護范圍。
[0019] 在本發明的【具體實施方式】中，所有保護氨基酸和樹脂均購自希施生物科技(上海） 有限公司，其他常用試劑均有市售。
[0020] 本發明所用的英文縮寫對應的中文含義，如下表：
實施例1:利那洛肽線性肽保護樹脂的制備 (1)替代度為0.2~0.6 mmol/g HMP-AM樹脂的制備 采用Fmoc保護法制得HMP-AM樹脂445g(200 mmol)，用紫外吸光光度計測其替代度為： 0.45 mmol/g〇
[0021] (2)利那洛肽線性肽樹脂的制備 利用自動多肽合成儀，首先將上步的Fm〇c-Tyr(tBu)-樹脂在20%質量百分濃度的Pip/ DMF溶液中反應20 min，脫去保護基Fmoc，然后用DMF/DCM溶液自動洗2遍，為鏈接下一個氨 基酸做準備。
[0022] 利用多肽合成儀設定好的程序，按照多肽序列逐一偶聯氨基酸。具體反應過程如 下：將Fmoc_AA-〇H(3 eq, 600 mmol)和H0Bt(3 eq, 600 mmol)溶于DMF(2.0 L)中，然后加 入DIC(3 eq，600 mmol)活化氨基酸。將Fmoc-AA-OH/HOBt/DIC混合溶液和上步的氨基酸樹 脂轉移到反應瓶中偶聯，反應3-6小時(反應時間根據茚三酮檢測法適當延長或縮短）后，排 除溶劑，固體樹脂用DMF溶液洗三遍，然后用20%質量百分濃度Pip/DMF脫除保護基Fmoc。然 后不斷重復以上步驟，鏈接下一個氨基酸，直至完成整個氨基酸序列，得到利那洛肽線性肽 樹脂1088 g。
[0023]實施例2:利那洛肽線性肽的制備 氮氣保護下，利那洛肽線性肽樹脂在TFA/TIS/EDT/water體積比（94: 2:2:2)溶液中裂 解。具體操作如下:將上步的利那洛肽樹脂與TFA/TIS/EDT/water溶液混合(5-10 mL/g)，反 應4小時后，過濾除去裂解下來的樹脂，然后用TFA溶液洗2遍。合并濾液，用旋轉蒸發儀蒸去 濾液，然后加入冷的乙醚(5-10 mL/g)，固體析出，過濾并用冷乙醚洗3遍，得到利那洛肽線 性肽，白色固體251.97 g，純度:62%，收率:50.9%。
[0024]實施例3:利那洛肽粗肽的制備 將利那洛肽線性肽(60.0 g)溶于1%質量百分濃度的氨水和30%質量百分濃度乙腈的混 合水溶液（25 L)中，然后加入2%質量百分濃度的DMS0溶液，反應過程中用氨水調節pH 9-10,室溫攪拌24小時，LC-MS監測反應進程。重復以上實驗進程，將所有的利那洛肽線性肽氧 化成利那洛肽。得到利那洛肽252 .0 g，純度:50.1%，收率:41.1%。
[0025] 注:LC-MS的監測和分析條件如下 色譜條件:Agilent 1290;C18 色譜柱（1·7μηι，150x3mm);檢測波長:λ=214ηηι 流動相A: 0.1%質量百分濃度的TFA水溶液； 流動相B: 0.1%質量百分濃度的TFA色譜乙腈溶液； 梯度洗脫:流動相A:流動相B質量百分濃度=0-60%，流速:0.4 mL/min，柱溫:60 °C。 [0026]實施例4:利那洛肽精肽的制備 利那洛肽粗肽經堿性緩沖液純化，轉鹽，凍干得到利那洛肽精肽。純化條件如下:C-18 色譜柱，檢測波長:214 nm。流動相A: 0.1%質量百分濃度氨水(pH 9-10)，流動相B: ACN，梯度 洗脫:首先以5%質量百分濃度的流動相B洗脫30 min，然后在60 min內逐步增加到10~35 % 質量百分濃度的流動相B，流速為25 mL/min。收集目標峰組分，冷凍干燥，得到的多肽固體 再溶解于水和乙腈的溶液中，再次凍干除去殘留的氨水，得到的多肽純品溶于0.5 %質量百 分濃度乙酸的水和乙腈(體積比=80/20)的混合溶液中轉鹽，再次凍干得到利那洛肽純品， HPLC 純度：96.5%，總收率：20.9%。見圖 1、2。
[0027] 實施例5:利那洛肽線性肽保護樹脂的制備 (1)替代度為0.49 mmol/g HMP-AM樹脂的制備 采用Fmoc保護法制得HMP-AM樹脂2500 g(l .225 mol)，用紫外吸光光度計測其替代度 為：0.49 mmol/g〇
[0028] (2)利那洛肽線性肽樹脂的制備 利用自動多肽合成儀，首先將上步的Fm〇c-Tyr(tBu)-樹脂在20%質量百分濃度的Pip/ DMF溶液中反應20 min，脫去保護基Fmoc，然后用DMF/DCM溶液自動洗2遍，為鏈接下一個氨 基酸做準備。
[0029] 利用多肽合成儀設定好的程序，按照多肽序列逐一偶聯氨基酸。具體反應過程如 下：將Fmoc-AA_0H(3 eq, 3.675 mol)和H0Bt(3 eq, 3.675 mol)溶于DMF(20 L)中，然后加 入DIC(3 eq，3.675 mol)活化氨基酸。將Fmoc-AA-OH/H0Bt/DIC混合溶液和上步的氨基酸 樹脂轉移到反應瓶中偶聯，反應3-6小時(反應時間根據茚三酮檢測法適當延長或縮短)后， 排除溶劑，固體樹脂用DMF溶液洗三遍，然后用20%質量百分濃度Pip/DMF脫除保護基Fmoc。 然后不斷重復以上步驟，鏈接下一個氨基酸，直至完成整個氨基酸序列，得到利那洛肽線性 肽樹脂6.06 kg。
[0030] 實施例6:利那洛肽線性肽的制備 氮氣保護下，利那洛肽線性肽樹脂在TFA/TIS/EDT/water體積比（94: 2:2:2)溶液中裂 解。具體操作如下:將上步的利那洛肽樹脂與TFA/TIS/EDT/water溶液混合(5-10 mL/g)，反 應4小時后，過濾除去裂解下來的樹脂，然后用TFA溶液洗2遍。合并濾液，用旋轉蒸發儀蒸去 濾液，然后加入冷的乙醚(5-10 mL/g)，固體析出，過濾并用冷乙醚洗3遍，得到利那洛肽線 性肽，白色固體3.56 kg，純度:46.2%，收率:38.9%。
[0031] 實施例7:利那洛肽粗肽的制備 將利那洛肽線性肽(60 g)溶于1%質量百分濃度的氨水和30%質量百分濃度乙腈的混合 水溶液（100 L)中，然后加入2%質量百分濃度的DMS0溶液，反應過程中用氨水調節pH 9-10， 室溫攪拌24小時，LC-MS監測反應進程。重復以上實驗進程，將所有的利那洛肽線性肽氧化 成利那洛肽。得到利那洛肽1.58 kg，純度:59.9%，收率:50.4%。
[0032] 注:LC-MS的監測和分析條件如下 色譜條件:Agilent 1290;C18 色譜柱（1·7μηι，150x3mm);檢測波長:λ=214ηηι 流動相A: 0.1%質量百分濃度的TFA水溶液； 流動相B: 0.1%質量百分濃度的TFA色譜乙腈溶液； 梯度洗脫:流動相A:流動相B質量百分濃度=0-60%，流速:0.4 mL/min，柱溫:60 °C。 [0033]實施例8:利那洛肽精肽的制備 利那洛肽粗肽經堿性緩沖液純化，轉鹽，凍干得到利那洛肽精肽。純化條件如下:C-18 色譜柱，檢測波長:214 nm。流動相A: 0.1%質量百分濃度氨水(pH 9-10)，流動相B: ACN，梯度 洗脫:首先以5%質量百分濃度的流動相B洗脫30 min，然后在60 min內逐步增加到10~35 % 質量百分濃度的流動相B，流速為25 mL/min。收集目標峰組分，冷凍干燥，得到的多肽固體 再溶解于水和乙腈的溶液中，再次凍干除去殘留的氨水，得到的多肽純品溶于0.5 %質量百 分濃度乙酸的水和乙腈(體積比=80/20)的混合溶液中轉鹽，再次凍干得到利那洛肽純品， HPLC 純度:98 · 44%，總收率：19 · 6%。見圖 1、2。
【主權項】
1. 一種制備利那洛肽的方法，其特征是包括以下步驟： (1 )Fmoc_Tyr (tBu) -OH 與載體樹脂反應，得到 Fmoc-Tyr (tBu)-樹脂； (2) Fmoc-Tyr(tBu)_樹脂與其他帶有Fmoc保護基團的氨基酸逐一用活化劑偶聯，得到 利那洛肽線性肽樹脂； (3) 利那洛肽樹脂經脫保護、裂解劑裂解、得到利那洛肽線性肽； (4) 利那洛肽線性肽中的三個二硫鍵經氨水/DMS0體系環化后，得到利那洛肽粗肽； (5) 利那洛肽粗肽在堿性緩沖溶液中純化后，凍干即得到利那洛肽純品。2. 根據權利要求1所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:步驟（1)中載體樹脂為 Wang樹脂或HMP-AM樹脂，替代度為0.2~0· 6mmo Ι/g。3. 根據權利要求2所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:步驟（1)中載體樹脂為 HMP-AM 樹脂。4. 根據權利要求1所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:步驟(2)中帶有Fmoc保 護基團的氨基酸分別為:Fmoc- Tyr (tBu)-〇H、Fmoc_ Cys (Trt)-〇H、Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Thr (tBu)-〇H、Fmoc-Ala-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc- Asn (Trt)-OH和Fmoc- Glu (OtBu)-OH， 其中6個Cys的側鏈全部采用Trt保護。5. 根據權利要求1所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:步驟(2)中活化試劑為： HOBt/D IC、HOBt/DCC、HBTU/HOBt或TBTU/HOBt混合試劑中的一種。6. 根據權利要求5所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是：活化劑為:HOBt/DIC混 合試劑。7. 根據權利要求1所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:步驟(3)中所用的裂解 試劑為三氟乙酸、三異丙基硅烷、1，2_乙二硫醇和水組成的混合試劑，各組分的體積比為 TFA:TIS:EDT: H20=90-96:1-4:1-4:1-4。8. 根據權利要求7所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:混合試劑各組分的體積 比為 TFA:TIS:EDT:H20=94:2:2:2。9. 根據權利要求1所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:步驟(4)中所述的氨水/ DMS0體系，其中氨水質量百分濃度為0.5%-10%，DMS0質量百分濃度為1%-5%，氨水/DMS0體系 的pH值為8~11，溶劑為30%質量百分濃度的乙腈水溶液。10. 根據權利要求9所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是：所述的氨水/DMS0體 系，其中氨水質量百分濃度為1%_5%，DMS0質量百分濃度為2%，氨水/DMS0體系的pH值為9~ 11〇11. 根據權利要求1所述的一種制備利那洛肽的方法，其特征是:步驟(5)中所述的純化 方法為堿性緩沖溶液為洗脫相的反相高效液相柱色譜純化，就是用pH=9~10的0.1%質量百 分濃度氨水和乙腈為流動相進行梯度洗脫。
【文檔編號】C07K1/06GK106008674SQ201610644791
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年8月24日
【發明人】張恒維, 王為, 施學庚, 楊培, 朱國基, 張倩, 巢慶, 喬立超, 田曉博
【申請人】希施生物科技（上海）有限公司