具有抗氧化功能的四肽及其制備方法
【專利摘要】一種具有抗氧化肽功能的四肽(ADGF、AGGF、ETTL和SGAF)及其制備方法，屬于抗氧化肽技術領域。本發明以長白山榛仁為原料，采用酶控制水解技術制備抗氧化肽并通過凝膠過濾層析Sephadex G?25，Sephadex G?15和反相高效液相層析等技術分離純化，經此方法得到的多肽活性及純度較高，雜質較少。對DPPH、羥基自由基、ABTS存在顯著的清除作用，對Fe2+具有較好的螯合效果，具備較強的抗氧化活性，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有極大的研究價值和廣闊的市場前景。
【專利說明】
具有抗氧化功能的四肽及其制備方法
技術領域
[0001] 本發明屬于抗氧化肽技術領域，具體涉及一種具有抗氧化功能的四肽及其制備方 法。
【背景技術】
[0002] 眾多研究表明，機體氧化應激損傷能夠引起代謝失調，從而加速衰老，引發老年癡 呆、腫瘤及動脈粥樣硬化等疾病。而通過外界抗氧化物質的攝入能夠在一定程度上清除體 內自由基，起到延緩衰老，預防各種疾病的作用。如今大多數抗氧化劑都是人工合成的，與 其相比，從天然植物中制備抗氧化劑有著易于吸收，安全無副作用的優點。同時，我國擁有 極豐富的動植物蛋白資源，利用這一優勢，開發天然抗氧化肽具有重要的意義。
[0003] 吉林省長白山地區盛產榛子，雖然歷史悠久，但開發利用方面仍處于比較初級的 階段，加工僅限于制作糕點、飼料以及榨油等。以長白山榛仁為原料制備抗氧化肽，將對長 白山榛子資源的充分利用和榛仁多肽功能性產品的開發提供參考。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的之一是提供一種具有抗氧化功能的四肽及其制備方法，以長白山榛 仁為原料，采用酶控制水解技術制備抗氧化肽并通過凝膠過濾層析Sephadex G-25， Sephadex G-15和反相高效液相層析等技術分離純化，經此方法得到的多肽活性及純度較 高，雜質較少。
[0005] 本發明的目的之二是對榛仁抗氧化肽進行結構鑒定，采用高效液相色譜-電噴霧 飛行時間串聯質譜(HPLC-ESI-TOF MS/MS)技術并經從頭測序(de novo)方法進行質譜解 析，鑒定出四種新的抗氧化肽ADGF、AGGF、ETTL和SGAF。
[0006] 具有抗氧化功能的四肽及其制備方法，所述抗氧化肽包括四條肽（同時含有四條 肽，比例無要求），分別為 ADGF(Ala-Asp-Gly-Phe)，AGGF(Ala-Gly-Gly-Phe)，ETTL(Glu-Thr-Thr-Leu)以及SGAF(Ser-Gly-Ala-Phe)，其制備步驟如下：
[0007] (1)榛仁抗氧化肽的制備
[0008] 將2~5g榛仁分離蛋白粉（堿溶酸沉法制備，Functional Properties of the Protein Isolate and Major Fractions of Pine Nut Proteins Prepared from the Changbai Mountain in China，Dan Wu，Wei_hong Min)溶于lOOmL蒸饋水配制成質量分數 2 %~5 %的溶液，90~100 °C水浴10~20min使蛋白變性，冷卻后調節pH至7~10，加入 Alcalase 2.4L，維持pH值恒定;酶解結束后，溶液在90~100°C下滅酶10~20min，冷卻至室 溫，加入HCL調節pH至7 · 0，5000~8000rpm離心10~20min，取上清液，將其冷凍干燥后得到 粗榛仁抗氧化肽；
[0009] (2)榛仁抗氧化肽的分離純化
[0010] 將粗榛仁抗氧化肽加入蒸餾水配成溶液，并過0.22μηι的濾膜;然后通過Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱（1.6cm X 80cm)層析分離，用紫外檢測儀在280nm波長下檢測，并用自動 部分收集器進行收集組分（1.5mL/管），將分離得到的3種組分收集，冷凍干燥，測定抗氧化 活性;將活性最強組分進行Sephadex G-15層析分離，紫外檢測儀在280nm波長下檢測，并用 自動部分收集器收集(1.5mL/管），將分離得到的2種組分收集，冷凍干燥，測定抗氧化活性； 將活性最高組分進行反相高效液相層析分離，將得到的5種組分收集，冷凍干燥，測定抗氧 化活性，活性最高的組分即本發明所述的具有抗氧化肽功能的四肽，同時含有四條肽，分別 為ADGF(Ala-Asp-Gly-Phe)，AGGF(Ala-Gly-Gly-Phe)，ETTL(Glu-Thr-Thr-Leu)和SGAF (Ser-Gly-Ala-Phe)〇
[0011] (3)榛仁抗氧化肽的結構鑒定
[0012]采用ESI-TOF MS/MS鑒定ACE抑制肽的氨基酸序列，運用de novo方法進行質譜數 據解析。結構鑒定結果即為本發明所述的具有抗氧化功能的四肽ADGF，AGGF，ETTL以及 SGAF〇
[0013] 步驟（1)中，利用〇 · 6mol/L NaOH調節pH值至7~10以及維持pH值恒定，酶解溫度為 40~70°C、酶解時間為3~7h，加酶量5000~10000U/g榛仁分離蛋白粉。
[0014] 步驟(2)中所述的Sephadex G-25凝膠層析和Sephadex G-15凝膠層析，上樣濃度 10~50mg/mL，上樣體積1~5mL，洗脫流速0.1~3mL/min，洗脫液為純水。
[0015] 步驟（2)中所述的反相高效液相層析采用C18色譜柱，流動相A為含有質量分數 0.1 % TFA的雙蒸水，B為含有質量分數0.1 % TFA的乙腈，上樣濃度0.1~5mg/mL，上樣體積10 ~80yL，100 ~60%B 線性洗脫 30 ~60min;流速0.1 ~lmL/min。
[0016] 本發明相比現有技術的有益效果為：
[0017] 本發明首次公開了具有抗氧化功能的四肽及其制備方法，采用堿性蛋白酶 Alcalase 2.4L酶解榛仁分離蛋白進行制備并純化鑒定出四種未報道的抗氧化肽，對DPPH、 羥基自由基、ABTS存在顯著的清除作用，對Fe 2+具有較好的螯合效果，具備較強的抗氧化活 性，是一種良好的天然抗氧化劑，擁有極大的研究價值和廣闊的市場前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為榛仁抗氧化肽對ABTS自由基的清除作用曲線圖；由圖1可知，榛仁抗氧化肽 濃度達到3mg/mL時，對ABTS自由基的清除率就已經達到96.43%，而Vc在0.5mg/mL時就已經 達到100 %。在試驗濃度范圍內，抗氧化肽對ABTS自由基清除率在3mg/mL以后保持在98 %~ 100%，此時抗氧化肽和Vc對ABTS自由基的清除率基本相同，即抗氧化肽對ABTS自由基的清 除率為Vc的100%。說明抗氧化肽對ABTS自由基有較強的清除作用，具有較強的抗氧化活 性。
[0019]圖2為榛仁抗氧化肽對DPPH自由基的清除作用曲線圖；如圖2所示，當Vc濃度為 0. lmg/mL時，清除率就達到91.22%。榛仁抗氧化肽對DPPH自由基的清除率隨濃度的增大而 升高，并在2mg/mL后逐漸穩定，8mg/mL時達到100%。
[0020] 圖3為榛仁抗氧化肽對羥基自由基的清除作用曲線圖；Vc作為一種良好的抗氧化 劑，在0.5mg/mL時清除率就能達到100%。榛仁抗氧化肽對羥基自由基的清除作用隨濃度的 增加而顯著提高，當濃度為8mg/mL時，清除率達到85 %以上，并在24mg/mL時達到100 %。
[0021] 圖4為榛仁抗氧化肽的還原能力作用曲線圖；有還原能力的樣品能使鐵氰化鉀中 的Fe3+還原成Fe2+(亞鐵氰化鉀），產物與FeCl 3進一步反應生成在700nm處有最大吸光峰的普 魯士藍(Fe4[Fe(CN)6]3)，因此測定700nm處吸光值的高低可以反映樣品還原能力的大小，吸 光值越大，則還原能力越強。試驗結果如3.15圖所示，隨著濃度的升高，榛子抗氧化肽的還 原能力逐漸增強，10mg/mL時，A700值為1.055，能夠達到同濃度下EDTA的38.55%。
[0022]圖5為榛仁抗氧化肽對亞鐵離子的螯合作用曲線圖；0.5mg/mL EDTA能使Fe2+螯合 率達到100 %，而濃度為10mg/mL時抗氧化肽的螯合率為90.25 %，12mg/mL時達到99.30 %。 可見榛子抗氧化肽對Fe2+有較好的螯合能力。
[0023]圖6為實施例Sephadex G-25葡聚糖凝膠層析圖譜;通過Sephadex G-25凝膠色譜 將榛子抗氧化肽分離成A1，A2，A3三個組分。根據凝膠層析原理，組分A1應該為水解未徹底 的蛋白，分子量大于5000Da，而A2、A3為水解得到的多肽，分子量在5000Da以下。
[0024]圖7為實施例Sephadex G-15葡聚糖凝膠層析圖譜；Sephadex G-15葡聚糖凝膠適 用的分子量范圍是1〇〇~1500,可以用于緩沖液的交換、脫鹽和分離分子量接近的小分子。 如圖7所示，組分A3經過G-15分離純化得到B1、B2兩種組分。
[0025] 圖8為實施例反相高效液相色譜分離圖譜;0~lOmin出現的峰是溶劑峰，通常情況 下，溶劑會有一定的紫外吸收，形成溶劑峰，一般情況下都會在10分鐘之前出現，并不影響 純化效果。圖譜出峰主要集中在18~40min區間內，分離主要得到5種組分:C1、C2、C3、C4、 C5〇
[0026] 圖9為四種抗氧化肽質譜圖。
【具體實施方式】
[0027] 以下結合實施例來進一步解釋本發明，但實施例并不對本發明作任何限定。（1)榛 仁抗氧化肽的制備
[0028]將5g榛仁分離蛋白粉與100mL蒸餾水配制成質量分數5%的溶液，90°C下水浴 15min，從而破壞其蛋白結構。冷卻后利用0.6mol/L NaOH調pH值達到9.5，加入Alcalase 2.4L(丹麥諾維信水解酶），添加量8000U/g分離蛋白粉，保持溫度50°C并通過電位滴定儀加 入0.6mol/L NaOH維持恒定的pH值，酶解5h后溶液在95 °C下滅酶15min，冷卻至室溫，加入 HCL調節pH至7.0，5000r/min離心10min，取上清液，將其冷凍干燥后得到粗榛子抗氧化肽。 [0029] (2)榛仁抗氧化肽的分離純化
[0030]制備的粗榛仁抗氧化肽，加入蒸餾水配成30mg/mL的溶液，并過0.22μπι的濾膜。通 過Sephadex G-25葡聚糖凝膠柱（1.6cm X 80cm)進行分離，上樣量2mL，洗脫液為蒸餾水，洗 脫流速0.5mL/min，用紫外檢測儀在280nm波長下檢測，并用自動部分收集器進行收集 (1.5!1117管）。分離得到4142 43三個組分，分別冷凍干燥，測定抗氧化活性(結果見表1)，組 分A3具有最強的ABTS自由基清除能力和DPPH自由基清除能力以及還原能力；而組分A2的還 原力和ABTS自由基以及DPPH自由基的清除能力均不強;A1組分總還原能力及DPPH自由基清 除能力最弱均低于未經純化的樣品。綜上，選擇組分A3進行下一步分離純化。
[0031 ] 將組分A3，加入蒸餾水配成30mg/mL的溶液，并過0.22μηι的濾膜。用Sephadex G-15 葡聚糖凝膠柱（1.6cm X 80cm)進行分離，上樣量2mL，洗脫液為蒸餾水，洗脫流速0.5mL/min， 用紫外檢測儀在280nm波長下檢測，并用自動部分收集器進行收集組分(1.5mL/管）。分離得 至|JB1、B2兩種組分，冷凍干燥，測定抗氧化活性(結果見表2)，組分B2的抗氧化活性強于B1， 所以收集組分B2,利用高效液相色譜進一步分離純化。
[0032] 采用高效液相色譜法，對組分B2進行分離純化。配成lmg/mL的溶液，并過0.22μπι的 濾膜。色譜條件:儀器：日本島津液相色譜儀;色譜柱:Diamonsi 1 C18(250*4.6，5μπι);流動 相(Α:雙蒸水+質量分數0.1%三氟乙酸;8:乙腈+質量分數0.1%三氟乙酸），上樣量2(^1^，洗 脫流速0.5mL/min，檢測波長220nm，柱溫30 °C。95~70 % B線性洗脫。分離得到5種組分:C1、 C2、C3、C4、C5,由于反相高效液相色譜分離得到的樣品量較少，所以選用酶標儀測定羥基自 由基、ABTS、還原力三個指標，濃度均為0.5mg/mL。結果如表3所示，與其他4種組分相比，C2 具有最強的還原力和ABTS自由基清除能力，以及較強的DPPH自由基清除能力，所以C2的抗 氧化活性最強，C4次之，其他組分活性較弱。因此我們選擇對C2組分進行收集和結構鑒定。 [0033] (3)榛仁抗氧化肽的結構鑒定
[0034] 采用Agilent 1200型快速分離液相色譜系統和Agilent 6520Q-T0F質譜儀。液相 條件:色譜柱:Agilent Eclipse Plus C18(2. IX 150mm，3.5ym);二元線性梯度洗脫:流動 相：（A)0.1 %甲酸水溶液；（B)乙腈；流動相梯度：0~30min，5 %-30 ;柱溫35°C，流速 0 · 4mL/min，進樣量 5yL〇
[0035] 質譜條件:采用電噴霧正離子掃描模式(ESI + );質量掃描范圍m/z 100~2000;干 燥氣流速(N2)為9L/min，干燥器溫度300°C，霧化電壓35psig，毛細管電壓為3.5kV，碎裂電 壓175V，錐孔電壓65V，八級桿射頻電壓250V，二級質譜碰撞電壓12-15eV。
[0036] 肽段序列解析運用Peaks 7.5軟件（Bioinformatics Solutions Inc)。所鑒定出 榛仁抗氧化肽的結構分別是ADGF，AGGF，ETTL以及SGAF，它們的分子量分別是408.16Da、 350.160&、462.230&及380.170&。
[0037] 以上所述僅是本發明的優先實施方式，應當指出，在不脫離本發明原理的前提下， 四種抗氧化肽的氨基酸序列其他排列組合方式及對多肽做出的若干改進和修飾，也應視為 本發明的保護范圍。
[0038]表1 :G_25分離得到的各組分抗氧化指標比活
[0039]
[0040] 表2 :G-15分離得到的各組分抗氧化指標比活
[0041]
[0042] 表3:反相高效液相分離得到的各組分抗氧化指標比活
[0043]
【主權項】
1. 一種具有抗氧化功能的四肽，其特征在于：同時包括ADGF(Ala-Asp-Gly-Phe)、AGGF (Ala-Gly-Gly-Phe)、ETTL(Glu-Thr-Thr-Leu)和 SGAF(Ser-Gly-Ala-Phe)四種四肽。2. 權利要求1所述的一種具有抗氧化功能的四肽的制備方法，其步驟如下： (1) 榛仁抗氧化肽的制備 將2~5g榛仁分離蛋白粉溶于lOOmL蒸餾水配制成質量分數2%~5%的溶液，90~100 °C水浴10~20min使蛋白變性，冷卻后調節pH至7~10,加入Alcalase 2.4L，維持pH值恒定； 酶解結束后，溶液在90~100 °C下滅酶10~20min，冷卻至室溫，調節pH至7.0,5000~ 8000rpm離心10~20min，上清液冷凍干燥后得到粗榛仁抗氧化肽； (2) 榛仁抗氧化肽的分離純化 將粗榛仁抗氧化肽加入蒸餾水配成溶液，并過〇. 22μηι的濾膜;然后通過Sephadex G-25 葡聚糖凝膠柱層析分離，將分離得到的組分收集，冷凍干燥，測定抗氧化活性;將活性最強 組分進行Sephadex G-15層析分離，將分離得到的組分收集，冷凍干燥，測定抗氧化活性;將 活性最高組分進行反相高效液相層析分離，將分離得到的組分收集，冷凍干燥，測定抗氧化 活性；活性最高的組分即具有抗氧化肽功能的四肽，其同時含有四條四肽，分別為ADGF (Ala-Asp-Gly-Phe)、AGGF(Ala-Gly-Gly-Phe)、ETTL(Glu-Thr-Thr-Leu)和SGAF(Ser-Gly-Ala-Phe)〇3. 如權利要求2所述的一種具有抗氧化功能的四肽的制備方法，其特征在于:步驟（1) 中，是利用〇.6mol/L NaOH調節pH值至7~10和維持pH值恒定。4. 如權利要求2所述的一種具有抗氧化功能的四肽的制備方法，其特征在于:酶解溫度 為40~70°C、酶解時間為3~7h，加酶量5000~10000U/g榛仁分離蛋白。5. 如權利要求2所述的一種具有抗氧化功能的四肽的制備方法，其特征在于:步驟(2) 中所述的Sephadex G-25凝膠層析和Sephadex G-15凝膠層析，上樣濃度10~50mg/mL，上樣 體積1~5mL，洗脫流速0.1~3mL/min，洗脫液為純水。6. 如權利要求2所述的一種具有抗氧化功能的四肽的制備方法，其特征在于:步驟(2) 中所述的反相高效液相層析采用C18色譜柱，流動相A為含有質量分數0.1%TFA的雙蒸水，B 為含有質量分數〇.l%TFA的乙腈，上樣濃度0.1~5mg/mL，上樣體積10~80yL，100~60%B 線性洗脫30~60min;流速0.1~lmL/min。
【文檔編號】C07K1/20GK106008666SQ201610517710
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月4日
【發明人】方麗, 閔偉紅, 劉春雷, 李鴻梅, 王輯
【申請人】吉林農業大學