一種谷胱甘肽的高效分離純化方法
【專利摘要】本發明提供了一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，主要包括以下步驟：制備GSCu沉淀并稀釋，加入硫化物生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，離心，壓濾或微濾，樹脂純化，減壓濃縮，結晶，真空干燥。該谷胱甘肽的高效分離純化方法將銅鹽沉淀法與樹脂純化法有效地結合，最大限度地降低谷胱甘肽在提取過程的損失和變性，盡可能地排除雜質的干擾；操作簡單，易于控制，處理周期短，能耗低，特別適合用于工業化生產。因此，本發明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法具有良好的應用前景與市場潛力。
【專利說明】
一種谷胱甘肽的高效分離純化方法
技術領域
[0001]本發明屬于生物化工領域，具體涉及一種谷胱甘肽的高效分離純化方法。
【背景技術】
[0002]谷胱甘肽(Glutath1ne，GSH)，全稱γ_L_谷氨酸_L_半胱氨酰甘氨酸，是由L-谷氨酸、L-半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的含巰基的生物活性三肽化合物，是生物體內重要的非蛋白巰基化合物之一。
[0003]谷胱甘肽普遍存在于動植物細胞和微生物中，尤其在酵母、小麥胚芽以及人和動物肝臟、腎、紅細胞和眼睛晶狀體中含量較為豐富。它主要以還原型(GSH)和氧化型(GSSH)兩種形態存在，其中在機體中大量存在并起主要作用的是還原型谷胱甘肽，本發明中提及的谷胱甘肽均是指還原型的谷胱甘肽。谷胱甘肽具有多種生理功能，尤以抗氧化和整合解毒作用最為突出，同時谷胱甘肽在細胞增殖、凋亡、成纖維過程中也扮演著重要角色。隨著研究的不斷深入，谷胱甘肽在臨床醫學、保健品、食品添加劑以及動物飼料等方面的應用正引起廣泛的關注，市場前景需求量正日益加大。
[0004]然而，國內生產谷胱甘肽的工藝還不夠成熟，其發展瓶頸主要在于發酵水平低下，后續提純工藝收率低，因而所得產品純度低、質量差、成本高。解決上述問題對實現我國GSH大規模產業化，改變GSH原料依賴進口的尷尬局面并推動我國醫學工業、保健行業和食品工業的發展有著十分重要的意義，同時具有良好的經濟效益和社會效益。
[0005]隨著發酵工藝條件的優化及其菌種選育的多種方法的發展，發酵法已經成為國內外生產谷胱甘肽最普遍的方法，然而未能有效實現低成本、高收率、高純度地從發酵液獲得谷胱甘肽一直是谷胱甘肽產業化的障礙，也日益成為研究的熱點之一。
[0006]現有技術中，已報道的關于從發酵液中提純分離出GSH的方法主要有:銅鹽法、離子交換法、親和層析法、雙水相萃取、反膠束萃取等。其中，銅鹽法作為一種傳統的提取方法，選擇性強，收率高且易于操作，有很強的實用價值;然而，在操作過程中，容易引入雜質而造成產品純度不高。離子交換法也是一種提純GSH的常用手段，但是，所用填料成本偏高且使用壽命偏短，生產周期長且廢水處理量大，因而在工業生產中常被限制。其中，親和層析法是一種有效分離GSH的方法，但含汞樹脂穩定性差且易泄露，因此不宜在食品藥品領域應用。應用雙水相萃取法分離GSH，雖然效率較高，但由于雙水相組成系統一般比較昂貴，生產成本高，這使得它在技術上的優勢被削弱。其中，反膠束萃取谷胱甘肽是一種很有發展潛力的方法，但其工業化大規模應用還不成熟，目前還處于實驗室研究階段。
[0007]由此可見，現有技術尚未能提供一種適于工業化生產的分離純化谷胱甘肽的方法。
【發明內容】
[0008]針對上述現有技術中存在的缺陷與不足，為了獲得一種適于工業化生產的分離純化谷胱甘肽的方法，發明人研發出一種從大腸桿菌發酵液中分離純化谷胱甘肽的方法，其將銅鹽沉淀法與樹脂純化法巧妙地有效結合，通過銅鹽沉淀法提取谷胱甘肽液，利用離子交換樹脂除去色素等雜志以提高純度，再濃縮、結晶，得到純的谷胱甘肽晶體。
[0009]因此，本發明所提供的技術方案為:
一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，包括以下步驟:
(1)將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入純水，充分攪拌，使GSCu沉淀懸浮液的勻漿濕重為300-500g/L;
(2)向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化物，攪拌反應，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；
(3)將所述谷胱甘肽母液離心，得到含谷胱甘肽的上清液；
(4)對所述上清液進行壓濾或微濾，用于除去顆粒雜質；
(5)將步驟(4)所得的濾液上樣于陽離子交換樹脂或大孔吸附樹脂，洗滌平衡后，以解吸附溶液進行洗脫，得到谷胱甘肽溶液；
(6)將所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa壓力下且在55?65°C下減壓濃縮，制得谷胱甘肽濃縮液；
(7)采用乙醇溶液對谷胱甘肽濃縮液進行結晶操作，得到谷胱甘肽晶體粗品；
(8)真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純的谷胱甘肽晶體。
[0010]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(2)中，以150?250rpm的攪拌速度進行攪拌反應45?60 min。
[0011 ]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法中，所述硫化物選自以下任一種:硫化氫，硫化鈉，硫化鉀和硫化銨。
[0012]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(4)中，所述壓濾或微濾采用的濾布或濾膜的孔徑為0.45μπι。
[0013]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法中，所述陽離子交換樹脂選自以下任一種:DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，HD-8大孔強酸型樹脂，D-61大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂;所述大孔吸附樹脂選自以下任一種:SP207大孔吸附樹脂，XDA-1大孔吸附樹脂，DA201-C大孔吸附樹脂。
[0014]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(3)中，還包括:使用鹽酸或磷酸或硝酸調節所述上清液的pH至2?4。
[0015]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(5)中，采用陽離子交換樹脂時相應使用的解吸附溶液為氫氧化銨水溶液、氯化鈉水溶液或鹽酸;采用大孔吸附樹脂時相應使用的解吸附溶液為乙醇水溶液。
[0016]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(6)中所述的谷胱甘肽濃縮液的濃度為380?420 g/Lo
[0017]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(7)為:向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸或磷酸或硝酸調節谷胱甘肽乙醇溶液的PH至2?4，以150?250 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65?75%的乙醇溶液洗滌2~4次，得到谷胱甘肽晶體粗品。
[0018]優選地，上述谷胱甘肽的高效分離純化方法的步驟(8)為:在-0.07Mpa?OMpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純度多98%的谷胱甘肽晶體。
[0019]由于本發明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法將銅鹽沉淀法與樹脂純化法有效地結合;在銅鹽沉淀階段，利用GSH與氧化亞銅絡合生成沉淀的特性完成固液分離，從而除去大部分的蛋白質和鹽分，初步濃縮提純了 GSH，利于下一步的樹脂純化;在樹脂純化階段，由于蛋白質和鹽分等干擾成分的減少，提高了樹脂對GSH的吸附量，從而進一步提高了生產效率。因此，本發明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法充分利用兩者的優點，解決了谷胱甘肽不易于大規模工業化生產的技術問題;此外，所述分離純化方法操作簡單，易于控制，處理周期短，能耗低，因而生產成本低，特別適合用于工業化生產。因此，本發明所提供的谷胱甘肽的高效分離純化方法具有良好的應用前景與市場潛力。
【具體實施方式】
[0020]下面結合【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，但本發明并不限于以下實施方式。
[0021]第一方面，本發明提供了一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，包括以下步驟:
(1)將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入純水，充分攪拌，使GSCu沉淀懸浮液的勻漿濕重為300-500g/L;
(2)向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化物，攪拌反應，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；
(3)將所述谷胱甘肽母液離心，得到含谷胱甘肽的上清液；
(4)對所述上清液進行壓濾或微濾，用于除去顆粒雜質；
(5)將步驟(4)所得的濾液上樣于陽離子交換樹脂或大孔吸附樹脂，洗滌平衡后，以解吸附溶液進行洗脫，得到谷胱甘肽溶液；
(6)將所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa壓力下且在55?65°C下減壓濃縮，制得谷胱甘肽濃縮液；
(7)采用乙醇溶液對谷胱甘肽濃縮液進行結晶操作，得到谷胱甘肽晶體粗品；
(8)真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純的谷胱甘肽晶體。
[0022]在一個優選實施例中，步驟(2)中，以150?250 rpm的攪拌速度進行攪拌反應45?60
mino
[0023]在一個優選實施例中，所述硫化物選自以下任一種:硫化氫，硫化鈉，硫化鉀和硫化銨。
[0024]在一個優選實施例中，步驟(4)中，所述壓濾或微濾采用的濾布或濾膜的孔徑為0.45ym0
[0025]在一個優選實施例中，所述陽離子交換樹脂選自以下任一種:DOOl大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，HD-8大孔強酸型樹脂，D-61大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂；所述大孔吸附樹脂選自以下任一種:SP207大孔吸附樹脂，XDA-1大孔吸附樹脂，DA201-C大孔吸附樹脂。
[0026]在一個優選實施例中，步驟(3)中，還包括:使用鹽酸或磷酸或硝酸調節所述上清液的pH至2?4。
[0027]在一個優選實施例中，步驟(5)中，采用陽離子交換樹脂時相應使用的解吸附溶液為氫氧化銨水溶液、氯化鈉水溶液或鹽酸;采用大孔吸附樹脂時相應使用的解吸附溶液為乙醇水溶液。
[0028]在一個優選實施例中，步驟(6)中所述的谷胱甘肽濃縮液的濃度為380?420g/L。
[0029]在一個優選實施例中，步驟(7)為:向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸或磷酸或硝酸調節谷胱甘肽乙醇溶液的pH至2?4，以150-250 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65?75%的乙醇溶液洗滌2~4次，得到谷胱甘肽晶體粗品。
[0030]在一個優選實施例中，步驟(8)為:在-0.07 Mpa~0 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純度多98%的谷胱甘肽晶體。
[0031]下述谷胱甘肽的分離純化實施例均按照本發明所提供的技術方案實施，其中所使用的試劑或原料如無特別說明均能從公開商業途徑獲得，所述步驟如無特別說明則均為常規處理操作。
[0032]實施例1
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以250 rpm的轉速攪拌反應I小時，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液;用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調節pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07 Mpa壓力下且在65°C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55°C的50 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調節pH至3，以200 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.07 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到174g谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.6%,總收率為72.5%。
[0033]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.11%、Η 5.54%、0 31.25%。
[0034]實施例2
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以200 rpm的轉速攪拌反應50分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入磷酸調節pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于DOOl大孔強酸性苯乙稀系陽離子交換樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以2.0%鹽酸溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.05Mpa壓力下且在60 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至60°C的55%的乙醇溶液，接著使用鹽酸調節pH至3，以200 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度70%的乙醇溶液洗滌3次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.07 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到17 0.6 g谷胱甘肽晶體，經高效液相(H P L C)檢測純度為9 8.4 %，總收率為71.1%。
[0035]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.07%、Η 5.57%,O 31.26%。
[0036]實施例3
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以150 rpm的轉速攪拌反應45分鐘，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調節pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以20 %乙醇水溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.03Mpa壓力下且在65 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至65°C的60 %的乙醇溶液，接著使用磷酸調節pH至2，以250 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度75%的乙醇溶液洗滌4次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.01 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到178.6g谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.9%，總收率為74.4%。
[0037]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.23%。
[0038]實施例4
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以200 rpm的轉速攪拌反應60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入磷酸調節PH至2，用0.45μπι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以20 %乙醇水溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07Mpa壓力下且在65 V下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55 0C的60 %的乙醇溶液，接著使用磷酸調節pH至3，以200 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌4次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.05 Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到164.4 g谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.6%,總收率為68.5%。
[0039]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.07%、Η 5.59%、0 31.25%。
[0040]實施例5
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化鈉，并以200 rpm的轉速攪拌反應60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調節pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.06Mpa壓力下且在55 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55°C的55 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調節pH至4，以150 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度70%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.04Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到153.8g谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.2%，總收率為64.1%。
[0041 ] 所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.10%、Η 5.56%、0 31.26%。
[0042]實施例6
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化鉀，并以250 rpm的轉速攪拌反應45分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調節pH至4，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以2.5%鹽酸溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在OMpa壓力下且在65°C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至600C的55 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調節pH至3，以200 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌3次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.04Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到150.5 g谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.4%,總收率為62.7%。
[0043]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.57%,O 31.25%。
[0044]實施例7
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化: 取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化銨，并以150 rpm的轉速攪拌反應50分鐘，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調節pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以20 %乙醇水溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.02Mpa壓力下且在60°C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55°C的50%的乙醇溶液，接著使用稀硝酸調節pH至3，以150 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度75%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.06Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到153.1 g谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.4%，總收率為63.8%。
[0045]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.22%。
[0046]實施例8
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中通入硫化氫，并以150 rpm的轉速攪拌反應60分鐘，生成仏^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入稀硝酸調節pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸+0.3mo 1/L氯化鈉水溶液進行洗脫，洗脫流速為lOOmL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07Mpa壓力下且在65 °C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至60°C的60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸調節pH至3，以150 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.05Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到178.8 g谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.7%,總收率為74.5%。
[0047]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.06%^H 5.56%、0 31.27%。
[0048]實施例9
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化銨，并以250 rpm的轉速攪拌反應60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調節pH至3，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于HD-8大孔強酸型樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進行洗脫，洗脫流速為100mL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在OMpa壓力下且在65°C下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至600C的50 %的乙醇溶液，接著使用鹽酸調節pH至3，以200 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度75%的乙醇溶液洗滌3次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.02Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到134.Sg谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.5%,總收率為56.2%。
[0049]所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.09%^H 5.59%、0 31.23%。
[0050]實施例10
將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀，并按照以下步驟進行分離純化:
取600g GSCu沉淀(含240g GSH)，向其中加入純水，充分攪拌，定容至4L，得到GSCu沉淀懸浮液;將GSCu沉淀懸浮液轉移至另一容器中，向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化銨，并以200 rpm的轉速攪拌反應60分鐘，生成Cu2S沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液；用轉速為6000 rpm離心機離心所述谷胱甘肽母液，得到含谷胱甘肽的上清液；向所述上清液中加入鹽酸調節pH至2，用0.45μηι的濾膜過濾上清液除去顆粒雜質，收集濾液3.5L，上樣于SP207大孔吸附樹脂，柱體積為1.5m X 20cm，上樣流速為50mL/min，洗滌平衡后，以1.5%鹽酸溶液進行洗脫，洗脫流速為lOOmL/min，得到GSH溶液;將所述GSH溶液在-0.07 Mpa壓力下且在65 V下減壓濃縮，使GSH濃度達到400g/L，即制得谷胱甘肽濃縮液；向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55 0C的50 %的乙醇溶液，接著使用磷酸調節pH至3，以200 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65%的乙醇溶液洗滌2次，得到谷胱甘肽晶體粗品；最后，在-0.07Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到134.Sg谷胱甘肽晶體，經高效液相(HPLC)檢測純度為98.6%,總收率為56.2%。
[0051 ] 所制得谷胱甘肽晶體的元素分析如下:理論值:C 39.08%,H 5.58%,O 31.24%;測量值:C 39.07%、Η 5.57%,O 31.26%。
[0052]以上對本發明的具體實施例進行了詳細描述，但其只是作為范例，本發明并不限制于以上描述的具體實施例。對于本領域技術人員而言，任何對本發明進行的等同修改和替代也都在本發明的范疇之中。因此，在不脫離本發明的精神和范圍下所作的均等變換和修改，都應涵蓋在本發明的范圍內。
【主權項】
1.一種谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)將新鮮制備的氧化亞銅溶液加入至谷胱甘肽水溶液中，制得GSCu沉淀；向所述GSCu沉淀中加入純水，充分攪拌，使GSCu沉淀懸浮液的勻漿濕重為300-500g/L; (2)向所述GSCu沉淀懸浮液中加入硫化物，攪拌反應，生成⑶^沉淀并置換出谷胱甘肽，制得谷胱甘肽母液； (3)將所述谷胱甘肽母液離心，得到含谷胱甘肽的上清液； (4)對所述上清液進行壓濾或微濾； (5)將步驟(4)所得的濾液上樣于陽離子交換樹脂或大孔吸附樹脂，洗滌平衡后，以解吸附溶液進行洗脫，得到谷胱甘肽溶液； (6)將所述谷胱甘肽溶液在-0.07Mpa-O Mpa壓力下且在55?65°C下減壓濃縮，制得谷胱甘肽濃縮液； (7)采用乙醇溶液對谷胱甘肽濃縮液進行結晶操作，得到谷胱甘肽晶體粗品； (8)真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純的谷胱甘肽晶體。2.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(2)中，以150?250 rpm的攪拌速度進行攪拌反應45?60 min。3.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，所述硫化物選自以下任一種:硫化氫，硫化鈉，硫化鉀和硫化銨。4.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(4)中，所述壓濾或微濾采用的濾布或濾膜的孔徑為0.45μπι。5.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，所述陽離子交換樹脂選自以下任一種:D001大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂，HD-8大孔強酸型樹脂，D-61大孔強酸性苯乙烯系陽離子交換樹脂;所述大孔吸附樹脂選自以下任一種:SP207大孔吸附樹脂，XDA-1大孔吸附樹脂，DA201-C大孔吸附樹脂。6.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(3)中，還包括:使用鹽酸或磷酸或硝酸調節所述上清液的PH至2?4。7.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(5)中，采用陽離子交換樹脂時相應使用的解吸附溶液為氫氧化銨水溶液、氯化鈉水溶液或鹽酸;采用大孔吸附樹脂時相應使用的解吸附溶液為乙醇水溶液。8.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(6)中所述的谷胱甘肽濃縮液的濃度為380?420 g/Lo9.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(7)為:向所述谷胱甘肽濃縮液中加入預熱至55?65°C的50?60%的乙醇溶液，接著使用鹽酸或磷酸或硝酸調節谷胱甘肽乙醇溶液的PH至2?4，以150?250 rpm的轉速緩慢攪拌，緩慢析出晶體;充分析晶后，抽濾，用濃度65?75%的乙醇溶液洗滌2~4次，得到谷胱甘肽晶體粗品。10.根據權利要求1所述的谷胱甘肽的高效分離純化方法，其特征在于，步驟(8)為:在-.0.07 Mpa-O Mpa的壓力下于60°C真空干燥所述谷胱甘肽晶體粗品，得到純度多98%的谷胱甘肽晶體。
【文檔編號】C07K5/037GK106008664SQ201610593413
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月26日
【發明人】劉世領, 王德正
【申請人】上海青平藥業有限公司