一種苦瓜皂苷的新型提取方法

一種苦瓜皂苷的新型提取方法
【專利摘要】本發明涉及天然產物深加工技術領域，具體涉及一種苦瓜皂苷的新型提取方法，包括以下步驟：S1取干燥的苦瓜粉溶于乙醇中，振蕩搖勻，放置在60℃水浴鍋中浸提1h之后離心獲得苦瓜皂苷醇提液，并于旋轉蒸發器中真空濃縮至濃縮液無醇味，制得苦瓜皂苷提取液A；S2采用異丙醇/(NH4)2SO4雙水相體系進行萃取，分配平衡后分相，取上相，制得苦瓜皂苷提取液B；S3將苦瓜皂苷粗提液B通過AB?8型大孔吸附樹脂進一步純化，制得苦瓜皂苷精提物C；S4冷凍干燥制備苦瓜皂苷成品。與傳統方法相比，本發明通過乙醇浸提、雙水相萃取和大孔樹脂結合分離得到的苦瓜皂苷，苦瓜皂苷得率有所增加，苦瓜皂苷的降血糖活性也明顯提高。
【專利說明】
一種苦瓜皂苷的新型提取方法
技術領域
[0001] 本發明涉及天然產物深加工技術領域，具體涉及一種苦瓜皂苷的新型提取方法。
【背景技術】
[0002] 苦瓜，屬于萌蘆科苦瓜屬植物，是一種"藥食兩用"的天然植物，苦瓜中含有苦瓜皂 苷、多糖、蛋白質和多肽等多種化學成分。苦瓜皂苷是一類比較復雜的苷類化合物，又稱配 糖體(glycoside )，是由糖或糖的衍生物等與另一非糖物質通過其端基碳原子聯接而成的 化合物，是由皂苷元和糖、糖醛酸或其它有機酸所組成，根據苷元的化學結構可分為三萜皂 苷和留體皂苷兩大類。據報道其具有抗腫瘤、提高免疫、降血糖、抑菌、抗病毒等功能。苦瓜 皂苷具有一般皂苷的性質如分子量較大，不易結晶，一般呈無色或乳白色粉末，易溶水、乙 醇和熱甲醇。目前，國內外關于苦瓜皂苷的提取工藝的研究報道很少，一般常見的報道用甲 醇-乙醚，石油醚-乙酸乙酯-正丁醇等有機溶劑提取，這樣會導致有機溶劑殘留、藥物活性 降低或喪失，目標產物收率低等一系列問題。

【發明內容】

[0003] 本發明的目的是提供一種苦瓜皂苷的新型提取方法，通過新型雙水相體系和大孔 樹脂結合分離方法增加苦瓜總皂苷的得率，解決現有提取方法有機溶劑殘留，藥物活性成 分不高，目標產物收率低等問題。
[0004] 為了實現上述的目的，采用如下的技術方案。
[0005] -種苦瓜皂苷的新型提取方法，該方法包括以下步驟： S1取干燥的苦瓜粉溶于乙醇中，振蕩搖勻，放置在60°C水浴鍋中浸提lh之后離心獲得 苦瓜皂苷醇提液，并于旋轉蒸發器中真空濃縮至濃縮液無醇味，制得苦瓜皂苷提取液A; S2采用異丙醇/(NH4)2S04雙水相體系進行萃取，分配平衡后分相，取上相，制得苦瓜皂 苷提取液B; S3將苦瓜皂苷粗提液B通過AB-8型大孔吸附樹脂進一步純化，制得苦瓜皂苷精提物C; S4冷凍干燥制備苦瓜皂苷成品。
[0006] 進一步地，步驟S1所述的乙醇濃度為70 %乙醇。70 %乙醇對苦瓜皂苷的浸出率和 提取率較高。
[0007] 進一步地，步驟S1中苦瓜粉與乙醇溶液固液比為l:20(g/mL)，離心條件是4000rpm 離心10min。
[0008] 進一步地，步驟S2中雙水相萃取條件為系線長度(TLL)為83,相比（R)為3,其中各 組分質量分數分別為74.994%異丙醇、40.111 % (NH4)2S〇4，分配平衡30min。
[0009] 進一步地，步驟S3中大孔樹脂純化苦瓜皂苷的具體步驟如下： 樹脂預處理： 先于吸附柱內加入相當于裝填樹脂體積0.4~0.5倍的水，然后將新樹脂投入柱中，使 其液面高于樹脂層約0.3m處;反洗:水量由小逐漸變大，使樹脂充分展開而不流出，以排水 清澈、透明為止;正洗:使樹脂床層落實。用2BV的2 %NaOH溶液，以1~2BV/h的流速通過樹脂 層，并浸4~8小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性； 用2BV乙醇，以lBV/h的流速通過樹脂層，并浸泡8~12小時。用乙醇，以lBV/h的流速通 過樹脂層，洗至流出液加水（1:4比例)不呈白色渾濁止;并以水以同樣流速洗凈乙醇；用2BV 的5 %HCL溶液，以4~6BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2~4小時，而后用水以同樣流速洗至 出水pH中性； 裝柱： 取處理好的樹脂于水中濕法裝柱，玻璃柱L = 30cm，內D=1.6cm樹脂裝填高度25cm，樹 脂體積50mL，用蒸餾水過夜壓柱，流速1.5mL/min; 上樣： 將處理好的苦瓜皂苷提取液B上樣，皂苷濃度0.8637mg/mL，上樣體積為200mL，上樣流 速為0.5ml/min，待樣品流完后，吸附lh; 洗脫： 先用蒸餾水洗至流出液經苯酚-硫酸檢測不顯紅色（除去多糖雜質），流速為1.5mL/ min，再用460mL的0-100 %的乙醇梯度洗脫，最后用60mL (-個柱體積)無水乙醇洗脫，洗脫 流速為lml/min;用分布收集器對洗脫下的溶液進行收集，共收集68管，然后根據濃度梯度 將洗脫曲線畫出來;苦瓜皂苷提取液B經純化后收集乙醇濃度為72-82 %的洗脫液，旋轉蒸 發除去乙醇，制成苦瓜皂苷精提物C。
[0010] 本發明的另一目的在于保護利用上述新型提取方法制備的苦瓜皂苷精提物及苦 瓜皂苷成品。
[0011] 本發明的苦瓜皂苷新型提取方法及提取物具有的優點： (1) 本發明依次采用乙醇浸提、雙水相萃取和大孔樹脂分離，避免了傳統方法收率低等 弊端，提取工藝簡單、成本低，適于間歇性和規模化生產加工高純度、高得率的苦瓜皂苷成 品； (2) 本發明所采用的雙水相系統反應反應條件溫和不會引起生物活性物質失活或變 性，能耗小，不存在有機溶劑殘留問題，用藥安全性高，適合于天然生物活性成分分離； (3) 本發明的新型方法對苦瓜皂苷有明顯的富集效果，該方法制得的苦瓜總皂苷的得 率在相同情況下比傳統方法下制得的苦瓜總皂苷的得率高出很多； (4) 本發明的新型方法對苦瓜皂苷的降血糖活性有明顯的提高作用，該方法制得的苦 瓜皂苷精提物在相同情況下比傳統方法下制得的苦瓜皂苷精提物的降血糖活性明顯高出 很多，利用異丙醇/(NH4)2S04體系結合大孔樹脂層析能富集低極性的苦瓜皂苷組分，這種 極性的苦瓜皂苷組分的降血糖活性遠遠高于傳統方法，其降糖活性最高與降血糖藥阿卡波 糖相近。
[0012] 與傳統方法相比，本發明通過乙醇浸提、雙水相萃取和大孔樹脂結合分離得到的 苦瓜皂苷，苦瓜皂苷得率有所增加，苦瓜皂苷的降血糖活性也明顯提高。本發明通過雙水相 系統對苦瓜中有效成分皂苷進行分離純化，可以實現廉價化，高效化操作。
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發明的苦瓜皂苷提取工藝流程圖； 圖2是三種不同方法所得皂苷洗脫曲線圖，從上到下依次是單獨采用大孔樹脂層析洗 脫圖，乙醇/(NH4)2S04體系結合大孔樹脂層析洗脫圖，異丙醇/(NH 4)2S04體系結合大孔樹脂 層析洗脫圖； 圖3為總皂苷得率圖，從左到右依次為大孔樹脂層析所得總皂苷得率，乙醇/(NH4)2S0 4 體系結合大孔樹脂層析所得總皂苷得率，異丙醇/(NH4)2S04體系結合大孔樹脂層析所得總 阜苷得率； 圖4是本發明實施例中三種方法下得到的苦瓜皂苷及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性抑 制率圖，其中：圖（a)、（b)、（c)和(d)分別為苦瓜皂苷精提物C1、C2、C3及阿卡波糖對α-葡萄 糖苷酶活性抑制率情況。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合【具體實施方式】和附圖對本發明作進一步的描述。
[0015] 實施例1使用三種不同提取方法制備苦瓜皂苷 s 1制備苦瓜皂苷提取液A:取55g干燥的苦瓜粉以1:20 (g/mL)的固液比溶于70 %的乙醇 中，振蕩搖勻，放置在60 °C水浴鍋中，lh后取出，4000rpm離心10min，合并上清液，獲得苦瓜 皂苷醇提液并于旋轉蒸發器中真空濃縮至濃縮液無醇味，制得苦瓜皂苷提取液A。 S2制備苦瓜皂苷提取液B1:采用乙醇/(NH4)2S〇4雙水相體系萃取苦瓜皂苷醇提液A，雙 水相萃取條件為系線長度(TLL)為45，相比(R)為2.5，其中各組分質量分數分別為45.195% 乙醇、33.594% (NH4)2S〇4，分配平衡30min后分相，取上相，制得苦瓜皂苷提取液B1。 S3制備苦瓜皂苷提取液B2:采用異丙醇/(NH4)2S〇4雙水相體系萃取旋蒸除去乙醇后的 苦瓜皂苷醇提液A，雙水相萃取條件為系線長度(TLL)為83,相比(R)為3,其中各組分質量分 數分別為74.994%異丙醇、40.111 % (順4)2S〇4，分配平衡30min后分相，取上相，制得苦瓜皂 苷提取液B2。 S4制備苦瓜皂苷精提物(：1工2、03:將苦瓜皂苷提取液4、81、82(皂苷濃度分別為1.2、 1.2、0.8637mg/mL)通過AB-8型大孔吸附樹脂進一步純化。大孔吸附樹脂使用前先要進行預 處理，預處理步驟如下:先于吸附柱內加入相當于裝填樹脂體積0.4~0.5倍的水，然后將新 樹脂投入柱中，使其液面高于樹脂層約0.3m處。反洗:水量由小逐漸變大，使樹脂充分展開 而不流出，以排水清澈、透明為止。正洗:使樹脂床層落實。用2BV的2 % NaOH溶液，以1~2BV/ h的流速通過樹脂層，并浸4~8小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。用2BV乙醇，以 lBV/h的流速通過樹脂層，并浸泡8~12小時。用乙醇，以lBV/h的流速通過樹脂層，洗至流出 液加水（1:4比例）不呈白色渾濁止。并以水以同樣流速洗凈乙醇。用2BV的5 % HCL溶液，以4 ~6BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2~4小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性。取三 份等量處理好的樹脂分別于水中濕法裝柱，（玻璃柱L = 30cm,內徑D = 1.6cm)，樹脂裝填高 度25cm，樹脂體積40mL，用蒸餾水過夜壓柱，流速為1.5mL/min。分別取200mL苦瓜皂苷提取 液A、B1、B2上柱，上樣流速為0.5ml/min，待樣品流完后，吸附lh。然后用蒸餾水洗至流出液 經苯酸 -硫酸檢測不顯紅色，流速為1.5mL/min，再用460mL的0-100%的乙醇梯度洗脫，最后 用60mL(-個柱體積)無水乙醇洗脫，洗脫流速為lml/min。用分布收集器對洗脫下的溶液進 行收集，共收集68管，然后根據濃度梯度將洗脫曲線畫出來。苦瓜皂苷提取液A、B1經純化后 收集乙醇濃度為60-70 %的洗脫液，旋轉蒸發除去乙醇，分別制成苦瓜皂苷精提物Cl、C2，苦 瓜皂苷提取液B2經純化后收集乙醇濃度為72-82 %的洗脫液，旋轉蒸發除去乙醇，分別制成 苦瓜皂苷精提物C3; S5分別冷凍干燥制備淡黃色粉末狀苦瓜皂苷D1、D2、D3成品。
[0016] 其中，本發明的苦瓜皂苷提取工藝流程圖如圖1所示。通過測定在傳統大孔樹脂和 新型雙水相-大孔樹脂結合分離苦瓜皂苷這兩種方法下所收集到的68管的皂苷濃度，畫出 洗脫曲線圖，并計算總皂苷得率。如圖2所示，三種方法下所得皂苷洗脫曲線圖，從上到下依 次是單獨采用大孔樹脂層析洗脫圖，乙醇/(NH 4)2S04體系結合大孔樹脂層析洗脫圖，異丙 醇/(NH4) 2S04體系結合大孔樹脂層析洗脫圖，圖3為總皂苷得率圖，從左到右依次為大孔樹 脂層析所得總皂苷得率，乙醇/(NH 4)2S04體系結合大孔樹脂層析所得總皂苷得率，異丙醇/ (NH 4)2S04體系結合大孔樹脂層析所得總皂苷得率。由圖2和3可知，單獨采用大孔樹脂層析、 乙醇/(NH 4)2S04結合大孔樹脂層析、異丙醇/(NH4) 2S04結合大孔樹脂層析這三種方法處理lg 苦瓜粉所得苦瓜總皂苷的得率分別是5.65、15.1、8.0mg/g。說明雙水相體系和大孔樹脂層 析結合后苦瓜總皂苷的得率與傳統方法相比有所提高。
[0017] 實施例2體外降糖活性測定指標評定 本實施例中樣品為阿卡波糖、苦瓜皂苷成品〇1、02、03。苦瓜皂苷提取液六、81經純化后 收集乙醇濃度為60-70 %的洗脫液，旋轉蒸發除去乙醇，分別制成苦瓜皂苷精提物Cl、C2，苦 瓜皂苷提取液B2經純化后收集乙醇濃度為72-82 %的洗脫液，旋轉蒸發除去乙醇，分別制成 苦瓜皂苷精提物C3。分別凍干燥制備淡黃色粉末狀苦瓜皂苷D1、D2、D3成品。苦瓜皂苷體外 降糖活性測定指標由其對α-葡萄糖苷酶活性抑制率來評定。
[0018] 實驗原理：
反應體系組成： (1) 67mM磷酸鹽緩沖液：稱取0.912g的磷酸二氫鉀用蒸餾水溶解，定容至100mL，用 lmol/L的氫氧化鈉溶液調PH至6.8; (2) 10mM的PNPG(4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷）：稱取0.151g的PNPG用67mM磷酸鹽緩沖 液溶解，定容至50mL; (3) 100mM的碳酸鈉溶液:稱取1.060g的無水碳酸鈉用蒸餾水溶解，定容至100mL; (4) 3mM的谷胱甘肽(GSH):稱取0.046的谷胱甘肽干粉用蒸餾水溶解，定容至50mL; (5) a-葡萄糖苷酶：將100U的a-葡萄糖苷酶干粉用67mM磷酸鹽緩沖液溶解，定容至 10mL，即配制10U/mL的母液，分裝，用時再將母液稀釋25倍至0.4U/mL; (6) 苦瓜皂苷樣品:將通過傳統大孔樹脂分離和新型雙水相-大孔樹脂結合分離三種方 法得到的苦瓜皂苷各組分提取液蒸干，得到苦瓜皂苷成品01、02、03，并用67!1^磷酸鹽緩沖 液溶解形成溶液。
[0019] 實驗步驟： 取100yL樣品、100yL的0.4U/mL的a-葡萄糖苷酶、200yL的GSH和1.3mL的磷酸鹽緩沖液， 37 °C保溫10min，向其中加入100yL的PNPG，反應20min，后再加入lmL的Na2C03溶液終止反應 2-3min，最后用分光光度計于波長400nm處測其吸光度值。
[0020] 實驗設置4組： (1) 空白組：100yL 的 PNPG+1.5mL 的磷酸鹽緩沖液+200yLGSH+lmLNa2C〇3 (2) 樣品組：100yL樣品+ 100yL酶+100yL的PNPG+1.3mL的磷酸鹽緩沖液+200yLGSH+ lmLNa2C〇3 (3) 對照組：100yL 酶+100yL 的 PNPG+1.4mL 的磷酸鹽緩沖液+200yLGSH+lmLNa2C〇3 (4) 樣品空白組：10OyL樣品+10OyL的PNPG+1.4mL的磷酸鹽緩沖液+20OyLGSH+ lmLNa2C〇3 α-葡萄糖苷酶活性抑制率： 酶活性抑制率（％) = {1-(Α樣品組一 Α樣品空白組)/(Α對照組一 Α空白組）}Χ100%
[0021] 如圖4所示，這三種方法下得到的苦瓜皂苷對α-葡萄糖苷酶活性均有一定的抑制 作用。圖(a)、（b)、（c)和(d)分別為苦瓜皂苷成品D1、D2、D3及阿卡波糖對α-葡萄糖苷酶活性 抑制率情況。其中苦瓜皂苷精提物D1的α-葡萄糖苷酶抑制率的IC 5Q = 380yg/mL，D2的IC50 = 80yg/mL，D3的IC5〇 = 50yg/mL，阿卡波糖的IC5〇 = 42yg/mL。與傳統單獨采用大孔樹脂分離方 法相比，雙水相體系結合大孔樹脂方法所得皂苷具有較高降血糖活性，而且異丙醇/(NH 4) 2S04體系結合大孔樹脂層析能富集低極性的苦瓜皂苷組分，這種方法所得的苦瓜皂苷組分 的降血糖活性是三種方法中最高，與阿卡波糖的降糖活性相近。
[0022]雖然，上文中已經用一般性說明、【具體實施方式】及試驗，對本發明作了詳盡的描 述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見 的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬于本發明要求保護的 范圍。
【主權項】
1. 一種苦瓜皂苷的新型提取方法，其特征在于，該方法包括以下步驟： S1取干燥的苦瓜粉溶于乙醇中，振蕩搖勻，放置在60°C水浴鍋中浸提lh之后離心獲得 苦瓜皂苷醇提液，并于旋轉蒸發器中真空濃縮至濃縮液無醇味，制得苦瓜皂苷提取液A; S2采用異丙醇/(NH4)2S04雙水相體系進行萃取，分配平衡后分相，取上相，制得苦瓜皂 苷提取液B; S3將苦瓜皂苷粗提液B通過AB-8型大孔吸附樹脂進一步純化，制得苦瓜皂苷精提物C; S4冷凍干燥制備苦瓜皂苷成品。2. 根據權利要求1所述的新型提取方法，其特征在于，步驟S1所述的乙醇濃度為70%乙 醇。3. 根據權利要求1所述的新型提取方法，其特征在于，步驟S1中苦瓜粉與乙醇溶液固液 比為1:20(g/mL)，離心條件是4000rpm離心10min。4. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S2中雙水相萃取條件為系線長度 (TLL)為83,相比(R)為3,其中各組分質量分數分別為74.994%異丙醇、40.111%(順) 23〇4， 分配平衡30min。5. 根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟S3中大孔樹脂純化苦瓜皂苷的具體步 驟如下： 樹脂預處理:先于吸附柱內加入相當于裝填樹脂體積0.4~0.5倍的水，然后將新樹脂 投入柱中，使其液面高于樹脂層約〇.3m處;反洗:水量由小逐漸變大，使樹脂充分展開而不 流出，以排水清澈、透明為止;正洗:使樹脂床層落實。用2BV的2 % NaOH溶液，以1~2BV/h的 流速通過樹脂層，并浸4~8小時，而后用水以同樣流速洗至出水pH中性； 用2BV乙醇，以1 BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡8~12小時。用乙醇，以1 BV/h的流速通 過樹脂層，洗至流出液加水（1:4比例)不呈白色渾濁止;并以水以同樣流速洗凈乙醇；用2BV 的5 %HCL溶液，以4~6BV/h的流速通過樹脂層，并浸泡2~4小時，而后用水以同樣流速洗至 出水pH中性； 裝柱：取處理好的樹脂于水中濕法裝柱，玻璃柱L = 30cm，內D=1.6cm樹脂裝填高度 25cm，樹脂體積50mL，用蒸餾水過夜壓柱，流速1.5mL/min; 上樣:將處理好的苦瓜皂苷提取液B上樣，皂苷濃度0.8637mg/mL，上樣體積為200mL，上 樣流速為〇. 5ml/min，待樣品流完后，吸附lh; 洗脫：先用蒸餾水洗至流出液經苯酚-硫酸檢測不顯紅色（除去多糖雜質），流速為 1.5mL/min，再用460mL的〇-100%的乙醇梯度洗脫，最后用6〇111以一個柱體積）無水乙醇洗 脫，洗脫流速為lml/min;用分布收集器對洗脫下的溶液進行收集，共收集68管，然后根據濃 度梯度將洗脫曲線畫出來;苦瓜皂苷提取液B經純化后收集乙醇濃度為72-82%的洗脫液， 旋轉蒸發除去乙醇，制成苦瓜皂苷精提物C。6. 由權利要求1-5任一項所述新型提取方法制備的苦瓜皂苷精提物及苦瓜皂苷成品。
【文檔編號】C07J17/00GK106008647SQ201610521955
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年7月5日
【發明人】劉楊, 李明莉, 肖湘
【申請人】汕頭大學