非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作為有效成分的組合物的制作方法
【專利摘要】本發明涉及非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作為有效成分的組合物，尤其是涉及非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖，將聚甘露糖醛酸作為底物由海藻酸裂解酶分解的分子量為100?3000Da以下，提供包含上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作為有效成分的肥胖、糖尿病及更年期綜合征的改善、預防或治療用藥劑學組合物及腸道有益菌增進用益生菌。根據本發明，本發明的抗肥胖、抗糖尿病、雌激素活性及腸內微生物菌落調節效果與非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸寡糖相比顯著優秀。
【專利說明】
非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作為有效 成分的組合物
技術領域
[0001] 本發明涉及非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖及包含其作為有效成分的 組合物。
【背景技術】
[0002] 在現代社會中，隨著因肥胖(2014年基準，經濟合作與發展組織(0E⑶)成人的18% 為肥胖)及糖尿病（2011年基準，6.9 %為糖尿病）而發生的復合性代謝綜合征(metabo 1 ic syndrome)增加，功能性食品市場正在擴大。
[0003] 代謝綜合征是指因肥胖和胰島素抵抗性而發生的第2型糖尿病和多種代謝異常復 合性地發生的綜合征。代謝綜合征隨著因人口的高齡化和高熱量的飲食習慣等而急增，需 要多的社會費用，從而當前，急需根本性的原因預防及醫藥品或食品原材料開發。在人類的 腸內生態系統中，出生的同時，微生物開始棲息，來使有益菌和有害菌維持均衡，形成腸內 微生物菌落，與人類共生，并通過相互作用，來對人類的健康產生直接或間接的影響。最近， 美國國立衛生研究院(NIH)通過"人體微生物群落項目"來研究腸內微生物菌落和疾病之間 的關系，從而隨著微生物菌落的不均衡對炎癥性腸道疾病等的發病提供重要的原因，突出 了腸內微生物菌落的正常化的重要性。
[0004] 根據2006年科學雜志"自然(Nature)"中發表的肥胖和腸內細菌的連貫性論文，確 認如下：瘦的人和肥胖的人之間的腸內細菌分布不同，通過利用小鼠的實驗，在肥胖的小鼠 中，屬于厚壁菌門（Firmicut es)的細菌與屬于擬桿菌門（Bacteroidetes)的細菌相比，呈 現相對高的組成比率。之后，對腸內微生物和人體的研究在多種領域中進行，為了改善腸內 微生物區來抑制肥胖并疾病治療等，需要開發腸內微生物菌落改善劑。
[0005] 推定海洋生物中棲息有地球上相當于生物種的約80%的約50萬種的生物，但其 中，開發為有用生物資源的生物卻小于1%，因而開發潛在力非常高。作為來源于海藻類的 功能性原材料，代表性的海藻多糖類海藻酸(alginic acid)在海帶、裙帶菜等褐藻類中包 含15-35%，并具有0-〇-甘露糖醛酸(0-〇-11^11111^〇111〇3(^(1 ;]\〇和€[-1^-古洛糖醛酸（€[-1-guluronic acid;G)的兩種糖醛酸(uronic acid)以各種比率進行1，4配醣(glycoside)結 合的多糖醛酸苷(polyuronide)的特征。來源于海藻酸的寡糖根據組成糖可分為甘露糖醛 酸寡糖（M0S，mann uro-oligosaccharide)、古洛糖酸酸寡糖（G0S，gulur0-oligosaccharide)及甘露糖酸酸古洛糖酸酸混合寡糖(AOS，alginate oligosaccharide)， 并且，根據糖末端的雙鍵可進行區分。
[0006] 來源于海洋的多糖類從前開始利用于人類生活中，世界上針對來源于海洋生物的 抗癌、抗氧化、抗高血壓及抗菌物質等的生理活性等的研究正活躍地進行。全世界上生產的 海藻酸元祖生產量為約10萬噸，其中，30%左右利用為食品添加物，但在將上述海藻酸作為 高附加醫藥品原料進行開發的情況下，可使其價值加倍。在來源于海藻酸的寡糖的情況下， 隨著實現可視性的研究成果，應用領域廣泛地擴散，上述研究成果中，根據結構性特征報告 高等植物的根部生長促進、雙歧桿菌(Bifidobacterium sp.)生長促進、抗炎癥、抗氧化、抗 菌作用的生物學活性等。
[0007] 本說明書全文中，參照了多篇論文及專利文獻，并表示了其引用。所引用的論文及 專利文獻的公開內容全部插入于本說明書作為參照，從而更加明確說明本發明所屬的技術 領域的水平及本發明的內容。
【發明內容】
[0008] 本發明人為了增進向將海藻酸寡糖作為原材料的醫藥品及食品的利用而努力。最 終查明抗肥胖、抗糖尿病、腸內微生物菌落改善及雌激素功效等具有多種生理活性的來源 于海藻酸的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖，從而完成了本發明。
[0009] 因此，本發明的目的在于，提供非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖。
[0010] 本發明的再一目的在于，提供肥胖改善、預防或治療用組合物。
[0011] 本發明的另一目的在于，提供糖尿病改善、預防或治療用組合物。
[0012] 本發明的還一目的在于，提供腸道有益菌增進用益生菌。
[0013] 本發明的又一目的在于，提供更年期綜合征改善、預防或治療用組合物。
[0014] 本發明的其他目的及優點通過以下發明的詳細說明、發明要求保護范圍及附圖更 明確。
[0015] 根據本發明的一實施方式，本發明提供非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡 糖，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖將聚甘露糖醛酸(poly-mannuronate)作 為底物由海藻酸裂解酶(alinate ly ase)分解的分子量為100_3000Da以下。
[0016] 本發明人為了增進向將海藻酸寡糖作為原材料的醫藥品及食品的利用而努力。最 終，查明抗肥胖、抗糖尿病、腸內微生物菌落改善及雌激素功效等具有多種生理活性的來源 于海藻酸的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖。
[0017]在本說明書中，術語"非還原性"是指在寡糖的結構中，不具有異頭(在生成單糖類 的半縮醛(C-1與C-5之間的環形成）、半縮酮(C-2與C-5之間的環形成）的環化反應中附著于 一個碳的氫原子和羥基的位置被換的部分立體異構體的現象)碳的性質。
[0018] 在本說明書中，術語"不飽和型"是指氫原子的碳鏈(carbon ch ain)不飽和的形 態，"飽和型"是指氫原子的碳鏈飽和的形態。
[0019] 本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖是指不具有異頭碳，而氫原子 的碳鏈不飽和的形態的所有甘露糖醛酸寡糖。
[0020] 上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖具有以下一例（結合有3個糖的甘 露糖醛酸寡糖)的結構式1。
[0021] 結構式1
[0022]
[0023] 上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖具有如下Z-平均分子量(m/z)(圖 2):在單糖的情況下Z-平均分子量為175，在二糖的情況下Z-平均分子量為351，在三糖的情 況下Z-平均分子量為527,在四糖的情況下Z-平均分子量為704,在五糖的情況下Z-平均分 子量為880,在六糖的情況下Z-平均分子量為1056,在七糖的情況下Z-平均分子量為1232。
[0024] 并且，在本說明書中，術語"非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖"是指酸水解 聚甘露糖醛酸來取得的飽和型甘露糖醛酸寡糖。
[0025] 本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖通過將聚甘露糖醛酸作為底 物由海藻酸裂解酶分解而制備。
[0026] 根據本發明的一實例，上述海藻酸裂解酶是指對由聚古洛糖醛酸 (polyguluronate)及聚甘露糖醛酸(polymannuronate)組成的海藻酸(alginate)進行分解 來低分子化的酶。
[0027]根據本發明的特定實例，上述海藻酸裂解酶為來源于鮑魚腸內菌株的AlyDWll(韓 國登錄特許10-1277706)。
[0028] 本發明的上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖由一個以上的糖形成。
[0029] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖包含1個至 10個甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。根據本發明的再一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘 露糖醛酸寡糖包含1個至9個甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。根據本發明的另一實例，上述非還 原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖包含1個至8個甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。根據本發明 的特定實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖包含1個至7個甘露糖醛酸或古 洛糖醛酸。
[0030] 本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖與非還原性末端的飽和型甘 露糖醛酸寡糖相比，去除了水分子，從而具有作為水分子的質量值的18左右的小的質量值 (圖 2)。
[0031] 本發明的上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖由甘露糖醛酸及古洛糖 醛酸形成。
[0032] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛 酸與古洛糖醛酸之比為1.2-5.0:1。根據本發明的再一實例，上述非還原性末端的不飽和型 甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸與古洛糖醛酸之比為1.2-4.5:1。根據本發明的另一實例，上 述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸與古洛糖醛酸之比為1.8-4.0: 1。根據本發明的特定實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸與 古洛糖醛酸之比為2.0-3.0:1。
[0033] 即，本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖中，與古洛糖醛酸相比，優 勢1.2-5.0倍、1.2-4.5倍、1.8-4.0倍或2.0-3.0倍包含甘露糖醛酸(圖4)。
[0034] 根據本發明的再一實施方式，包含含有上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸 寡糖作為有效成分的肥胖改善、預防或治療用組合物。
[0035] 在本說明書中使用的術語"肥胖"是指對健康導致異常程度的脂肪組織在體內過 剩地積累的狀態。
[0036] 本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖抑制脂肪積累。
[0037] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖對中性脂肪 的積累抑制20-60%、25-50%或30-40%，非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖抑制10-30%、10-25% 或 10-30%。
[0038] 根據本發明的再一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖與非還原 性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖相比，將中性脂肪的積累抑制2倍以上。
[0039] 上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖調節誘導肥胖的腸內微生物菌落。
[0040] 在本說明書中，術語"腸內微生物菌落（intes t inal mi crof 1 ora或g ut mi croflora)"是指在構成的動物的消化道中生長的微生物復合體群落（complex community)。眾所周知，構成腸內微生物菌落的各個微生物借助物質生產或分解能力對宿 主帶來危害或利益，從腸內菌落整體上考慮，參與維生素供給、感染防止及腸功能(蠕動運 動及吸收），由此，菌落的組成與便秘、腸相關疾病發生等具有密切的關系（Mistu oka T.Bifidobacteria Microflora，1(1):3，1982)〇
[0041] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖通過減少腸 內微生物菌株的生長來調節腸內微生物菌落。
[0042]根據本發明的再一實例，上述腸內微生物菌株為選自由羅斯氏菌屬(Roseburia sp.)及乳桿菌屬(Lactobacillus sp.)組成的組中的菌株。
[0043] 本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖抑制誘導肥胖的與脂肪-分化 相關的基因的表達。
[0044] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖抑制脂肪細 胞蛋白2(aP2，adipocyte protein 2)、CAAT增強子結合蛋白a(C/EBPa，CAAT enhancer binding proteina)及過氧化物酶體增殖物激活受體γ(ΡΡΑΙ?γ，Peroxisome Proliferator-Activated Rece ptory)的表達。
[0045] 根據本發明的再一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖對脂肪細 胞蛋白2、CAAT增強子結合蛋白α及過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達分別抑制15-35%、50-70%及30-50%。這種效果與非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖相比，優秀 1.5 至 7.0 倍。
[0046] 本發明的肥胖改善、預防或治療用組合物可制備成肥胖預防或治療用藥劑學組合 物、肥胖改善或預防用食品組合物或功能性食品組合物。
[0047]根據本發明的另一實施方式，本發明提供包含非還原性末端的不飽和型甘露糖醛 酸寡糖作為有效成分的糖尿病改善、預防或治療用組合物。
[0048]在本說明書中，術語"糖尿病"是指特征為由導致葡萄糖-不耐受（intolerance)的 胰島素的相對或絕對不足的慢性疾病。術語糖尿病包含所有種類的糖尿病，例如，包含第1 型糖尿病、第2型糖尿病及遺傳型糖尿病。第1型糖尿病作為胰島素依賴性糖尿病，主要由β-細胞的破壞導致。第2型糖尿病作為胰島素非依賴性糖尿病，由飯后不充分的胰島素的分泌 導致或胰島素的耐性導致。
[0049] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖促進葡萄糖 (glucose)的吸收(uptake)。
[0050] 本發明的這種效果是在非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖中未呈現的只屬 于非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的效果。
[0051] 根據本發明的再一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖介導腺苷 酸活化蛋白激酶(AMPK，AMP_activated Proein Kina se)路徑來促進糖的吸收。
[0052]本發明的糖尿病改善、預防或治療用組合物可制備成肥胖預防或治療用藥劑學組 合物、糖尿病改善或預防用食品組合物或功能性食品組合物。
[0053]根據本發明的還一實施方式，本發明提供腸道有益菌增進用益生菌，上述腸道有 益菌增進用益生菌包含非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分。
[0054]本發明的腸道有益菌增進用益生菌增進腸道有益菌的生長。
[0055] 在本發明的一實例中，上述腸道有益菌為選自由羅斯氏菌屬及乳桿菌屬組成的組 中的腸道有益菌。
[0056] 在本說明書中，術語"益生菌"是指有助于宿主有機體健康的生菌的食品輔助劑。 本發明的益生菌組合物可制備成發酵乳產品，但也可制備成顆粒、粉末等的形態。
[0057]本發明的益生菌組合物的給藥方法并不受特別限定，但還可制備成丸劑、片劑等 來以口服的方式給藥，還可制備成粉末型或顆粒型，來添加于食物而給藥。本發明的組合 物，例如，作為醫藥品使用的情況下的劑型對各成分的粉末不進行制劑化，而可直接使用， 但是可制劑化成散劑、顆粒劑、細粒劑、片劑、糖衣片劑、膠囊劑、腸溶包衣劑等的形態。作為 稀釋劑，使用用于普通醫藥品制劑的賦形劑、結合劑、崩解劑等，除此之外，還可添加著色 劑、穩定化劑、保鮮劑、潤滑劑等。在使用本發明的飲食用組合物作為食品的情況下，可按原 來不制劑化各成分的粉末而使用，但還可添加其他植物纖維、寡糖、谷物類、維生素類等，或 添加香料、著色劑、甜味劑等，來加工并形成為適合攝取的形態。并且，作為食品添加劑，還 可以在其他食品中添加并混合來使用。
[0058]本發明的腸道有益菌增進用益生菌可制備成藥劑學組合物、食品組合物或功能性 食品組合物。
[0059] 根據本發明的再一實施方式，本發明提供包含非還原性末端的不飽和型甘露糖醛 酸寡糖作為有效成分的更年期綜合征改善、預防或治療用組合物。
[0060] 在本說明書中，術語"更年期綜合征"為女性內分泌綜合征的一種，指與自然損失、 由外科手術導致的損失或以化學的方式誘導的損失無關地發生卵巢功能的全方面且漸進 性的減少，導致生理功能及性功能減退或消失的過渡期，作為更年期的一個過程，出現卵巢 功能停止之后發生的屬于生理的永久性停止的閉經。在閉經期，根據雌激素生成的減少、卵 泡刺激素及黃體激素的上升等激素的變化，可呈現急慢性癥狀。即，作為初期癥狀，可呈現 潮熱、盜汗等的血管運動型癥狀和心慌、集中力減退、憂郁癥等的心理癥狀，在閉經幾年內 呈現的泌尿生殖系統及表皮癥狀在閉經幾年之后有可能存在骨質疏松癥、心血管及腦血管 等的疾病。
[0061] 上述更年期綜合征包括選自由面部潮紅、出汗、心臟不適、睡眠問題、抑郁癥、過敏 性、心慌、身體疲勞、精神疲勞、性問題、排尿問題、陰道干澀、關節不適及肌肉不適組成的組 中的綜合征。
[0062] 本發明的包含非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分的組合物 使雌激素的活性增加。
[0063] 上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖經由將雌激素作為配體起作用的 雌激素受體路徑及雌激素非依賴性地起到作用的雌激素相關受體α路徑通過雌激素反應元 件（estrogen response element;ER Ε)-介導下部基因的表達活性化雌激素。
[0064] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖經由雌激素 受體α來誘導雌激素反應元件的表達。
[0065] 根據本發明的再一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖使雌激素 相關受體α表達來誘導雌激素反應元件的表達。
[0066] 由于上述雌激素反應元件的表達，通過下部雌激素基因的表達增加雌激素的活 性。
[0067] 根據本發明的另一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖使早老素 2(pS2，Presenilin 2)、孕激素受體（PR，Progestero n Receptor)及組織蛋白酶D(CTSD， E2_mediated Cathepsin D)信使核糖核酸(mRNA)的表達增加。
[0068] 根據本發明的再一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖使過氧化 物酶體增殖物激活受體γ共激活因子(PGC-Ια，Perox isome proliferator-activated receptor gamma coactivator l-α)、雌激素相關受體a(ERRa，Estrogen_related receptora)、GATA結合蛋白 3(GATA3，Trans-acting T-cel 1-specific Transcription Factor)及叉頭框蛋白A1(F0XA1，Forkhead box protein Al)信使RNA的表達增加。
[0069] 上述GATA結合蛋白3及叉頭框蛋白Al為對乳房細胞分化重要的因子，并起到抑制 向癌細胞或惡性腫瘤的分化的作用。
[0070] 本發明的組合物還包含17β-雌二醇（170_estradiol)。
[0071] 根據本發明的一實例，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖呈現與17β_ 雌二醇的協同效應(synergic effect)。
[0072] 本發明的組合物可制備成更年期綜合征預防或治療用藥劑學組合物、更年期綜合 征改善或預防用食品組合物或功能性食品組合物。
[0073] 本發明的(a)肥胖改善、預防或治療用組合物、（b)糖尿病改善、預防或治療用組合 物、（c)腸道有益菌增進用益生菌及(d)更年期綜合征改善、預防或治療用組合物可制備成 藥劑學組合物。
[0074]根據本發明的優選實例，本發明的組合物為(a)上述本發明的非還原性末端的不 飽和型甘露糖醛酸寡糖的藥劑學有效劑量及(b)包含在藥劑學上接受的載體的藥劑學組合 物。在本說明書中，術語"藥劑學有效劑量"是指用于實現上述的非還原性末端的不飽和型 甘露糖醛酸寡糖的功效或活性的充分的量。
[0075] 在本發明的組合物制備成藥劑學組合物的情況下，本發明的藥劑學組合物包含在 藥劑學上接受的載體。包含于本發明的藥劑學組合物的藥劑學上接受的載體作為制劑時通 常所使用的物質，包含乳糖、葡萄糖、鹿糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯膠、磷酸鈣、藻酸 鹽、明膠、硅酸鈣、微晶纖維素、聚乙烯吡咯烷酮、纖維素、水、糖漿、甲基纖維素、羥基苯甲酸 甲酯、羥基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸鎂及礦物油等，但并不局限于此。本發明的藥劑學組合 物除了上述成分之外還可包含潤滑劑、潤濕劑、甜味劑、香味劑、乳化劑、懸浮劑及保鮮劑 等。適合的藥劑學上接受的載體及制劑詳細地記載于Remington ' s Pharmaceutical Sciences(19th ed.，1995)。
[0076] 本發明的藥劑學組合物能夠以口服或非口服的方式給藥，優選地，以口服給藥的 方式適用。
[0077] 本發明的藥劑學組合物的適合的給藥量可根據制劑化方法、給藥方式、患者的年 齡、體重、性別、病態、飲食、給藥時間、給藥途徑、排泄速度及反應靈敏性等因素可多樣地處 方。本發明的藥劑學組合物的通常的給藥量以成人為基準在0.001yg/kg-100mg/kg范圍內。
[0078]本發明的藥劑學組合物通過本發明所屬技術領域的普通技術人員可容易實施的 方法，利用藥劑學上接受的載體和/或賦形劑來進行制劑化，從而能夠以單位容量的形態制 備或內入于多容量容器內來制備。此時，劑型可以為油或水性介質中的溶液、懸浮液、糖漿 劑或乳化液的形態，或可以為浸膏劑、散劑、粉劑、顆粒劑、片劑或膠囊劑的形態，還可包含 分散劑或穩定劑。
[0079]在本說明書中，"包含…作為有效成分"是指包含用于實現上述的非還原性末端的 不飽和型甘露糖醛酸寡糖的功效或活性的充分的量。有關上述的非還原性末端的不飽和型 甘露糖醛酸寡糖包含于本發明的組合物的量的上限，本發明所屬技術領域的普通技術人員 可在適當的范圍內選擇而實施。
[0080] 本發明的(a)肥胖改善、預防或治療用組合物、（b)糖尿病改善、預防或治療用組合 物、（c)腸道有益菌增進用益生菌及(d)更年期綜合征改善、預防或治療用組合物可制備成 食品組合物。
[0081] 在本發明的包含非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分的組合 物制備成食品組合物的情況下，作為有效成分，不僅包含非還原性末端的不飽和型甘露糖 醛酸寡糖，還包含制備食品時通常所添加的成分，例如，包含蛋白質、碳水化合物、脂肪、營 養素、調味劑及香味劑。作為上述碳水化合物，例如有作為單糖的葡萄糖、果糖等、作為二糖 的麥芽糖、蔗糖、寡糖等以及作為多糖的糊精、環糊精等的通常的糖及木糖醇、山梨糖醇及 赤蘚糖醇等的糖醇。作為香味劑，可使用天然香味劑(奇異果甜蛋白、甜葉菊提取物(例如， 萊鮑迪苷A、甘草甜素等））及合成香味劑(鄰苯甲酰磺酰亞胺、阿斯巴甜等）。例如，在本發明 的食品組合物制備成清涼劑的情況下，除了本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸 寡糖之外，還可包含檸檬酸、液態果糖、食糖、葡萄糖、乙酸、蘋果酸、果汁、杜仲提取液、棗提 取液、甘草提取液等。
[0082] 本發明的包含非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分的組合物 可制備成功能性食品組合物。在本發明的組合物制備成功能性食品組合物的情況下，包含 制備食品時通常所添加的成分，例如，包含蛋白質、碳水化合物、脂肪、營養素及調味劑。例 如，在制備成清涼劑的情況下，作為有效成分，除了非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡 糖之外，還可包含香味劑或天然碳水化合物。例如，天然碳水化合物包含單糖（例如，葡萄 糖、果糖等）、二糖(例如，麥芽糖、蔗糖等）、寡糖、多糖(例如，糊精、環糊精等)及糖醇(例如， 木糖醇、山梨糖醇及赤蘚糖醇等）。作為香味劑可使用天然香味劑(例如，奇異果甜蛋白、甜 葉菊提取物等)及合成香味劑(例如，鄰苯甲酰磺酰亞胺、阿斯巴甜等）。
[0083] 本發明的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為以往公知的海藻酸的生 理活性的活性成分呈現抗肥胖、抗糖尿病、更年期綜合征改善及腸內微生物菌落的調節效 果。這種效果與非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖相比，呈現顯著優秀的效果，由此， 意味著在呈現上述效果時，在非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖中出現的末端糖的 雙鍵及其的不飽和形態為重要的因素。
[0084]歸納本發明的特征及優點如下：
[0085] (a)本發明提供非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖、包含其作為有效成分 的肥胖、糖尿病及更年期綜合征的改善、預防或治療用藥劑學組合物及腸道有益菌增進用 益生菌。
[0086] (b)本發明制備作為海藻酸活性物質的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡 糖，來提供其的優秀的抗肥胖、抗糖尿病、雌激素活性及腸內微生物菌落調節效果。
[0087] (c)這種效果與以往的呈現非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖的形態的甘露 糖醛酸寡糖相比顯著優秀。
【附圖說明】
[0088] 圖1表示非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的薄層色譜法結果。
[0089] 圖2表示非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖及非還原性末端的飽和型甘露 糖醛酸寡糖的質量分析結果。
[0090] 圖3表示非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖（Non-reducin g end of unsaturated Mannuroic Acid Oligosaccharide;USM0S)及非還原性末端的飽和型甘露糖 酸酸寡糖（Non-reducing end of saturated Mannuroic Acid Oligosaccharide;SM0S)的 雙鍵比率。
[0091 ] 圖4表示利用圓二色譜(CD，circular dichorism)法確認非還原性末端的不飽和 型甘露糖醛酸寡糖及非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖(SM0S)的糖結構的結果。 [0092]圖5a及圖5b表示根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖處理的脂肪積累 抑制結果及利用實時聚合酶鏈式反應(PCR)的肥胖相關基因、脂肪細胞蛋白2、CAAT增強子 結合蛋白α及過氧化物酶體增殖物激活受體γ的表達抑制效果。
[0093]圖6a至圖6c表示根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖處理的糖吸收促 進結果及相關蛋白質、磷酸化P21活化激酶(p-PAK)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)及磷酸化 AS160(p-AS160)的表達量。
[0094]圖7a及圖7b表示根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖腹腔給藥的肥胖 誘導小鼠的腸內菌落分析結果。
[0095] 圖8表示根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的飲用攝取的老齡小鼠的 腸內微生物菌落主坐標(PC0,principal coordinate)分析結果。
[0096] 圖9表示在門（phylum)中比較分析根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖 的飲用攝取的老齡小鼠的腸內菌落變化的結果。
[0097]圖10a及圖10b表示根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖處理的早老素 2、孕激素受體及組織蛋白酶D的信使核糖核酸表達量。
[0098] 圖11表示根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的處理的過氧化物酶體 增殖物激活受體γ共激活因子、雌激素相關受體a、GAT A結合蛋白3及叉頭框蛋白A1的信使 核糖核酸表達量。
[0099] 圖12表示非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的作用機制。
[0100]圖13表示非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的多種生理活性效果。
【具體實施方式】
[0101]以下，詳細說明本發明的實施例，以便本發明所屬技術領域的普通技術人員可容 易實施。但是，本發明能夠以多種不同的方式實現，并不局限于在此說明的實施例。
[0102]實施例1:海藻酸寡糖的制備
[0103] 為了制備聚甘露糖醛酸(poly-mannuronate;poly M)，與lg的海藻酸鈉（日本大阪 和光(Wako，0saka Japan)公司）一同，添加100ml的0.3M的HC1，并在100°C溫度下加熱2小 時。將經加熱的500g的海藻酸鈉-HC1溶液離心分離5分鐘，來將分離的沉淀物溶解于蒸餾 水。添加 NaCl使得溶解于蒸餾水的沉淀物成為0.1M之后，將pH調節為2.8-3.0來制備500g， 并離心分離5分鐘來分離了上清液和沉淀物。已分離的沉淀物和上清液利用乙醇沉淀之后 進行干燥，從而將上清液部分制備成poly Μ，將沉淀物部分制備成poly G來用作用于制備 利用海藻酸分解酶的甘露糖醛酸寡糖的底物（Haug，A et al.A stu dy of the constitution of alginic acid by partial acid hydrolysis.Act aChemicaScandinavica，1966,20(l):183-190.及Joo，D.S.et al.Pre paration of oligosaccharides from alginic acid by enzymic hydrolysis.Korean Society of Food Science and Technology,1996,28(1):146-151)〇
[0104]為了制備非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖，利用如下基因轉化菌株： 2009年2月在韓國麗水近海中棲息的鮑魚的腸內脫氧核糖核酸(DNA)宏基因組文庫中篩選 的、相當于甘露糖醛酸分解能力優秀的0RF11的基因重組于pMAL-c2x表達載體之后，對BL21 (DE3)菌株實施克隆而制備(韓國登錄特許10-1277706)。
[0105] 在添加有40L的氨節青霉素 （ampici 1 lin，100μg/ml)的培養基（LB，Luria-Bertani)中接種500ml的上述基因轉化菌株，來在37°C溫度下進行培養，在600nm條件下，當 吸光度成為〇.4-〇.5時，添加異丙基-0-(1-硫代半乳糖苷（1?16，18叩^?71-0-〇-thiogalactopyranoside)，使得培養液的異丙基-β-d-硫代半乳糖苷的最終濃度成為0.3mM 后，培養了 12小時。培養結束之后，在9000g下將培養液離心分離15分鐘來沉淀細胞。利用 pH7.0的10mM磷酸緩沖液(phosphate buffer)使沉淀的細胞漂浮之后，為了分解細胞膜，實 施超聲波分解(sonication)，并為了分離輔酶，在9000g下，將離心分離實施15分鐘。將進行 離心分離之后得到分離的上清液作為輔酶使用，作為底物，在1L的pH7.0的10mM磷酸緩沖液 中，將聚甘露糖醛酸(P〇ly-mannuronate(poly M))以0 · 3%的濃度溶解之后，添加 AgN〇3使 得最終濃度成為ImM。利用2.5L的發酵器(KBT KB-250，日本(Japan))在45°C溫度下，將底物 分解反應進行了48小時。進行反應之后，為了獲得分子量為3000D a以下的寡糖混合物，利 用超濾膜系統(^；^3?1〇￥50,531'1：01'；[118,48，德國（661'11^1150)進行過濾來冷凍干燥之后，制 備了非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖。
[0106] 為了確認是否生產寡糖，實施了薄層色譜法（thin-layer chromato graphy)，該 方法如下：在水中以0. lmg/μL濃度熔解非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖之后，在 硅膠板(德國默克集團(Merck KGa A，Germany))中實施了3μ1的合模。利用展開溶劑（1-丁 醇：甲酸:水= 4:6:1)按非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖大小進行分離之后，使用 添加了硫酸的發色試劑(〇. 5ml的茴香醛、10ml的乙酸、85ml的MeOH及5ml的出5〇4)來確認是 否存在寡糖。
[0107] 實施例2:非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖結構及結構特征分析
[0108] 在本實驗例中，利用AlyDWll海藻酸分解酶來分解聚甘露糖醛酸之后，針對已確保 的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖混合物利用超濾膜系統（（VivaFlow 50,賽多 利斯(Sartorius)))確保了分子量為3000Da以下的分餾物。為了分析非還原性末端的不飽 和型甘露糖醛酸寡糖的組成糖，針對已準備的試樣，利用離子交換樹脂柱(H itrap DEAE Sepharose FF，GE Healthcare)進行純化之后，進行冷凍干燥。在水中恪解經純化的非還原 性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖之后，注入于超高效液相色譜/質譜(UPLC/MS)系統，從 而進行組成糖分析。
[0109] 超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography;UPLC，沃特世 (Waters)公司）的設定利用了ACQUITY UPLC BEH C18(1.7yml.0X100mm，沃特世公司）柱， 在0.4ml/分鐘條件下，將溶劑A[ 15mM戊胺（Amylamine)及25mM的六氟異丙醇（HFIP，He 義已:1^11101'0丨8(^1'(^31101)]和溶劑13(15111]\1戊胺及乙腈（4〇61:〇11；[1：1'；[16)中的25111]\1的六氟異丙 醇）的線性梯度調節了 12分鐘。利用質譜儀(Q uadrupole-Time of Flight，Q-T0F，沃特世 公司）分析了通過C18-超高效液相色譜法分離出來的洗脫液。在電噴霧離子源負模式中分 析了 Q-T0F，毛細管及采樣錐（sampling cone)的電壓分別為3kV及40V，脫溶劑 (desol vat ion)在流速為600L/h、溫度為300 °C，源溫度為120 °C的條件下實施。飛行時間質 譜儀(T0F MS)數據的掃描時間在0.5秒鐘m/z 100-1300范圍下進行分析。為了分析的準確 度，在所有分析中使用2ng/yl的亮氨酸腦啡肽（leucine enkephalin，在電噴霧離子源負模 式下554.2619Da)作為鎖噴（lock spray)。
[0110] 從圖2可知，根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的質量分析結果，非還 原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖由1個至7個糖構成，尤其，觀察到與已報告的甘露糖 醛酸寡糖分子量相比少18的峰值，由此可知去除水分子來形成非還原性末端的不飽和型甘 露糖醛酸寡糖，從而優勢于非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖(non-redu cing end of Saturated Mannuronic Acid Oligosaccharide;SM0S)而存在。
[0111] 在圖2示出了非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖和非還原性末端的飽和型 甘露糖醛酸寡糖的比率。如圖3所示，確認如下:非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖 與非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖相比，存在平均2倍以上的非還原性末端的不飽 和型甘露糖醛酸寡糖的多個單糖。非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖的分子量如下： 單糖(m/z 193)、糖(m/z 369)、三糖(m/z 545)、四糖(m/z 722)、五糖(m/z 898)、六糖(m/z 1074)、七糖(m/z 1250)。
[0112] 為了測定上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸比率，利用 圓二色譜（Circular Dichroism;CD，J_715分光偏振計（spectropolarimeter)，日本分光公 司（JASC0))測定了圓二色譜信號。上述圓二色譜信號在常溫條件下利用lcm的小槽，在190-250nm區域中進行測定，為了取得有一貫性的圓二色譜信號，以lmg/ml的濃度使用了上述非 還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖。為了了解甘露糖醛酸與古洛糖醛酸的組成比，測 定頂點（峰值(peak)，200nm吸光度值）、低點（谷值(trough)，215nm吸光度值)來計算了甘露 糖醛酸與古洛糖醛酸的比率，計算式如下。
[0113] (1)峰值/谷值<1，甘露糖醛酸/古洛糖醛酸= 2.0(峰值/谷值）
[0114] (2)峰值/谷值>1，甘露糖醛酸/古洛糖醛酸=27(峰值/谷值)+40
[0115] 從圖3可知，確認到非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的甘露糖醛酸與古 洛糖醛酸之比為2.12 (峰值=6.66，谷值=6.42)。
[0116] 實施例3:根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的脂肪細胞的脂肪積累 抑制
[0117] 若在DMEM培養基中培養3T3-L1脂肪前體細胞來融合(conflue ncy)，則利用0.5mM 的異丁基甲基黃噪呤（isobutylmethylxanthine，I BMX)、ImM的地塞米松（dexamethasone) 及lμg/ml的胰島素（以上MDI)處理兩天之后，利用包含有lμg/ml的胰島素的DMEM+血清培養 基以48小時的間隔進行更換，來7天向脂肪細胞誘導了分化。當更換培養基時，非還原性末 端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖以〇.2mg/ml的濃度進行處理，7天之后，通過進行油紅〇染色 (Oil red 0 stain)及核糖核酸提取，觀察脂肪細胞的脂肪積累及分化抑制程度，并在圖4 中表示了結果。
[0118] 如圖5a及圖5b中公開，利用油紅〇染色色素對中性脂肪進行染色之后，利用光學顯 微鏡觀察細胞，最終發現，當以〇.2mg/ml濃度進行處理時，與對照組相比，非還原性末端的 不飽和型甘露糖醛酸寡糖的脂肪細胞的油紅〇染色強度顯著弱化。進而，在利用油紅〇染色 的中性脂肪中提取色素來進行定量，最終發現與對照組相比，在非還原性末端形成雙鍵的 不飽和型甘露糖醛酸寡糖將中性脂肪的積累抑制約40%，在非還原性末端的飽和型甘露糖 醛酸寡糖的情況下，與對照組相比，在脂肪積累抑制效果中僅抑制約15%左右，由此確認到 雙鍵形成在抗肥胖效果中是重要的因素。
[0119] 利用相同方法將3T3-L1脂肪前體細胞分化成脂肪細胞之后，以0.2mg/ml的濃度處 理非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖之后，根據GeneJET核糖核酸純化試劑盒方法 提取核糖核酸之后，在圖4中表示了作為脂肪分化指標的脂肪細胞蛋白2、脂肪分化相關基 因 CAAT增強子結合蛋白α及過氧化物酶體增殖物激活受體γ表達抑制結果。
[0120]如圖5a及圖5b中公開，當處理非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖時，確認 如下：與對照組相比，在表達量中，脂肪細胞蛋白2、CAAT增強子結合蛋白α及過氧化物酶體 增殖物激活受體γ分別被抑制25%、60%及40%。并且，確認到與非還原性末端的飽和型甘 露糖醛酸寡糖相比，抗肥胖效果優秀。
[0121] 實施例4:非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖糖吸收調節確認
[0122] 在包含10%血清的DMEM培養基中培養L6肌肉細胞之后，利用2%血清培養基進行 更換，并使L6細胞完全分化。將已完全分化的L6肌肉細胞的培養基更換為無血清DMEM培養 基來以0.2mg/ml水平將非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖處理1小時之后，去除處 理有非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的培養基，利用預加熱的37°CKRH緩沖液 (Krebs-Ringer Hepes 131^€61')清洗2次，來去除存在于培養基內的葡萄糖。以0.0411^[的濃 度將[3H]-2-脫氧葡萄糖（[3H]-2-d eoxyglucose)處理15分鐘之后，迅速去除包含[3H]-2-脫氧葡萄糖的K RH緩沖液，并添加冰冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)，從而停止反應。利用細胞溶 解緩沖液(Cell lysis buffer)破碎細胞之后，利用閃爍計數器(scintillation counter) 測定放射性(radioactivity)，來確認了根據海藻酸寡糖處理的葡萄糖運輸能力增加效果。
[0123] 如圖5a及圖5b中公開，確認如下：當處理非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡 糖時，與作為陽性對照組的胰島素(0.2μΜ)相比促進了類似的細胞內糖吸收。當以0.2mg/ml 的濃度處理非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖時，未發生糖吸收，由此確認在糖吸收 促進中，非還原性末端的雙鍵的形成是重要的，并確認如下：當一同處理在糖吸收中作為屬 于重要蛋白質的腺苷酸活化蛋白激酶的抑制劑的c. C(C ompound C，1 μΜ)和非還原性末端 的不飽和型甘露糖醛酸寡糖時，隨著糖吸收被抑制，非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸 寡糖通過腺苷酸活化蛋白激酶路徑促進了糖吸收。
[0124] 如圖6中公開，當處理非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖時，為了了解對與 糖吸收促進相關的運載體的表達產生影響的PAK、A kt及AS160的磷酸化增加，按濃度在肌 肉細胞中進行處理，來提取蛋白質之后，通過蛋白質印跡法進行確認，最終確認到非還原性 末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖以濃度依賴的方式增加。因此，預計如下：為了促進糖吸 收，非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖促進腺苷酸活化蛋白激酶路徑、PAK、Akt及 AS160的磷酸化，來對糖運載體(GLUT4,glucose transporter 4)的表達也產生影響。
[0125] 實施例5:非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的腸內菌落調節功效的確認
[0126] 為了確認非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的腸內菌落改善功效，利用了 作為肥胖動物模型的大鼠和作為高齡動物模型的小鼠。誘導肥胖的大鼠在(株）中心動物中 購買生后3周齡的雄性SD大鼠來適應3天之后，將飼養環境調節為20±2°C，將相對濕度調節 為50±10%，并將明暗周期調節為1天12小時，來將高脂飲食誘導10周，從而在實驗組中，針 對非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖以0.25mg/kg濃度且48小時周期實施腹腔給 藥，并進行實驗。作為高齡小鼠，在韓國基礎科學研究院購買生后1個月齡及17個月齡雄性 C57BL/6J，將飼養環境調節為20 ± 2°C，將相對濕度調節為50 ± 10%，并將明暗周期調節為1 天12小時，來將實驗實施10周，在實驗組中，在供給的水中以0.2mg/kg的濃度供給了非還原 性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖。實驗結束之后，收集實驗動物的內臟內容物，然后采集 200mg的內容物，從而利用土壤DNA提取試劑盒(Fast DNA?SPIN Kit for S oil kit)，來將 脫氧核糖核酸基于在試劑盒中公開的方法確保純的脫氧核糖核酸，并為了確認已提取的脫 氧核糖核酸的濃度和純度，利用分光光度計(nanodrop)進行測定之后，基于通過瓊脂糖凝 膠電泳提取的脫氧核糖核酸帶結果確認了脫氧核糖核酸濃度和純度。為了確認經分離的脫 氧核糖核酸內細菌的16S核糖體核糖核酸(rRNA)基因的擴增，利用與細菌特異性相結合的、 包含V1-V3高變區（hypervariable regio η)的27F正向引物（GAGTTTGATCMTGGCTCAG)和 518R反向引物(WTTACCGCGGCTGCTGG)，來在94°C溫度下，初期變性(den aturation)5分鐘， 在94 °C溫度下，初期變性30秒鐘，在55 °C溫度下，初期變性45秒鐘，在72 °C溫度下，以1分30 秒鐘反復30次來進行擴增，從而執行聚合酶鏈式反應之后，針對通過QIAquick凝膠提取試 劑盒(德國凱杰公司（Qiagen，Germany))純化的聚合酶鏈式反應產物，利用GS Junior鈦系 統(Titanium system)(德國羅氏公司(Roche，Germany))堿基序列分析儀進行了焦磷酸測 序(pyrosequencing)，在焦磷酸測序所需的方法和多個反應根據制備公司（羅氏公司）的手 冊在(株)韓國Chunlab研究所中進行。
[0127] 如圖7中公開，將非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖給藥的肥胖大鼠腸內 菌落的情況下，與對照組(肥胖誘導大鼠，高脂飲食(HFD，high fat diet))相比，屬于革蘭 氏陽性細菌(Firmicutes)的、作為抗肥胖指標菌株的羅斯氏菌屬及乳桿菌屬分別增加約 4%及2%，來發生菌落變化，并且，確認到屬于革蘭氏陰性細菌(Bacteroidetes)的梭狀芽 孢桿菌屬(Clostridium sp.)及瘤胃球菌屬(Ruminococcus s ρ·)菌株分別減小約1 %。
[0128] 如圖8中公開，通過PC0分析確認如下：在飲用攝取非還原性末端的不飽和型甘露 糖醛酸寡糖的高齡小鼠的情況下，與一個月齡的小鼠的腸內菌落類似，與17個月齡的小鼠 的腸內菌落有差異。并且，確認到形成了與非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖攝取 一個月齡類似的腸內菌落。
[0129] 如圖9中公開，確認如下:在飲用攝取非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的 17個月齡的高齡小鼠的情況下，與對照組（17個月齡小鼠）相比，革蘭氏陰性細菌 (1^1(^61'0丨(16七68)增加約22%，相對地，革蘭氏陽性細菌(？；[1'111；[01^68)減少22%，從而與1個 月齡小鼠的腸內菌落類似地發生變化。
[0130] 實施例6:非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的雌激素增減劑功能的確認
[0131] 在本研究中使用的17β_雌二醇從西格瑪（Sigma)公司（美國密蘇里州圣路易斯市 (St.Louis，M0，USA))購買使用，DMEM/F12(D ulbecco's modified Eagle's medium/F12)、 牛胎兒血清(Fetal bovine serum)、0pti-MEM培養基及青霉素-鏈霉素從美國紐約吉畢科 (Gib co，NY，USA)公司購買。磷酸鹽緩沖液從We 1GENE(韓國大邱(D aegu，Korea))公司購買 使用，細胞計數試劑盒（CCK-8)從日本東京同仁化學分子技術（Do jindo Molecular Technologies，Tokyo，Japa η)公司購買使用，RNeasy小型試劑盒從凱杰公司（QIAGEN) (Hide n，德國）購買使用，牛胰島素從美國圣地亞哥細胞應用（Cell Applic ations，San Diego，USA)公司購買使用，FuGENEHD從美國威斯康星州麥迪遜市普洛麥格（Promega， Madison，WI，USA)公司購買使用。
[0132] 在37°C溫度下，在包含10%的牛胎兒血清、青霉素-鏈霉素（100U/ml)及1%牛胰島 素的DMEM/F12培養基中，培養MCF-7細胞，來為了測定雌激素增減劑活性，確認了雌激素反 應元件-熒光素酶活性及早老素2、孕激素受體、組織蛋白酶D、過氧化物酶體增殖物激活受 體γ共激活因子、雌激素相關受體、GATA結合蛋白3及叉頭框蛋白A1表達量。
[0133] 針對非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖以0.1mg/ml濃度處理48小時之后， 為了確認雌激素反應元件-熒光素酶活性，針對pEGF P-Cl-ERa、3X ERE TATA luc及pRL-SV40利用FuGENE HD試劑在MCF-7細胞中進行轉染(transfect ion)之后熔解，來實施熒光素 酶分析，并根據GeneJET核糖核酸純化試劑盒方法提取核糖核酸之后，利用實時聚合酶鏈式 反應確認了早老素2、孕激素受體、組織蛋白酶D、過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因 子、雌激素相關受體、GATA結合蛋白3及叉頭框蛋白Α1的表達量。
[0134] 如圖10中公開，確認如下：當處理非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖時，與 非還原性末端的飽和型甘露糖醛酸寡糖不同，作為雌激素信號下部基因的早老素2的表達 與對照組相比增加約5倍，并且，當雌激素(Ε2，17β-雌二醇）和非還原性末端的不飽和型甘 露糖醛酸寡糖并行處理時，借助雌激素受體a(ERa，estrogen receptora)的雌激素反應元 件熒光素酶活性及早老素2、孕激素受體的表達增加，并減少組織蛋白酶D的表達，來使非還 原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖選擇性地調節雌激素受體a下部信號的基因的表達。
[0135] 如圖11中公開，確認如下：當處理非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖時，使 過氧化物酶體增殖物激活受體y共激活因子（PGC-la，peroxisome prol if era tor-activated receptor c coactivator-la) 及作為轉錄伴侶的雌激素相關受體 a 的表達增 加，并與雌激素受體a路徑一同作用來使GATA結合蛋白3(GATA binding protein 3)和叉頭 框蛋白A1的信使核糖核酸的表達增加，從而具有雌激素增減劑功效。
[0136] 實施例7:非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的抗肥胖、抗糖尿病及雌激素 敏感性增大機制示意圖
[0137] 在圖12中公開了非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖的抗肥胖、抗糖尿病及 雌激素敏感性增進機制的整體示意圖。
[0138] 如圖12中公開，綜合根據非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖處理的抗肥 胖、抗糖尿病及雌激素敏感性增大機制，最終，可確認如下：當處理非還原性末端的不飽和 型甘露糖醛酸寡糖時，通過腺苷酸活化蛋白激酶活性化增加過氧化物酶體增殖物激活受體 γ共激活因子的表達，并使作為過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子的轉錄伴侶的 ERRs(雌激素相關受體α、雌激素相關受體β、雌激素相關受體γ )活性化來促進脂肪酸β氧 化，從而具有抗肥胖效果。并且，據報道，肌肉內腺苷酸活化蛋白激酶隨著介導脂肪酸的合 成和分解，通過促進脂肪酸β氧化代謝的作用及PGC-1表達使線粒體相關多個基因表達增 加，期待如下:非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖通過腺苷酸活化蛋白激酶活性化， 還增加 PCG-la表達，從而通過線粒體基因的表達及數量的增加具有改善胰島素抵抗性的功 效。
[0139] 確認如下：非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為雌激素增減劑，當與雌 激素一同處理時，隨著通過雌激素受體α路徑來增加 G ΑΤΑ結合蛋白3及叉頭框蛋白A1的信 使核糖核酸表達，并增加雌激素相關受體α及過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子 的表達，非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖通過依賴于過氧化物酶體增殖物激活受 體γ共激活因子的雌激素受體α路徑活性化雌激素反應元件，來具有雌激素增減劑的功能。
[0140] 并且，確認如下：非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖在體內通過改善腸內 菌落來增加抗肥胖指標菌株(羅斯氏菌屬及乳桿菌屬），并減少作為肥胖指標菌株(梭狀芽 孢桿菌屬、瘤胃球菌屬），從而具有復合性的抗肥胖、抗糖尿病、腸內菌落改善及雌激素敏感 性增大功效。
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[0147] 以上，對本發明的特定部分進行了詳細說明，就本發明所屬技術領域的普通技術 人員來說，這種詳細說明只屬于優選實例，本發明的范圍并不局限于此，這是顯而易見的。 因此，本發明的實質性的范圍應根據所附的發明要求保護范圍和其的等同技術方案來定 義。
【主權項】
1. 一種非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖，其特征在于，將聚甘露糖醛酸作為 底物由海藻酸裂解酶分解的分子量為100~3000Da以下。2. 根據權利要求1所述的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖，其特征在于，上述 非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖包含1個至10個甘露糖醛酸或古洛糖醛酸。3. 根據權利要求1所述的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖，其特征在于，在上 述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖中，甘露糖醛酸與古洛糖醛酸之比為1.2~ 5.0:1〇4. 一種肥胖改善、預防或治療用組合物，其特征在于，包含上述權利要求1至3中任一項 所述的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分。5. 根據權利要求4所述的肥胖改善、預防或治療用組合物，其特征在于，上述非還原性 末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖減少腸內微生物菌株的生長。6. 根據權利要求5所述的肥胖改善、預防或治療用組合物，其特征在于，上述腸內微生 物菌株為選自由羅斯氏菌屬及乳桿菌屬組成的組中的菌株。7. 根據權利要求4所述的肥胖改善、預防或治療用組合物，其特征在于，上述肥胖改善、 預防或治療用組合物為肥胖預防或治療用藥劑學組合物、肥胖改善或預防用食品組合物或 功能性食品組合物。8. -種糖尿病改善、預防或治療用組合物，其特征在于，包含上述權利要求1至3中任一 項所述的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分。9. 根據權利要求8所述的糖尿病改善、預防或治療用組合物，其特征在于，上述非還原 性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖促進葡萄糖的吸收。10. 根據權利要求8所述的糖尿病改善、預防或治療用組合物，其特征在于，上述糖尿病 改善、預防或治療用組合物為糖尿病預防或治療用藥劑學組合物、糖尿病改善或預防用食 品組合物或功能性食品組合物。11. 一種腸道有益菌增進用益生菌，其特征在于，包含上述權利要求1至3中任一項所述 的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分。12. 根據權利要求11所述的腸道有益菌增進用益生菌，其特征在于，上述腸道有益菌為 選自由羅斯氏菌屬及乳桿菌屬組成的組中的腸道有益菌。13. 根據權利要求11所述的腸道有益菌增進用益生菌，其特征在于，上述腸道有益菌增 進用益生菌為藥劑學組合物、食品組合物或功能性食品組合物。14. 一種更年期綜合征改善、預防或治療用藥劑學組合物，其特征在于，包含上述權利 要求1至3中任一項所述的非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖作為有效成分。15. 根據權利要求14所述的更年期綜合征改善、預防或治療用藥劑學組合物，其特征在 于，上述更年期綜合征改善、預防或治療用藥劑學組合物還包含17β-雌二醇。16. 根據權利要求14所述的更年期綜合征改善、預防或治療用藥劑學組合物，其特征在 于，上述非還原性末端的不飽和型甘露糖醛酸寡糖呈現與17β-雌二醇的協同效應。17. 根據權利要求14所述的更年期綜合征改善、預防或治療用藥劑學組合物，其特征在 于，上述更年期綜合征改善、預防或治療用藥劑學組合物為更年期綜合征預防或治療用藥 劑學組合物、更年期綜合征改善或預防用食品組合物或功能性食品組合物。
【文檔編號】A61K31/702GK106008613SQ201610177823
【公開日】2016年10月12日
【申請日】2016年3月25日
【發明人】金斗云
【申請人】全南大學校產學協力團